煙草根際溶磷細菌的篩選鑒定及抑菌促生效果研究

劉春菊 杜傳印 梁子敬 張德珍 劉愛新 于金鳳

摘??要：為了獲得具有溶磷、抑菌作用的根際促生菌，分析其對烤煙的防病、促生效果，從濰坊煙區(qū)根際土壤中篩選出溶磷細菌，并進行recA基因鑒定，通過室內(nèi)、田間試驗研究其抑菌和促生效果。結(jié)果表明，從土壤中篩選到10株溶磷效果較好的菌株，其中菌株CT45-1溶磷、抑菌、促生效果較好，經(jīng)鑒定為新洋蔥伯克霍爾德氏菌（Burkholderia cenocepacia）;選用此菌株在溫室、田間試驗中單獨及與草酸青霉QM-10混合施用，均能提高烤煙對磷的吸收利用，改善烤煙農(nóng)藝性狀，提高煙葉產(chǎn)量和品質(zhì)，并在一定程度上提高煙株抗病能力。其中以二者混合施用效果更好，可進一步推廣應(yīng)用。

關(guān)鍵詞：溶磷細菌;混合菌劑;煙草生長;產(chǎn)量品質(zhì)

Screening and Identification of Phosphorus-solubilizing Bacteria in Tobacco Rhizosphere and Their Antibacterial and Growth-Promoting Effects

LIU Chunju¹， DU Chuanyin¹， LIANG Zijing¹， ZHANG Dezhen²， LIU Aixin^3*， YU Jinfeng^3*

（1. Shandong Weifang Tobacco Co.，?Ltd.，?Weifang， Shandong 261205， China; 2. Weifang University of Science and Technology， Weifang， Shandong 262700， China; 3. Shandong Agricultural University，?Taian， Shandong 271018， China）

Abstract：?In order to obtain the rhizosphere growth-promoting bacteria with the function of phosphorus solubilization and bacteriostasis， the bacteria strains were isolated?from the tobacco rhizosphere soil in Weifang， and identified by recA?genes?sequencing analysis. The bacteriostasis and growth promoting effect of the bacteria on tobacco were studied with pot and field experiments. The results showed that 10 strains of bacteria with?phosphorus solubilizing ability were isolated from the soil. The strain CT45-1， which was identified as Burkholderia cenocepaci?showed the best phosphate solubilizing， bacteriostatic and growth promoting effects. The pot and field experiments showed that， the application of CT45-1 individually or mixed with Penicillium oxalate?QM-10 could improve the utilization efficiency of phosphorus， improve the yield and quality of flue cured tobacco， and improve the disease resistance of tobacco to a certain extent. The mixed application of the two strains showed better effects， which could be further popularized and applied.

Keywords： phosphate-solubilizing bacteria;?the mixed microbial agents; tobacco growth; yield and quality

磷是植物必需的大量元素之一，土壤中磷含量約為0.05%，但只有0.01%可被植物利用^[1]，而施入土壤中的磷肥高達80%被固定為鈣、鐵和鋁磷酸鹽的形式^[2-3]，無法被植物吸收利用。

植物根際促生菌（PGPR）是存在于植物根際周圍的一類可促進植物生長、防治病害的有益細菌。具有溶磷能力的PGPR能將土壤中難溶磷轉(zhuǎn)化為可溶磷，供植物吸收利用^[1]。一些種類的PGPR既有溶磷能力，還有固氮、解鉀、產(chǎn)鐵載體、分泌吲哚乙酸、赤霉素等激素的能力，起到促進植物生長，提高植物抵抗不良環(huán)境能力，抑制某些植物病原菌的作用^[4-5]。

PGPR是微生物肥料主要菌群。近年來，PGPR篩選和微生物菌劑、肥料開發(fā)成為研究熱點，其中有關(guān)溶磷解鉀菌促進植株生長的研究較多^[6-8];利用不同功能的菌株組合、功能互補，篩選出具有不同功能的復(fù)合菌劑，是微生物菌劑應(yīng)用由單一型向復(fù)合菌劑發(fā)展的趨勢^[9-11]。本文在篩選出溶磷、抗病、促生效果較好菌劑的基礎(chǔ)上，選擇兼具溶磷、抑菌的多功能菌株，通過溫室和田間試驗研究不同菌株單一和復(fù)合施用對烤煙生長及煙葉產(chǎn)質(zhì)量的影響，為今后微生物肥料的研發(fā)和在烤煙上大面積推廣應(yīng)用提供依據(jù)。

1 ?材料與方法

1.1 ?試驗材料

供試細菌：2014年從山東濰坊諸城、高密、臨朐、安丘、昌樂等縣市煙草根際土壤樣品中篩選獲得，其中菌株CT45-1分離自濰坊昌樂縣鄌郚鎮(zhèn)煙田。

供試真菌：QM-10草酸青霉Penicillium oxalicum，該菌株于2014年從山東蓬萊地區(qū)的果樹根際土壤樣品中分離獲得，此菌株具有較好的溶磷效果^[12]。

供試病原菌：煙草黑脛病菌（P.?parasitica）YHJ-1由本實驗室保存，青枯勞爾氏菌（R.?solanacearum）Tbw由山東農(nóng)業(yè)大學(xué)李向東教授惠贈。

供試烤煙品種：NC55。

1.2 ?試驗方法

1.2.1 ?溶磷細菌的篩選、鑒定??采用平板稀釋法進行菌株分離，使用溶磷圈法檢測各菌株溶磷能力^[13]。用試劑盒提取各菌株基因組DNA，進行recA鑒定^[14]，選擇同源性較高、有代表性的序列用Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。參照文獻[13]的方法，測定各菌株溶磷活性。選取5株溶磷活性較好的菌株，用GLICKANANN等^[15]方法，測定菌株產(chǎn)生長素的能力。采用平板對峙法測定各菌株對煙草黑脛病菌和青枯病菌的抑菌效果。

1.2.2 ?室內(nèi)測定各菌劑溶磷促生作用??參照文獻[12]的方法，制作QM-10孢子懸浮液;使用室內(nèi)盆栽法測定CT45-1菌液和QM-10孢子懸浮液的溶磷作用，及對煙苗的促生效果。

試驗共設(shè)4個處理，每個處理設(shè)5次重復(fù)，其中T1：400?mg?Ca₃（PO₄）₂+CT45-1菌液10 mL+?QM-10孢子懸浮液5 mL;T2：400?mg?Ca₃（PO₄）₂+?CT45-1菌液10?mL;T3：400?mg?Ca₃（PO₄）₂+QM-10孢子懸浮液5 mL;CK：400?mg?Ca₃（PO₄）₂+10 mL無菌水。Ca₃（PO₄）₂按200?mg/kg的比例拌入磨細的土壤中混勻，按照2?kg/盆的量裝入花盆。

將生長一致的6片真葉煙苗移栽到花盆中，每盆栽煙苗1 棵，然后進行灌根接種，每15 d 接種一次，45 d 后收獲，并測定植株的鮮重、干重、株高，用鉬銻抗比色法測定植株全磷含量^[16]。

1.2.3 ?田間驗證 ?試驗于2017年在山東濰坊高密方市煙站煙農(nóng)朱秀霞煙田進行，面積0.67?hm²，地形平原，海拔60 m;土壤褐土，肥力中等，堿解氮203 mg/kg，有效磷22 mg/kg，有效鉀132 mg/kg，有機質(zhì)1.9 %，pH 5.42，前茬作物烤煙。

試驗共設(shè)4個處理，每個處理3次重復(fù)，其中B1：對照（CK）;B2：施用CT45-1與QM-10混合菌肥一次，兩種菌劑分別施用;B3：施用CT45-1一次;B4：施用QM-10一次。CT45-1菌劑施用量為450 L/hm²，菌體濃度10⁸cfu/mL，稀釋200倍左右施用;QM-10菌劑施用量675 L/hm²，孢子懸浮液濃度10⁸cfu/mL，稀釋200倍左右施用。移栽時兌水澆施，其他管理措施按濰坊市烤煙栽培技術(shù)標(biāo)準(zhǔn)進行。

在團棵期、旺長期和成熟期隨機選20株煙株，根據(jù)YC/T 142—2010煙草農(nóng)藝性狀調(diào)查測量方法進行調(diào)查。栽后30?d，檢測葉片總?cè)~綠素含量、葉片光合效率等，每處理10株煙苗。栽后30?d，采集各處理煙株根際土壤，根據(jù)GB/T 32720—2016土壤微生物呼吸的實驗室測定方法測定各處理土壤CO₂釋放量。

在烤煙生育期內(nèi)調(diào)查田間黑脛病、赤星病、病毒病等主要病害發(fā)生情況，并計算發(fā)病率。

烤煙采收后，使用密集式烤房，每處理單獨采收、編竿、烘烤、分級，分別計算產(chǎn)量、產(chǎn)值和上中等煙比例。每處理分別取C3F 3.0 kg，由農(nóng)業(yè)部煙草產(chǎn)業(yè)產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗測試中心進行煙葉化學(xué)成分和感官品質(zhì)評吸鑒定。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

采用Microsoft Excel 2013和SPSS數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析軟件進行分析，Duncans新復(fù)極差法進行顯著性差異比較（p<0.05）。

2 ?結(jié)??果

2.1 ?溶磷細菌篩選

從煙草根際土壤分離獲得菌株43株，使用NBRIP培養(yǎng)基復(fù)篩得到10株溶磷效果較好的菌株，菌株CT45-1產(chǎn)生的溶磷圈最大，直徑達到15.8 mm，其次為LL35-6，溶磷圈直徑為14.0 mm，D/d比值分別為2.11、2.33。部分菌株溶磷效果如圖1所示。

2.2??菌株分子鑒定

2.3 ?菌株溶磷能力定量分析

使用NBRIP培養(yǎng)液測定10株菌株溶磷能力。如圖3所示，在培養(yǎng)48 h后各菌株培養(yǎng)液中可溶性磷含量最高，其中7個菌株培養(yǎng)液中可溶性磷含量在250 mg/L以上，AJ68-1的溶磷能力最強，其次為GJ71-2和LL35-6。

2.4 ?菌株產(chǎn)IAA能力測定

選擇溶磷效果較好的5株菌株進行產(chǎn)IAA活性

測定，發(fā)現(xiàn)這5株菌株都有產(chǎn)IAA能力（表1），且均在24 h時產(chǎn)IAA水平最高，其中菌株AJ68-1的IAA產(chǎn)量最高;表明以上菌株可能通過分泌IAA，促進植物生長發(fā)育。

2.5??菌株對兩種病原菌的拮抗作用

選取部分菌株測定對煙草黑脛病菌和青枯病菌的抑制作用，發(fā)現(xiàn)大部分菌株對這2種病原菌均有拮抗作用;菌株CT45-1、LY22-4、LL35-6等13株菌株對2種煙草病原菌的拮抗作用較明顯，其中CT45-1對2種病原菌的抑菌圈（或抑菌帶）半徑均在10 mm以上（圖4）。

2.6??室內(nèi)測定各菌劑溶磷促生作用

2.6.1 ?對煙草吸收磷能力影響??如圖5所示，T1處理植株全磷含量最高，達到78.06?mg/g;其次是 T2處理，為69.13?mg/g;然后是T3處理，為63.84?mg/g;對照中植株全磷含量最低，只有53.26?mg/g;與對照相比，3個處理植株全磷含量分別提高46.56%、29.80%、19.86%，對應(yīng)土壤有效磷含量分別為258.10、245.93、243.02?mg/kg，而對照土壤有效磷含量僅為202.15 mg/kg，說明菌劑的施用提高了土壤中有效磷含量，促進了煙草根系對磷的吸收。

2.6.2 ?對煙株生長的影響 ?由表2可知，與對照相比，T1和T2煙株平均株高、地上部和地下部鮮質(zhì)量均顯著增加，其中處理T1這3項指標(biāo)增幅最大，分別為21.23%、41.24%和28.79%。說明T1和T2這兩種菌劑施用方式，具有促進煙株生長的效果，其中以T1處理對盆栽煙草的促生效果較好。

2.7??田間試驗結(jié)果

2.7.1 ?各處理對烤煙農(nóng)藝性狀影響??團棵期各處理農(nóng)藝性狀無明顯差異;旺長期和成熟期，各處理烤煙農(nóng)藝性狀差異顯著（表3）。旺長期、成熟期各菌劑處理煙株農(nóng)藝性狀均優(yōu)于對照，其中以B2處理農(nóng)藝性狀最佳，葉片數(shù)最多，腰葉、頂葉葉面積最大;其次為B2、B3，對照B1表現(xiàn)最差，葉片數(shù)最少。

2.7.2 ?各處理對團棵期煙苗光合特性的影響??由表4可見，栽后30 d，各菌劑處理煙株葉片總?cè)~綠素含量與對照相比增加顯著，其中以B2最高，B3、B4次之;各菌劑處理煙苗葉片光合速率P_n，蒸騰速率T_r及氣孔導(dǎo)度G_s均明顯高于對照，其中B2光合速率和氣孔導(dǎo)度分別為6.6??mol/（m²·s）和268.3

2.7.3 ?CO₂釋放量??CO₂釋放量能夠反映土壤微生物總量。如圖6所示，各處理在團棵期不同時間段，其CO₂釋放量均高于對照地塊土壤，說明各處理微生物總量明顯高于對照;其中B2處理微生物總量最高，其次是B4、B3，對照最低，說明施用微生物菌劑后改善了土壤微生態(tài)環(huán)境，尤其是B2處理后的土壤更適合于有益微生物繁殖，豐富了土壤微生物組成。

2.7.4 ?各處理烤煙發(fā)病情況??施用不同菌劑均可降低烤煙主要病害發(fā)病率（表5）。其中施用B2處理的烤煙發(fā)病率降低最明顯，說明B2菌劑的施用一定程度上提高了烤煙的抗病能力，減少了主要病害的發(fā)生。

2.7.5??各處理對煙葉化學(xué)成分的影響??如表6所示，各菌劑處理的煙葉還原糖、總糖和鉀均高于對照，尤其是B2處理的還原糖、總糖和鉀含量明顯高于對照，更接近于優(yōu)質(zhì)烤煙標(biāo)準(zhǔn)，說明各菌劑施用可能益于土壤環(huán)境改善，利于煙葉糖類物質(zhì)積累;B2處理的煙葉化學(xué)成分各項指標(biāo)均在較適宜范圍內(nèi)，且糖堿比、鉀氯比更趨協(xié)調(diào)。

2.7.6??各處理對煙葉評吸品質(zhì)影響??從表7?可看出，施用B2、B3菌劑的煙葉香氣質(zhì)、香氣量呈現(xiàn)升高趨勢，二者余味也表現(xiàn)出逐漸增加的趨勢。其中，以B2處理評吸的分值最高，說明施用B2后在一定程度上提高了煙葉感官質(zhì)量。

2.7.7 ?各處理對煙葉經(jīng)濟性狀的影響??從表8看出，施用不同菌劑后均可提高上等煙比例和均價，中部葉比例也明顯提升。其中，B2處理上等煙比例、均價最高，說明施用各菌劑后，提高了煙葉產(chǎn)值，有助于獲得較好的經(jīng)濟效益。

3 ?討??論

3.1??溶磷細菌在作物及煙草上的應(yīng)用

作為土壤中各種物質(zhì)轉(zhuǎn)化的參與者，微生物在有機質(zhì)礦化、植物營養(yǎng)轉(zhuǎn)化、抑制病原菌活性等方面起著不可替代的作用，一些PGPR可增加作物對磷酸鹽的攝取量，刺激植株生長，提高農(nóng)產(chǎn)品產(chǎn)量、改善其品質(zhì)^[17]。目前，已有研究報道溶磷細菌應(yīng)用效果。葉小梅等^[18]發(fā)現(xiàn)，接種土生克雷伯氏菌菌株102菌后，在馬肝土、潮土中均表現(xiàn)出較好的溶磷效果，且增加了黑麥草對磷的吸收能力，提高了植株體內(nèi)磷含量;劉虎等^[19]篩選出兼具溶磷和產(chǎn)生長素的陰溝腸桿菌JP6，并證明其在土壤中具有較好的溶磷作用;李衛(wèi)榮等^[20]發(fā)現(xiàn)，有些溶磷菌如惡臭假單胞菌和巨大芽胞桿菌，能促進煙草生長、提高根際土壤速效磷含量、改善煙葉品質(zhì)并提高煙葉產(chǎn)值。

很多具有溶磷功能的PGPR也兼具抗病效果。HARIPRASAD等^[21]篩選到的16株溶磷菌中有13株對番茄鐮刀菌枯萎病有顯著抗病效果;?；燮嫉?sup>[^22]發(fā)現(xiàn)，從小麥根際篩選出假單胞菌屬溶磷菌HP1218，對小麥赤霉病菌、小麥紋枯病菌、水稻紋枯病菌3 種病原菌均有拮抗能力。

本文中篩選到的43株菌株中，多數(shù)菌株都兼具促生和抑菌作用，表明這些菌株在促進作物生長和病害生物防治等方面有潛在應(yīng)用價值。

3.2 ?復(fù)合菌劑應(yīng)用效果

微生物肥料在煙草上研究和應(yīng)用較為廣泛，但仍存在肥料菌種和功能單一的問題^[23]，因此需要研究、開發(fā)多功能復(fù)合微生物肥料來滿足煙草生長過程中的需求^[24]。劉曉倩等^[25]發(fā)現(xiàn)，溶磷解鉀等生物菌肥的混合施用，使煙田產(chǎn)量、產(chǎn)值分別比對照提高6.1%和15.1%，促進了煙株生長發(fā)育，有效增加了土壤磷素、鉀素供應(yīng)的途徑，提升了煙田經(jīng)濟效益。王豹祥等^[26]從煙草根際土壤中篩選出具有抗病、促生、溶磷、固氮等能力的菌株制成復(fù)合菌肥，發(fā)現(xiàn)該菌肥使煙葉均價、產(chǎn)量和產(chǎn)值分別提高8.29%、7.53%和30.05%。本研究中將具有溶磷、促生、抑菌功能的細菌菌株，與具有溶磷、促生效果的青霉菌株制成復(fù)合菌劑施用于煙草，盆栽實驗中，施用此復(fù)合菌劑比施用單一菌劑的溶磷、促生效果更佳;其在大田試驗中也比施用單一菌劑一定程度上提高煙株抗病能力，改善煙葉品質(zhì)，提高產(chǎn)值。分析原因，首先，復(fù)合菌劑的施用可能豐富了煙草根際土壤微生物菌群多樣性，提高土壤酶活性^[25]，使土壤微生態(tài)環(huán)境更適于有益微生物在煙草根際的定殖、存活，使其更好地發(fā)揮溶磷、促生等功能，促進了煙草整個生育期的不同需要。其次，復(fù)合菌劑中CT45-1對煙草病害具有較好的抑制效果，加之有益微生物大量繁殖可在烤煙根際形成優(yōu)勢種群有效抑制病原微生物的生長^[27]，起到防治病害的作用。本文田間試驗中，施用復(fù)合菌劑能一定程度上降低烤煙黑脛病、赤星病、病毒病的發(fā)病率，這與謝雨歆等^[28]的研究結(jié)果一致。因此，研究具有不同功效的微生物菌株的相互關(guān)系和復(fù)合菌劑應(yīng)用效果，對于多功能生物菌肥開發(fā)和推廣具有重要意義。

3.3??應(yīng)用前景及研究方向

本文篩選的菌株，伯克霍爾德氏菌、假單胞菌、克雷伯氏菌、腸桿菌均有相對較好的溶磷作用，且這幾種菌兼具一定抑菌作用，較適合于菌肥生產(chǎn)。目前，前兩種菌劑已有推廣應(yīng)用，而陰溝腸桿菌和克雷伯氏菌則僅見于研究報道和小面積推廣應(yīng)用，今后應(yīng)研究避免其與拮抗菌同時施用，同時應(yīng)做毒理學(xué)試驗確認其生物安全性。在生產(chǎn)應(yīng)用中各菌劑施用時間、比例及施用次數(shù)等問題再進行研究，可能會獲得更好的促生與防控效果。且本文中各菌劑采用的是液體菌劑，并未結(jié)合載體，有必要進行最優(yōu)載體篩選，結(jié)合諸如玉米秸稈、煙稈一類的農(nóng)業(yè)廢棄物，在生產(chǎn)菌肥的同時又能保護環(huán)境，實現(xiàn)煙葉生產(chǎn)可持續(xù)發(fā)展。

4 ?結(jié)??論

分離、鑒定得到伯克霍爾德氏菌Burkholderia、假單胞菌Pseudomonas、克雷伯氏菌Klebsiella、腸桿菌Enterobacter等43株具有溶磷能力的菌株;溶磷定量分析、抑菌活性及產(chǎn)IAA能力測定表明，菌株CT45-1的溶磷、抑菌、促生效果較好;盆栽結(jié)果顯示，與對照相比，菌株CT45-1單菌株與青霉菌株QM-10處理煙苗后均表現(xiàn)出一定的溶磷、促生效果，且復(fù)合菌劑T1的溶磷、促生效果更優(yōu);田間試驗結(jié)果表明，相比對照，各處理均能改善烤煙農(nóng)藝性狀，提高煙葉中總糖、還原糖及鉀的含量，尤其是復(fù)合菌劑B2的施用對促進烤煙生長、提高煙株抗病能力及提升煙葉品質(zhì)方面效果更佳，具有在烤煙上大面積推廣應(yīng)用的潛力。

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