煙草DGAT基因家族全基因組鑒定與分析

牛永志 王國平 鄭昀曄 馬文廣

摘 要：二酰甘油?；D移酶（DGAT）是三酰甘油合成的關鍵酶和唯一限速酶。在煙草中鑒定DGAT 基因對于研究油脂代謝途徑和創(chuàng)造具有附加值的新型油料作物具有重要意義。本研究從煙草基因組鑒定DGAT 家族基因，并對序列特性、基因結構、亞細胞定位、進化模式、表達模式等進行分析。結果表明，共獲得25 個煙草DGAT 家族蛋白，其平均氨基酸長度為485，大部分為堿性蛋白和親水性蛋白，有13 個DGAT 蛋白定位到8 條連鎖群上;有16 個蛋白定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，6 個定位葉綠體，3 個定位到胞外;煙草DGAT 蛋白包含典型的WS_DGAT 結構域和LPLAT 結構域;系統(tǒng)發(fā)育樹將DGAT 家族分為DGAT1、DGAT2、DGAT3 和WSD 等4 個類群，但煙草DGAT 僅劃分到DGAT2 和WSD 兩個類群;不同煙草DGAT基因的時空表達特性有所差異，并表現(xiàn)出一定的組織特異性，主要集中在衰老葉片和花器官中大量表達。

關鍵詞：基因家族;DGAT;煙草;生物信息

植物油脂不僅可作為細胞膜組成的脂肪酸供體，還可以以三酰甘油（Triacylglycerol，TAG）的形式存貯，作為真核生物主要的能量來源，對植物生長發(fā)育具有重要作用[1]。同時，植物油含有豐富的不飽和脂肪酸，是人類健康飲食的重要物質(zhì)。植物油脂經(jīng)甲基化處理后也可作為一種可再生生物柴油，在替代石油燃料方面具有潛在價值[2]。因此，了解油脂的生物合成也將有助于創(chuàng)造具有附加值的新型油料作物。

三酰甘油是油脂貯藏的一種主要形式。雖然在不同的器官和組織中，三酰甘油的生物合成存在多種途徑[3]，但最經(jīng)典的還是三磷酸甘油途徑（Kennedy途徑）[4]。在該途徑中，二酰甘油酰基轉移酶（Diacylglycerol acyltransferase， DGAT）催化最后一步反應，將二酰甘油轉化為三酰甘油，是影響三酰甘油含量的關鍵酶，也是唯一的限速酶[5]。目前，DGAT 基因家族共發(fā)現(xiàn)4 種亞型，分別為DGAT1、DGAT2、DGAT3 和WS/DGAT。其中DGAT1、DGAT2 是主要亞型，在大多數(shù)真核生物中廣泛存在。DGAT1 已經(jīng)在旱金蓮[6]、蓖麻[7]、玉米[8]、芝麻[9]、油菜[10]等作物中被鑒定，DGAT2 已經(jīng)在蓖麻[11]、油桐[12]、油菜[10]、橄欖[13]等作物中被鑒定。研究表明DGAT1 和DGAT2 在真核生物進化過程中是獨立進化的，并且其功能趨于同質(zhì)化[14]。DGAT3 和WS/DGAT 是近幾年發(fā)現(xiàn)的亞型，只在很少的作物中被報道。其中DGAT3 是一種可溶性酶，在花生[15]和擬南芥[16]等作物中被鑒定。WS/DGAT 是一種雙功能酶，其主要功能是催化蠟酯的合成，同時也參與少量TAG 的合成[17-18]。與DGAT1 和DGAT2 一樣，DGAT3 和WS/DGAT 似乎也是獨立進化的[19]。

煙草是一種葉用經(jīng)濟作物，但其種子油含量高，總體上占到種子重量的33.6%～39.4%，有的甚至可以達到48%[20]。而且煙籽油營養(yǎng)價值高，不飽和脂肪酸含量高于橄欖油、茶籽油、大豆油、玉米油、芝麻油、亞麻油等，僅次于核桃油[21-22]，可以作為一種潛在的食用油。此外，煙草種子油經(jīng)過酯交換反應后也可用于可再生生物燃油[23]。目前，煙草中的一個DGAT 基因已經(jīng)被鑒定[24]，但還有很多基因功能尚待解析。本研究利用生物信息學方法對煙草DGAT 基因家族進行系統(tǒng)分析，為深入研究油脂代謝途徑以及培育高油含量煙草新品種奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 DGAT 基因家族序列鑒定與特征分析

本研究從茄科數(shù)據(jù)庫（https：//solgenomics.net/）下載普通煙草品種K326 的基因組數(shù)據(jù)（2017 年發(fā)布，包括GFF 文件、蛋白序列文件和核酸序列文件）。通過兩種方式獲得煙草DGAT 家族基因，一種是從Pfam 數(shù)據(jù)庫（http：//pfam.xfam.org/）下載DGAT 基因家族的HMM模型文件（PF03982），利用HMMER3.0 軟件檢索煙草基因組數(shù)據(jù)，E 值設為1e-5;另一種是以擬南芥的DGAT1（At2g19450）、DGAT2（At3g51520）、DGAT3（At1g48300）和WSD1（At5g37300）為參考序列，通過HMMER 3.0 軟件構建HMM 模型，然后利用該模型檢索煙草基因組數(shù)據(jù)，E 值設為1e-5。將兩種方式獲得的基因去除重復后，即為初始的煙草DGAT 家族基因。然后將初始基因上傳至Pfam 網(wǎng)站進行結構域預測，E 值設為1e-5，剔除不含DGAT 家族典型蛋白結構域的序列，剩余的即為煙草DGAT 基因家族成員。

利用ExPaSy 網(wǎng)站（https：//www.expasy.org/）的ProtParam 工具分析蛋白的氨基酸含量、分子量、等電點、脂肪族氨基酸指數(shù)和疏水性指數(shù)等理化性質(zhì)。從GFF 文件中提取基因的染色體位置。

1.2 亞細胞定位及跨膜區(qū)預測

利用在線網(wǎng)站Softberry（http：//linux1.softberry.com/）的ProtComp 工具進行亞細胞定位預測。利用在線工具TMHMM 2.0（www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/）進行跨膜區(qū)預測。

1.3 進化樹構建

從Uniprot 數(shù)據(jù)庫（https：//www.uniprot.org）分別下載擬南芥、大豆、油菜、水稻的部分DGAT 基因（表1）。利用MEGA 軟件進行多序列比對（采用ClustalW 比對方式，默認參數(shù)），并構建NJ 樹（檢驗方法為Bootstrap 法，檢驗次數(shù)設為1000 次，gap處理選擇Pairwise Deletion）。利用在線網(wǎng)站iTOL（https：//itol.embl.de/）對進化樹進行可視化。

1.4 蛋白結構域及基因結構分析

利用在線網(wǎng)站MEME（http：//meme-suite.org/）進行保守結構域的預測，Motif 長度范圍為6～100，檢索的最大Motif 數(shù)為10，其他選擇默認參數(shù)。利用在線網(wǎng)站EvolView（https：//www.evolgenius.info/evolview/#login）對蛋白結構域進行可視化。利用NCBI 的CDD 工具（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd/？term=）鑒定結構域的類型。利用TBtools 軟件對基因結構進行可視化。

1.5 表達模式分析

煙草基因表達圖譜（TobEA）由EDWARDS 等于2010 年發(fā)布，該圖譜包含了早期衰老葉、中早期衰老葉、中后期衰老葉、后期衰老葉、成熟葉、莖生葉、幼葉、上部莖、下部莖、成熟根、幼根、種子、未開花蕾、開放花蕾、花朵、幼芽、莖頂端、子葉和花頂端19 個樣品組織，貫穿從種子萌發(fā)到植株衰老的整個生命周期。從EMBL-EBI 網(wǎng)站下載TobEA數(shù)據(jù)，登錄號為E-MTAB-176（http：//www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-MTAB-176/），通過blastp 比對檢索DGAT 家族成員匹配的樣品編號，通過樣品編號獲取對應的基因表達譜數(shù)據(jù)。將數(shù)據(jù)整理后利用Cluster 3.0 軟件和Java TreeView 工具繪制熱圖。

2 結 果

2.1 不同物種DGAT 家族基因統(tǒng)計

根據(jù)以往研究報道[25-26]，DGAT 基因家族已在14 種被子植物中得到鑒定（表2）。除了向日葵中沒有鑒定到DGAT2 和DGAT3 基因，其他物種中的DGAT 家族均包含4 種類型，其中數(shù)量較多的是花生（46 個）、油菜（35 個）和大豆（28 個）。整體上看，雙子葉植物比單子葉植物的DGAT數(shù)量更多，WSD 亞型的基因數(shù)量比其他亞型更多。本研究中共鑒定得到煙草DGAT 家族基因25 個，數(shù)量僅次于大豆，其中包含17 個WSD 基因和8 個DGAT基因。

2.2 煙草DGAT 基因特征分析

分析DGAT 家族基因的序列特征發(fā)現(xiàn)（表3），平均氨基酸長度為485，范圍在213～724 之間;平均分子量為54521.81 kDa ， 范圍在23855.26～81470.47 kDa 之間;平均等電點為8.34，范圍在6.05～9.42 之間，其中酸性蛋白（等電點小于7）有4 個，堿性蛋白（等電點大于7）有21 個，大部分的蛋白質(zhì)呈堿性;平均脂肪族氨基酸指數(shù)為95.52，范圍在85.54～105.96 之間;平均疏水性指數(shù)為-0.13，范圍在-0.39～0.26 之間，除了NtDGAT1 和NtDGAT2 表現(xiàn)為疏水性，其余全部表現(xiàn)為親水性，NtDGAT1 和NtDGAT2 可能參與了細胞膜的組成。

染色體定位分析顯示（表3），有13 個煙草DGAT 基因定位到8 條連鎖群上，其中19 號連鎖群含有最多的4 個基因，13 和17 號連鎖群分別含有2 個基因，2、3、6、21 和23 號連鎖群上分別含有1 個基因。其余12 個DGAT 基因分別定位到不同的Scaffold 上。

2.3 亞細胞定位分析與跨膜區(qū)預測

亞細胞定位分析顯示（表3），有16 個基因（NtDGAT1、NtDGAT2 以及NtWSD1～NtWSD14）定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，有6 個（NtDGAT3～NtDGAT8）定位到葉綠體，有3 個（NtWSD15～NtWSD17）定位到胞外。以往研究表明DGAT1 和DGAT2 亞型蛋白是一種膜結合蛋白，而且主要在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，WSD亞型蛋白表現(xiàn)出多樣性，一些是可溶性蛋白，其余是膜結合蛋白[27]。水溶性蛋白可能定位于胞外，而膜結合蛋白可能定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或葉綠體，這與本研究結果一致?？缒^(qū)預測結果顯示，NtDGAT1 和NtDGAT2 分別包含2 個跨膜區(qū)，NtWSD5、NtWSD7、NtWSD11 和NtWSD12 分別包含1 個跨膜區(qū)，其余蛋白沒有檢測到跨膜區(qū)。結合疏水性指數(shù)、亞細胞定位和跨膜區(qū)預測結果，說明NtDGAT1 和NtDGAT2是一種膜蛋白。

2.4 進化分析

選取水稻（7 個）、擬南芥（4 個）、油菜（11個）和大豆（13 個）的DGAT 家族基因（表1），與本研究鑒定的25 個煙草DGAT 家族基因一同構建進化樹。結果顯示（圖1），整個進化樹分為DGAT1、DGAT2、DGAT3 和WSD 4 個類群，但是煙草DGAT基因僅劃分到DGAT2 和WSD 兩個類群，其中NtDGAT1～NtDGAT8 劃分到DGAT2 類群中，NtWSD1～NtWSD17 劃分到WSD 類群中，煙草中未發(fā)現(xiàn)DGAT1 和DGAT3 亞型基因。大部分的煙草基因是聚在一起的，其中NtDGAT3～NtDGAT8 基因聚在一簇，NtWSD1～NtWSD13 基因聚在一簇，共形成了10 個姊妹系，這說明煙草中存在大量冗余基因，可能是在進化過程中發(fā)生了基因復制。不同的是，煙草NtDGAT1 和NtDGAT2 基因與大豆的GmDGAT2a 、GmDGAT2b 、GmDGAT2d 和GmDGAT2e 單獨聚在一起， 煙草NtWSD15～NtWSD17 與大豆GmWSD1～GmWSD3 單獨聚在一起，它們的功能可能更相似。而且亞細胞定位結果也顯示，這些基因與其他基因的定位結果不同，這也進一步說明了這些基因的特殊性。從進化時間上看，各類群中均分布有水稻、擬南芥、油菜和大豆基因，這說明DGAT 家族基因的分化時間可能早于物種的分化時間。從親緣性上看，油菜、擬南芥、大豆和煙草之間的親緣關系更近，水稻與他們的親緣關系較遠，因為水稻屬于單子葉植物，而其他屬于雙子葉植物。此外，DGAT1 和DGAT2亞型聚在一簇，其親緣關系較近，而DGAT3 和WSD亞型分別聚成一簇，與DGAT1 和DGAT2 亞型親緣關系較遠，這與以往研究結果一致。

2.5 蛋白結構域與基因結構分析

由于WSD 亞型的主要功能是參與蠟酯的合成，其次參與少量TAG 的合成，與DGAT1、DGAT2 和DGAT3 亞型在功能和結構上差異較大，所以，本研究單獨分析了WSD 亞型的蛋白結構域。結果顯示（圖2a），WSD 亞型蛋白檢測到2 個WS_DGAT 結構域（motif1 和motif2），除了NtWSD13 缺失了motif2 和NtWSD14 缺失了motif1 外，其余的WSD基因都包含了2 個WS_DGAT 結構域（motif1 和motif2）。另外，也檢測到4 個功能未知的結構域DUF1298（motif4、motif5、motif9 和motif10）。DGAT亞型蛋白檢測到3 個LPLAT（LysophospholipidAcyltransferases）結構域（motif11、motif16、motif20）和一個Hydrolase_4 結構域（motif14）。其中，LPLAT是一個溶血磷脂?；D移酶超基因家族，催化甘油磷脂的合成。LPLAT 包含了GPAT、AGPAT、MGAT、LPEAT、LPCAT、DHAPAT、TAZ 等眾多成員。Hydrolase_4 是一個水解酶家族。NtDGAT1 和NtDGAT2 檢測到所有的3 個LPLAT 結構域，其余的僅檢測到2 個LPLAT 結構域（motif11 和motif16）。除了NtDGAT1、NtDGAT2 和NtDGAT4 外，其余均檢測到Hydrolase_4 結構域。

基因結構分析結果顯示（圖2b），聚成一簇的基因結構相似，WSD 亞型基因序列平均外顯子數(shù)目為6.24 個，范圍為2～8 個，DGAT 亞型基因序列平均外顯子數(shù)目為11.25 個，范圍為5～14 個。WSD亞型基因外顯子數(shù)目相對較少，基因序列相對較短。這在一定程度上也反映了基因的進化關系。

2.6 基因表達分析

基因表達分析結果顯示（圖3），不同基因的表達模式有所差異，并表現(xiàn)出一定的組織特異性。基因NtDGAT1～NtDGAT8 的表達模式類似，在未開放花蕾、已開放花蕾、花頂端和花等花器官以及莖生葉中的表達量均較低，在早期、早中期、中后期、后期衰老葉、成熟葉等葉片以及幼芽中的表達量均較高，在種子、幼葉、子葉、莖尖等幼嫩組織以及上部莖中的表達量中等。但其中基因NtDGAT1、NtDGAT2、NtDGAT3 和NtDGAT5 在下部莖、成熟根、幼根中的表達量較高，而基因NtDGAT4、NtDGAT6、NtDGAT7 和NtDGAT8 在這些組織中的表達量中等?；騈tWSD13、NtWSD14 和NtWSD15除了在種子、幼葉和莖尖的表達量較低外，在其余組織中的表達情況與NtDGAT1 、NtDGAT2 、NtDGAT3 和NtDGAT5 的表達模式基本一致。基因NtWSD16 和NtWSD17 在幼芽、子葉、幼葉和莖端的表達量較高，在花和幼根中的表達量較低，在其余組織中的表達量趨于中等。基因NtWSD1～NtWSD12 的表達模式相似，并且與基因NtDGAT1～NtDGAT8 的表達模式相反，在未開放花蕾、已開放花蕾、花頂端和花等花器官以及莖生葉中的表達量均較高，在早期、早中期、中后期、后期衰老葉、成熟葉以及幼芽中的表達量均較低，在種子、幼葉、子葉、莖尖等幼嫩組織以及上部莖中的表達量中等。總體來看，DGAT 家族基因主要集中在衰老葉片和花器官中大量表達。

3 討 論

植物DGAT基因對控制油脂的合成具有重要作用。目前，雖然在一些植物中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了不同的DGAT 基因，但尚未得到全面的解釋，因此，關于植物中TAG 合成的基因還需要更深入的研究。利用生物信息學方法鑒定DGAT 基因家族，并對其序列特性、基因結構、亞細胞定位、進化模式和表達模式等進行系統(tǒng)分析，對于更好地理解它們在TAG生物合成中的作用至關重要。

在物種進化過程中，發(fā)生過多次的基因復制和全基因組復制事件，這也助推了基因和物種的進化和多樣化[28-29]。本研究共鑒定到煙草DGAT 家族基因25 個，數(shù)量僅次于花生（46 個）、油菜（35 個）和大豆（28 個）。油菜、花生和煙草都是異源四倍體，大豆是由古四倍體演變而來的二倍體，這些作物含有較多的基因數(shù)，很可能是由于在進化過程中發(fā)生全基因組復制所致。

DGAT 家族的亞細胞定位存在差異，亞型DGAT1 和亞型DGAT2 大多定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，但是其位置并不重疊，桐樹的DGAT1 和DGAT2 定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的不同點狀區(qū)域，功能也沒有發(fā)生冗佘[12]。大豆DGAT2a 主要定位在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜和油體膜上，菠菜葉中DGAT1 主要定位在葉綠體中[30]，而亞型DGAT3 是一種可溶性蛋白，存在于細胞質(zhì)中[15]。亞型WSD 蛋白表現(xiàn)出多樣性，一些是可溶性蛋白，其余是膜結合蛋白[27]。本研究中，NtDGAT1 和NtDGAT2 定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，NtDGAT3～NtDGAT8 定位到葉綠體上，它們可能屬于膜蛋白，只是大部分定位到葉綠體而非內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，這與以往結果有所差異。此外，大部分WSD 蛋白（NtWSD1～NtWSD14）定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，可能屬于膜結合蛋白，少量WSD蛋白（NtWSD15～NtWSD17）定位到胞外，可能屬于可溶性蛋白，這與以往報道一致。結合疏水性指數(shù)、亞細胞定位和跨膜區(qū)預測3 個結果，可以確定NtDGAT1 和NtDGAT2 是一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜結合蛋白。

進化分析結果顯示，DGAT1、DGAT2、DGAT3和WSD 亞型分別單獨聚成一簇，這說明DGAT 家族基因的分化早于物種分化時間，或者類似于DGAT1 和DGAT2，有獨立的起源[14]，這與以往研究結果一致[19]。研究報道，DGAT1 和DGAT2 與DGAT3 和WS/DGAT 相似性較低[14，19]。而本研究中也表現(xiàn)出相似的結果，DGAT1 和DGAT2 亞型聚在一簇，其親緣關系較近，而DGAT3 和WSD 亞型分別聚成一簇，與DGAT1 和DGAT2 亞型親緣關系較遠。

DGAT 基因主要參與了油脂的積累，還參與植物種子萌發(fā)、幼苗發(fā)育和葉片衰老等生物過程中的脂類的代謝，因此，DGAT 基因應該在種子、花朵、葉片等眾多組織中都有表達，但表達水平具有組織特異性。研究表明，旱金蓮DGAT1 只在發(fā)育的種子中表達[6]。蓮座DGAT1 基因的表達量隨著葉片的衰老不斷提高[31]。桐樹的DGAT1 在各器官中的表達水平幾乎沒有差異，但DGAT2 在發(fā)育的種子中表達量極高[12]。擬南芥DGAT3 在胚根、花粉、衰老葉、葉原基、木質(zhì)部的表達量較高，WSD 在花序、花、雌蕊、柱頭、子房和花梗的表達量較高。煙草DGAT 家族基因表現(xiàn)出時空特異性表達。NtDGAT1～NtDGAT8 以及NtWSD13～NtWSD15 在不同時期的衰老葉片中表達量較高，在不同的花器官中表達量較低，這些基因可能主要參與了葉片脂類的合成。而NtWSD1～NtWSD12 的表達情況與此相反，他們可能主要參與了種子油脂的合成。

4 結 論

本研究從煙草基因組鑒定得到25 個DGAT 家族基因;其平均氨基酸長度為485，大部分為堿性蛋白和親水性蛋白，有13 個DGAT 蛋白定位到8條連鎖群上;有16 個蛋白定位到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，6 個定位到葉綠體，3 個定位到胞外;煙草DGAT 蛋白包含典型的WS_DGAT 結構域和LPLAT 結構域;系統(tǒng)發(fā)育樹將DGAT 家族分為DGAT1、DGAT2、DGAT3和WSD 4 個類群，但煙草DGAT 僅劃分到DGAT2和WSD 兩個類群;不同煙草DGAT 基因的時空表達特性有所差異，并表現(xiàn)出一定的組織特異性，主要集中在衰老葉片和花器官中大量表達。

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