子宮頸癌ADAM12檢測及臨床預(yù)后分析

白 璐 李雯慧 陳必良

子宮頸癌(cervical cancer)在全球婦科惡性腫瘤發(fā)生率中位居第3位，據(jù)統(tǒng)計全球每年新增病例50萬例，每年病死患者26萬例[1]。子宮頸癌在發(fā)展中國家發(fā)生率更高，是女性腫瘤性疾病死亡的主要婦科疾病。病毒感染、基因突變及環(huán)境因素是導(dǎo)致子宮頸癌發(fā)生、發(fā)展的重要因素[2～5]。從宮頸上皮內(nèi)瘤樣病變發(fā)展為子宮頸病灶，進(jìn)而形成子宮頸腫瘤，該過程主要是由人乳頭狀瘤病毒(human papillomavirus, HPV)感染引發(fā)的[6,7]。目前，大量研究報道了與宮頸癌密切相關(guān)的原癌基因和抑癌基因，然而調(diào)節(jié)子宮頸癌病理變化的具體機(jī)制仍有待研究，且目前臨床上缺乏一種準(zhǔn)確、高效預(yù)測子宮頸癌患者臨床預(yù)后的標(biāo)志物[8～11]。

ADAM金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域12基因(ADAM metallopeptidase domain 12, ADAM12)編碼了ADAM12蛋白，該蛋白是去整合素和金屬蛋白酶家族成員[12]。由于mRNA的不同拼接導(dǎo)致人機(jī)體中存在兩類ADAM12(又稱解鏈蛋白酶α)，分別為長跨膜型(ADAM12-L)和截斷分泌型(ADAM12-S)，與前者比較后者缺失了跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。ADAM12-L和ADAM12-S經(jīng)過酶解作用，成熟的蛋白會分別轉(zhuǎn)移到細(xì)胞膜和胞外[13]。

ADAM12作為預(yù)后標(biāo)志物是因為其主要在病理情況下才激活表達(dá)，而在正常組織中通常是嚴(yán)格的表達(dá)限制狀態(tài)[14]。除了在人的胎盤組織及在胚胎發(fā)育成肌肉和骨組織過程中瞬時表達(dá)升高外，在后天生長的健康機(jī)體和非損失器官中ADAM12表達(dá)均處于較低狀態(tài)[15]。研究表明，ADAM12在人類多種腫瘤組織中表達(dá)增加，例如胃癌、前列腺癌、肺癌、腦癌、骨癌、肝癌及乳腺癌等[16～22]。然而，ADAM12在子宮頸癌中的表達(dá)情況尚未見詳細(xì)報道，本研究通過檢測和比較子宮頸癌患者腫瘤組織及癌旁組織中ADAM12表達(dá)，驗證ADAM12能否作為該疾病的預(yù)后標(biāo)志物。

材料與方法

1.患者及樣品:本研究中使用的子宮頸癌組織、癌旁組織及尿液樣品(距離腫瘤組織≥3cm)樣品(各78例)均采集2008年1月～2012年1月筆者醫(yī)院婦科診治的子宮頸癌患者，所有患者均采用病理學(xué)方法進(jìn)行確診，收集同期80例在筆者醫(yī)院健康體檢的正常人群尿液樣品作為對照。采用國際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(International Federation of Gynecology and Obstetrics，F(xiàn)IGO)標(biāo)準(zhǔn)對子宮頸癌患者進(jìn)行臨床分期，詳見表1?；颊唠S訪時間為2～71個月，隨訪截至?xí)r間2018年2月。本研究獲得入組患者知情同意并通過筆者醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會審核。

2.RNA提取及定量PCR分析:采用GenEluteTM總RNA提取試劑盒(美國Sigma公司)提取組織總RNA，QuantiTect反轉(zhuǎn)錄試劑盒(美國Qiagen公司)合成cDNA。ADAM12定量PCR引物序列如下：上游引物: 5′- CGAGGGGTGAGCTTATGGAAC-3′；下游引物: 5′- GCTTTCCCGTTGTAGTCGAAT A-3′。將引物與SYBR Green預(yù)混Mix(美國Bio-Rad公司)混合，加入模板后進(jìn)行擴(kuò)增。選擇β-actin基因作為內(nèi)參，引物序列如下：上游引物: 5′-TGACGTGGACAT-CCGCAAAG -3′；下游引物: 5′-CTGGAAGGTGGACATCCGCAAAG -3′，在Thermo的7500型定量PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果采用2-ΔCT方法進(jìn)行比較，每個樣品重復(fù)3個復(fù)孔。

表1 ADAM12表達(dá)與子宮頸癌患者臨床病理學(xué)特征關(guān)系分析[n(%)]

3.酶聯(lián)免疫吸附測定尿液ADAM12含量:參照人ADAM12 ELISA定量檢測試劑盒(美國R&D公司)操作步驟檢測尿液樣品中ADAM12含量，簡要如下：向包被人特異性ADAM12單克隆抗體的酶標(biāo)板中100μl ADAM12標(biāo)準(zhǔn)品及待檢尿液，室溫孵育2h，每孔加入300μl PBST，反復(fù)洗滌3次，最后1次拍板清除殘留洗滌液，加入200μl 稀釋好的HRP標(biāo)記的ADAM12特異性抗體，再次室溫孵育40min，每孔加入300μl PBST，反復(fù)洗滌3次，加入100μl底物，避光反應(yīng)15min，最后加入50μl 2mol/L H2SO4終止反應(yīng)。采用酶標(biāo)儀(美國Bio-Rad公司)測定吸光度值A(chǔ)450，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算待檢樣品的ADAM12含量。根據(jù)健康人群尿液ADAM12含量(平均值+3倍SD值)作為尿液ADAM12是過表達(dá)的臨界值。

4.Western blot法檢測子宮頸癌組織及癌旁組織ADAM12表達(dá)：采用組織總蛋白提取試劑盒(美國Sigma-Aldrich公司)提取子宮頸癌組織和癌旁組織總蛋白，參考文獻(xiàn)[23]報道的方法進(jìn)行Western blot法檢測。制備10% SDS-PAGE凝膠后，將收集的樣品上樣，跑膠后轉(zhuǎn)膜，將膜放入10%脫脂奶中37℃封閉2h，加入一抗4℃孵育過夜。次日，采用TBST溶液洗滌4次，每次10min，然后將膜放入含HRP標(biāo)記二抗的TBST溶液中，室溫孵育1h。之后加入發(fā)光液進(jìn)行曝光。Western blot法檢測用的抗體為ADAM12單克隆抗體(美國Sigma-Aldrich公司)，采用β-actin蛋白作為內(nèi)參，β-actin一抗購自美國Sigma公司。

5.免疫組織化學(xué)檢測子宮頸癌組織及癌旁組織ADAM12表達(dá):制備組織石蠟切片，首先進(jìn)行抗原修復(fù)，采用0.01mol/L pH6.0的檸檬酸鹽緩沖液對切片進(jìn)行。隨后將切片放入稀釋后的鼠抗人ADAM12單克隆抗體(美國Sigma公司)中4℃孵育過夜，PBST洗滌3次，辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗室溫孵育40min，再次洗滌3次后加入DAB溶液進(jìn)行顯色后，白光拍照。參考文獻(xiàn)[23]報道方法根據(jù)染色強(qiáng)度進(jìn)行切片打分，切片評分是由兩位對患者臨床病理特征不了解的病理學(xué)專家獨立完成。具體標(biāo)準(zhǔn)如下：0分(陰性)，1分(弱陽性)，2分(中等)，3分(強(qiáng)陽性)。將陽性細(xì)胞比例分成5個區(qū)間，0分(0%)，1分(1%～25%)，2分(26%～50%)，3分(51%～75%)，4分(76%～100%)。切片的最終得分是上述兩個分?jǐn)?shù)相乘，總分在0～12分。為了評價ADAM12與子宮頸癌患者臨床病理學(xué)特征之間的相關(guān)性將ADAM12表達(dá)分成兩類：低表達(dá)(得分0～4分)，高表達(dá)(得分5～12分)。

結(jié) 果

1.ADAM12在子宮頸癌患者腫瘤組織中表達(dá)增加:采用定量PCR法檢測78例子宮頸癌患者腫瘤組織及癌旁組織中ADAM12 mRNA表達(dá)水平，結(jié)果表明，78例子宮頸癌組織中ADAM12相對表達(dá)水平為3.46±0.64，顯著高于癌旁組織(0.64±0.17,P=0.025，圖1A)。Western blot法檢測結(jié)果顯示，子宮頸癌組織中ADAM12表達(dá)顯著高于癌旁組織(圖1B)。

圖1 78對子宮頸癌組織及癌旁組織ADAM12表達(dá)水平檢測結(jié)果A.定量PCR法檢測ADAM12 mRNA表達(dá)水平；B. Western blot法檢測ADAM12蛋白表達(dá)水平

采用免疫組織化學(xué)染色檢測了78對子宮頸癌組織及癌旁組織樣品中ADAM12蛋白表達(dá)水平，在腫瘤組織和癌旁組織中均觀察到不同強(qiáng)度的蛋白表達(dá)(圖2)，然而與癌旁組織比較，子宮頸癌組織中ADAM12蛋白表達(dá)量更高。根據(jù)評分標(biāo)準(zhǔn)，78例宮頸癌樣品中55例(70.51%)為ADAM12高表達(dá)，而在癌旁組織中21例(26.92%)為ADAM12高表達(dá)(表2)。

圖2 子宮頸癌及癌旁組織免疫組織化學(xué)染色A.子宮頸癌組織(強(qiáng)陽性)；B. 子宮頸癌組織(中等)；C.子宮頸癌組織(弱陽性)；D.癌旁組織(弱陽性)；標(biāo)尺：100μm

表2 78對子宮頸癌及癌旁組織中ADAM12表達(dá)水平比較

2.ADAM12在子宮頸癌患者尿液中表達(dá)增加：采用ELISA方法檢測78例子宮頸癌患者尿液及80例健康人群尿液中分泌型ADAM12表達(dá)水平，結(jié)果表明子宮頸癌組ADAM12平均表達(dá)量為2.15±0.68ng/ml，健康人群尿液中ADAM12含量為0.84±0.35ng/ml，兩組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.033，圖3)。子宮頸癌組尿液ADAM12含量超平均水平(陽性)樣品27例(34.63%)，陰性樣品51例(65.38%)。

圖3 子宮頸癌患者及健康人群尿液分泌型ADAM12含量

3.子宮頸癌組織ADAM12表達(dá)與患者臨床特征分析:ADAM12表達(dá)與子宮頸癌患者臨床病理學(xué)特征分析結(jié)果提示ADAM12表達(dá)升高與患者腫瘤侵襲(P=0.014)、TNM分期(P=0.010)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(P=0.070)以及腫瘤分化(P=0.034)等因素密切相關(guān)(表1)。

4.子宮頸組織ADAM12表達(dá)與患者預(yù)后分析：生存分析結(jié)果表明，ADAM12高表達(dá)患者臨床預(yù)后不良，ADAM12高表達(dá)患者臨床中位生存期為29.5個月，低表達(dá)患者臨床中位生存期為49.4個月，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.003，圖4)。單因素分析結(jié)果表明，腫瘤侵襲(HR=3.633, 95% CI: 1.715～8.526,P=0.017)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(HR=4.731, 95% CI: 2.636～10.427,P=0.006)、TNM分期(HR=3.041, 95% CI: 1.557～7.062,P=0.027)、組織ADAM12表達(dá)(HR=6.466, 95% CI: 3.452～13.690,P=0.004)是影響子宮頸癌患者疾病預(yù)后的危險因素(表3)。多因素分析結(jié)果表明，子宮頸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(HR=3.646, 95% CI: 1.683～5.482,P=0.016)及組織ADAM12表達(dá)(HR=4.245, 95% CI: 2.614～6.735,P=0.007)是患者預(yù)后不良標(biāo)志物(表3)，而患者年齡、腫瘤直徑、HPV感染、腫瘤組織學(xué)類型、腫瘤侵襲、腫瘤分化、TNM分期不是影響患者疾病預(yù)后的危險因素。

圖4 ADAM12表達(dá)與子宮頸癌患者總生存期預(yù)后的Kaplan-Meier分析

表3 子宮頸癌患者總生存期單一和多重變量分析

討 論

ADAMs家族蛋白具有十分特別的胞外區(qū)結(jié)構(gòu)域，例如前導(dǎo)肽序列、金屬蛋白酶結(jié)構(gòu)域、表皮生長因子樣重復(fù)結(jié)構(gòu)域、解聚素結(jié)構(gòu)域、富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)域等[24,25]。ADAMs家族蛋白的不同結(jié)構(gòu)域發(fā)揮不同的生物學(xué)功能參與機(jī)體多種生物學(xué)途徑，其中ADAMs的蛋白酶活性及細(xì)胞因子和趨化因子的膜錨定分子的功能在腫瘤的發(fā)生過程中發(fā)揮重要作用。大量文獻(xiàn)研究證實，ADAM12表達(dá)水平升高與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。與正常小鼠比較，乳腺癌及前列腺癌小鼠模型ADAM12-/-小鼠的腫瘤生長和遷移均顯著降低[17, 23]。提示ADAM12是腫瘤發(fā)生中必須的。臨床研究證實，ADAM12可以作為腫瘤診斷和預(yù)后的標(biāo)志物[25]。例如，Western blot法檢測分析結(jié)果顯示，與健康人群比較,乳腺癌患者ADAM12腫瘤組織中表達(dá)顯著升高。除檢測乳腺癌組織中表達(dá)外，患者尿液中ADAM12水平與腫瘤分期及疾病進(jìn)展密切相關(guān)。

本研究顯示，子宮頸癌患者腫瘤組織中ADAM12表達(dá)水平均顯著高于癌旁組織，子宮頸癌患者尿液中ADAM12表達(dá)水平顯著高于健康人群。Kaplan-Meier生存分析結(jié)果表明ADAM12高表達(dá)患者臨床預(yù)后不良，ADAM12高表達(dá)患者臨床中位生存期顯著低于低表達(dá)患者(P=0.003)。單因素分析結(jié)果表明，腫瘤侵襲(HR=3.633, 95% CI: 1.715～8.526,P=0.017)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(HR=4.731, 95% CI: 2.636～10.427,P=0.006)、TNM分期(HR=3.041, 95% CI: 1.557～7.062,P=0.027)、組織ADAM12表達(dá)(HR=6.466, 95% CI: 3.452～13.690,P=0.004)是影響子宮頸癌患者疾病預(yù)后的危險因素。多因素分析結(jié)果表明，子宮頸癌患者淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(HR=3.646, 95% CI: 1.683～5.482,P=0.016)及組織ADAM12表達(dá)(HR=4.245, 95% CI: 2.614～6.735,P=0.007)是患者預(yù)后不良標(biāo)志物。此外，本研究顯示，子宮頸癌患者尿液中ADAM12含量顯著高于健康人群，然而統(tǒng)計單因素分析結(jié)果表明，尿液ADAM12水平不是子宮頸癌患者總生存期預(yù)后的獨立因素。

綜上所述，本研究結(jié)果證實ADAM12參與子宮頸癌的發(fā)生和發(fā)展，其在子宮頸癌組織中表達(dá)普遍上調(diào)。ADAM12表達(dá)是宮頸癌患者總生存期預(yù)后不良的重要因素，組織ADAM12表達(dá)可以作為子宮頸癌患者疾病預(yù)后獨立標(biāo)志物。