二乙碳酰氨嗪對(duì)野百合堿所致大鼠肺動(dòng)脈高壓的保護(hù)作用

范 麗 姚亞妮 李 瑜

肺動(dòng)脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是指非肌型動(dòng)脈肌層化，肺血管阻力進(jìn)行性增高，進(jìn)而引起右心力衰竭，導(dǎo)致患者死亡的心肺血管臨床綜合征[1，2]。凋亡是多種心血管疾病發(fā)生、發(fā)展的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，近期研究表明，肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞凋亡的減少是引發(fā)PAH肺血管重塑的關(guān)鍵事件之一，可造成細(xì)胞過(guò)度堆積從而引發(fā)肺血管壁增厚，導(dǎo)致血管內(nèi)徑減小和阻力增加[3，4]。

二乙碳酰氨嗪(diethylcarbamazine，DEC)作為一種哌嗪衍生物，被廣泛應(yīng)用于治療淋巴絲蟲(chóng)病，其作用機(jī)制尚未清楚。近年來(lái)多項(xiàng)研究報(bào)道DEC在多種肺部疾病模型中均表現(xiàn)出了優(yōu)秀的藥理活性，如嗜酸性粒細(xì)胞性肺炎、哮喘、卡拉膠急性肺損傷和急性肺炎等[5～8]。Queto等[6]研究指出，DEC通過(guò)CD95L/CD95信號(hào)通路抑制肺和骨髓中嗜酸性粒細(xì)胞的增多，實(shí)現(xiàn)對(duì)肺炎的保護(hù)作用。其中CD95L(FasL)是凋亡誘導(dǎo)受體CD95(Fas)的配體，該實(shí)驗(yàn)表明DEC可以充當(dāng)細(xì)胞凋亡誘導(dǎo)劑的作用。本研究旨在通過(guò)評(píng)價(jià)DEC對(duì)PAH大鼠模型的肺組織及肺血管功能學(xué)、形態(tài)學(xué)以及凋亡相關(guān)指標(biāo)的影響，來(lái)探討DEC對(duì)野百合堿誘導(dǎo)的大鼠PAH的治療作用及其作用機(jī)制。

材料與方法

1.材料：(1)試劑：野百合堿購(gòu)自美國(guó)Sigma公司?？笷ADD、caspase-8、Bax、Bcl-2和GAPDH等抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling Technology公司，HRP-IgG購(gòu)包美國(guó)Santa Cruz公司?？功?SMA單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Proteintech公司。生物素標(biāo)記的IgG二抗，ECL超敏發(fā)光試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。TUNEL試劑盒購(gòu)自美國(guó)Roche公司。DAB顯色試劑購(gòu)自索萊寶生物技術(shù)有限公司。(2)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物：SPF級(jí)雄性Sprague Dawley大鼠30只，5周齡，體質(zhì)量220～250g，由新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)合格證號(hào)：65000700000045。動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境SPF級(jí)，自由攝食水，日關(guān)燈控制12h交替照明，室溫保持在21±2℃，濕度60%～80%，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)過(guò)程嚴(yán)格遵照實(shí)驗(yàn)動(dòng)物護(hù)理和使用準(zhǔn)則(The Guidelines for the Care and Use of Laboratory Animals)[9]。

2.動(dòng)物分組及模型制備：大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，隨機(jī)分為正常組、模型組、DEC組。除正常組外的大鼠腹腔注射30mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，通過(guò)一次性腹腔注射60mg/kg野百合堿誘導(dǎo)肺動(dòng)脈高壓模型[10]。DEC組腹腔注射35mg/kg DEC，連續(xù)給藥28天，每天1次。正常組和模型組腹腔注射等體積0.9%的氯化鈉注射液。

3.RVSP、PAP的測(cè)定及RVHI的計(jì)算：各組大鼠腹腔注射30mg/kg戊巴比妥鈉麻醉，固定于手術(shù)臺(tái)，頸部消毒后縱向切開(kāi)皮膚，鈍性分離右側(cè)頸總靜脈，結(jié)扎血管遠(yuǎn)心端。眼科剪切口，沿切口向右心室方向緩慢插入預(yù)充肝素0.9%氯化鈉注射液的聚乙烯導(dǎo)管，另一端連接生物換能器。Powerlab生物信息采集與處理系統(tǒng)已提前打開(kāi)，并連接三通管和生物換能器監(jiān)護(hù)儀。緩緩向前推進(jìn)導(dǎo)管，根據(jù)顯示的壓力值和壓力波形判斷導(dǎo)管所在位置。當(dāng)右心室壓力波形和肺動(dòng)脈壓力波形出現(xiàn)時(shí)，固定導(dǎo)管位置，穩(wěn)定記錄10～15min后保存生物采集系統(tǒng)所捕獲的RVSP和PAP值。RVSP或PAP>25mmHg是公認(rèn)的野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓模型成功建立的標(biāo)準(zhǔn)。完成RVSP和PAP的檢測(cè)后，迅速暴露大鼠心臟，取出并用4℃ PBS沖洗干凈。沿著房室間溝剪去心房及大血管根部，經(jīng)肺動(dòng)脈出口沿肺動(dòng)脈圓錐和室間隔分離右心室游離壁，左心室加室間隔組織(left ventricle and interventricular septum，LV+S)兩部分。濾紙吸干表面多余的水分后稱量RV游離壁及LV+S的重量，兩者的比值即為右心室肥厚指數(shù)RVHI=RV/(LV+S)%。

4.HE染色、α-SMA免疫組織化學(xué)以及TUNEL染色：用HE染色法觀察各組肺血管重建情況[11]。取出大鼠左側(cè)肺葉，10%甲醛中固定48h后，蒸餾水沖洗10min。乙醇逐級(jí)脫水，浸蠟包埋并切片。切片行蘇木精-伊紅(HE)染色，光鏡下觀察直徑50～200μm肺部細(xì)動(dòng)脈病理改變并拍照，每只大鼠測(cè)定25支外觀相對(duì)圓整的血管。用Image-Pro Plus v6.0測(cè)量管腔的內(nèi)外徑，計(jì)算肺動(dòng)脈血管壁的中膜厚度(medial wall thickness, MT)與外徑(external diameter, ED)的比值，即中膜厚度百分比作為肺血管重建的指標(biāo)，MT%=(2MT/ED)×100%。用α-SMA免疫組織化學(xué)染色法評(píng)估各組肺動(dòng)脈肌化水平。肺組織常規(guī)石蠟包埋切片。二甲苯脫蠟、抗原熱修復(fù)，3% H2O2室溫下孵育15min，α-SMA單克隆抗體(1∶50)4℃孵育過(guò)夜。用生物素標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗室溫下孵育30min，DAB顯色后蘇木精復(fù)染，中性樹(shù)膠封片后顯微鏡下觀察。200×顯微鏡下可見(jiàn)200支左右血管，每只大鼠檢測(cè)25支直徑20～200μm的動(dòng)脈并拍照。根據(jù)Jones等[12]評(píng)價(jià)方法，將血管分為完全肌化、部分肌化和無(wú)肌化3個(gè)等級(jí)，對(duì)各組3種肌化程度的血管數(shù)統(tǒng)計(jì)并分析。肺動(dòng)脈壁中血管平滑肌細(xì)胞的凋亡情況采用原位細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒測(cè)定。組織的石蠟包埋和切片方法同HE染色和α-SMA免疫組織化學(xué)染色法，具體操作按照試劑盒說(shuō)明進(jìn)行。400×顯微鏡下觀察凋亡情況并拍照，用TUNEL陽(yáng)性率來(lái)反映各組凋亡情況。

5.FADD、caspase-8、Bax和Bcl-2等蛋白表達(dá)水平的檢測(cè)：取肺組織100mg，加入裂解液冰上提取總蛋白。15000r/min離心10min獲得上清，BCA定量總蛋白濃度，蛋白煮沸以變性，置于-20℃保存。SDS-PAGE凝膠電泳后，濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)移蛋白條帶至PVDF膜上。5%脫脂奶粉封閉PVDF膜1h。加入FADD、caspase-8、Bax和Bcl-2的單克隆抗體，4℃層析柜中孵育過(guò)夜。加入HRP-IgG二抗，室溫下振蕩孵育1h。滴加ECL顯色液，凝膠成像儀曝光，運(yùn)用Image J獲得灰度值。

結(jié) 果

1.各組RVSP、PAP和RVHI的變化：與正常組比較，模型組RVSP、PAP和RVHI均明顯升高(P<0.05)。其中模型組的PAP或RVSP>25mmHg表明野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓模型成功建立，而RVHI的變化表明大鼠右心室出現(xiàn)肥厚。DEC組RVSP、PAP和RVHI均顯著低于模型組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，說(shuō)明DEC顯著降低大鼠肺動(dòng)脈壓力，緩解右心室肥厚(表1)。

表1 各組RVSP、PAP和RVHI的變化

與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.HE染色、α-SMA免疫組化和TUNEL染色：正常組肺動(dòng)脈內(nèi)表面光滑，管壁薄且管腔正常，幾乎無(wú)炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。模型組肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞嚴(yán)重破壞，管壁明顯增厚伴隨管腔狹窄，炎性細(xì)胞大量浸潤(rùn)。DEC組肺動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞排列較整齊，管壁厚度較模型組明顯縮小，炎性細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象減輕(圖1A)。與對(duì)照組比較，模型組肺動(dòng)脈MT%明顯增加，而DEC干預(yù)后肺小動(dòng)脈MT%明顯下降(P<0.05，圖1B)。根據(jù)α-SMA免疫組化結(jié)果(圖1C)，按照α-SMA陽(yáng)性分布率統(tǒng)計(jì)各組無(wú)肌化、部分肌化和完全肌化的肺動(dòng)脈所占比例(圖1D)。與正常組比較，模型組中無(wú)肌化肺動(dòng)脈所占比例顯著降低，而完全肌化比例顯著提高(P<0.05)。DEC組無(wú)肌化肺動(dòng)脈所占比例顯著高于模型組，而完全肌化比例顯著低于模型組(P<0.05)。各組間部分肌化的肺動(dòng)脈所占比例的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。TUNEL染色檢測(cè)DEC對(duì)肺血管平滑肌細(xì)胞凋亡情況的影響(圖1E、F)。模型組中肺血管平滑肌細(xì)胞的TUNEL陽(yáng)性率顯著低于正常組(P<0.05)，DEC組TUNEL陽(yáng)性率顯著高于模型組(P<0.05)。

圖1 HE染色、α-SMA免疫組化和TUNEL染色A.HE染色(×200)；B.血管中膜厚度百分比(MT%)；C.α-SMA免疫組化(×200)；D.動(dòng)脈肌化程度；E.TUNEL染色(×400)；F.TUNEL陽(yáng)性率；與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

3.肺組織中FADD、caspase-8、Bax、Bcl-2等蛋白的表達(dá)水平檢測(cè)：檢測(cè)肺組織中內(nèi)源性和外源性凋亡相關(guān)蛋白的表達(dá)水平。與正常組比較，F(xiàn)ADD、caspase-8和Bax等凋亡蛋白在模型組中的表達(dá)水平顯著降低，抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平顯著提高(P<0.05)。DEC組凋亡蛋白FADD、caspase-8和Bax的表達(dá)水平顯著高于模型組，Bcl-2的表達(dá)水平顯著低于模型組(P<0.05，圖2)。

圖2 FADD、caspase-8、Bax和Bcl-2等蛋白表達(dá)水平的變化A.蛋白免疫印跡；B.FADD、caspase-8、Bax和Bcl-2等蛋白表達(dá)水平；與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

討 論

肺動(dòng)脈高壓是指肺動(dòng)脈內(nèi)膜增生和重構(gòu)引起的肺血管阻力進(jìn)行性增加，最終導(dǎo)致右心負(fù)荷增加及右心功能不全的疾病[13]。MCT在大鼠體內(nèi)經(jīng)肝代謝轉(zhuǎn)換成吡咯野百合堿后作用于肺動(dòng)脈管壁，導(dǎo)致血管內(nèi)皮損傷，肺血管平滑肌層增生，其誘導(dǎo)的PAH大鼠的病理改變與臨床動(dòng)脈性肺高壓相似，是目前最常用的PAH模型[14]。本研究旨在評(píng)價(jià)DEC對(duì)MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠的保護(hù)作用，并探討其作用機(jī)制。

PAP和RVSP反映肺動(dòng)脈壓力，是判斷肺動(dòng)脈高壓模型是否建立成的客觀指標(biāo)[15]。高壓力負(fù)荷下的右心室功能決定了患者病情的嚴(yán)重程度和生存情況，RVHI反映右心功能，其代表的右心室肥厚程度是影響PAH預(yù)后的重要因素[16]。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DEC能有效降低MCT肺動(dòng)脈高壓大鼠的RVSP、PAP和RVHI等指標(biāo)，說(shuō)明DEC能改善MCT誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈壓力的上升和右心室肥厚的情況。

HE染色結(jié)果顯示，DEC能改善MCT誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增生、肌層增厚和管腔狹窄等肺血管重構(gòu)的表現(xiàn)，有效降低炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。α-SMA是平滑肌表型的分子標(biāo)志物，由肺平滑肌細(xì)胞表達(dá)，其表達(dá)的上調(diào)反映肺動(dòng)脈中膜層的增厚和肺動(dòng)脈的肌化[17]。研究結(jié)果顯示，模型組α-SMA陽(yáng)性率顯著高于正常組，說(shuō)明PAH模型中肺動(dòng)脈嚴(yán)重肌化。而DEC能夠明顯改善因?yàn)橐鞍俸蠅A誘導(dǎo)所提高的α-SMA陽(yáng)性率，顯著降低PAH大鼠肺動(dòng)脈中完全肌化的動(dòng)脈比例，同時(shí)提高無(wú)肌化動(dòng)脈所占比例，提示DEC能夠逆轉(zhuǎn)野百合堿誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈肌化。為了探討DEC逆轉(zhuǎn)肺動(dòng)脈壁重構(gòu)的作用機(jī)制，TUNEL法檢測(cè)各組肺動(dòng)脈壁中動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的凋亡情況。結(jié)果顯示，DEC組TUNEL陽(yáng)性率顯著高于模型組，說(shuō)明DEC能通過(guò)促進(jìn)細(xì)胞凋亡發(fā)揮改善肺血管重構(gòu)作用。為了進(jìn)一步探究其促凋亡分子機(jī)制，采用蛋白免疫印跡法檢測(cè)各組肺組織中FADD、caspase-8、Bax和Bcl-2等蛋白的表達(dá)水平。

細(xì)胞凋亡主要由兩條途徑觸發(fā)，分別是死亡受體途徑(外源性途徑)和線粒體通路(內(nèi)源性途徑)。外源途徑由外源性配體與其特定促凋亡受體結(jié)合而觸發(fā)，例如Fas結(jié)合FADD后活化caspase-8形成死亡誘導(dǎo)信號(hào)復(fù)合物，進(jìn)而激活下游凋亡執(zhí)行蛋白caspase-1、caspase-3等[18,19]。內(nèi)源性途徑涉及線粒體應(yīng)激反應(yīng)，包括Bcl-2凋亡蛋白家族。Deng等[20]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO1表達(dá)的下調(diào)會(huì)導(dǎo)致肺動(dòng)脈高壓大鼠血栓的形成，出現(xiàn)Bcl-2的下調(diào)和Bad的上調(diào)。蛋白免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果表明，DEC能從外源途徑上顯著增加PAH大鼠中FADD、caspase-8的表達(dá)水平。DEC從內(nèi)源途徑上顯著下調(diào)了因MCT誘導(dǎo)而上升的抗凋亡蛋白Bcl-2的表達(dá)水平，顯著上調(diào)Bax表達(dá)。提示DEC能同時(shí)促進(jìn)內(nèi)源性和外源性凋亡來(lái)減輕肺動(dòng)脈平滑肌層增生。

綜上所述，DEC能同時(shí)作用于內(nèi)源和外源途徑凋亡分子標(biāo)志物，改善MCT誘導(dǎo)的PAH大鼠的肺動(dòng)脈壓力上升，右心室肥厚以及肺動(dòng)脈重塑和肌化情況，希望能為臨床PAH的治療提供幫助。