帕金森病大鼠模型形態(tài)學(xué)實驗研究及行為學(xué)評價*

劉梅梅 楊 珺 黃焱平 季 丹

（安徽醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校人體解剖學(xué)與組織胚胎學(xué)教研室 安徽合肥 230601）

帕金森?。╬arkinson"s disease，PD）是一種進(jìn)行性神經(jīng)退行疾病，以腦黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元變性、死亡和紋狀體系統(tǒng)多巴胺（dopamine，DA）含量減少為特征，臨床表現(xiàn)為靜止性震顫、肌肉強直、運動遲緩等，目前發(fā)病機(jī)制尚不清楚。該研究采用改良的Thomas方法［1］即前腦束單側(cè)兩點注射6-羥基多巴胺（6-hydroxydopamine，6-OHDA）建立PD大鼠模型，通過行為學(xué)檢測以及病理學(xué)觀察，探討PD大鼠行為學(xué)變化的病理學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物、試劑藥品和儀器

1.1.1 實驗動物 Spague-Dawlay（SD）大鼠60只，雄性，體重200～220g，由安徽醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供（皖醫(yī)實動準(zhǔn)第01號）。動物自由進(jìn)食、飲水，喂標(biāo)準(zhǔn)顆粒飼料，室溫18～22℃，實驗前對其行為學(xué)測試，無異常。

1.1.2 實驗試劑與藥品 6-OHDA、水合氯醛、阿樸嗎啡（APO）、明膠、HE染色試劑盒等。

1.1.3 實驗儀器 腦立體定位儀、MT-200 Morris水迷宮視頻跟蹤分析系統(tǒng)、冷凍切片機(jī)、光學(xué)顯微鏡。

1.2 方法

將SD大鼠隨機(jī)分成對照組和模型組各30只，對照組大鼠正常飼養(yǎng)，其余大鼠建立PD模型并測試。

1.2.1 PD大鼠模型的建立 SD大鼠用7%的水合氯醛（0.6mL／100g）腹腔注射麻醉后，將大鼠頭顱水平位固定在腦立體定位儀上，剃除大鼠頭頂毛發(fā)，手術(shù)區(qū)常規(guī)消毒，沿頭顱正中剪開頭皮和骨膜，使其前囟充分暴露，確定大鼠右側(cè)前腦內(nèi)側(cè)束損傷坐標(biāo)位置［2］。右側(cè)黑質(zhì)致密部：AP＝-4.7mm，ML＝-1.3mm，V＝-7.7mm；中腦腹側(cè)被蓋部：AP＝-4.4mm，ML＝-0.9mm，V＝-7.9mm。將6-OHDA、VitC按2.5：1的比例用生理鹽水制成0.3%的注射液備用。用電動顱骨鉆鉆顱孔2個，微量注射器抽取0.3%6-OHDA，每孔注射4.2μL，注射速度0.5μL／min，注射完畢后留針10min，緩慢拔針。用明膠海綿填塞顱孔，縫合皮膚及筋膜，術(shù)后注意大鼠保暖及護(hù)理，清醒后正常喂養(yǎng)。

1.2.2 APO誘導(dǎo)旋轉(zhuǎn)實驗 術(shù)后第7d進(jìn)行大鼠行為學(xué)觀察，通過腹腔注射APO（0.5mg／kg）誘導(dǎo)大鼠旋轉(zhuǎn)，用旋轉(zhuǎn)儀測量大鼠旋轉(zhuǎn)次數(shù)，取每30min轉(zhuǎn)圈數(shù)≥210轉(zhuǎn)的大鼠作為PD模型組［3］，共20只。

1.2.3 曠場實驗 采用100cm×100cm×40cm（長×寬×高）的木質(zhì)曠場箱，箱底平均分為25個方格（20cm×20cm），內(nèi)側(cè)壁涂黑，側(cè)壁的格子為外周區(qū)域，其余為中央?yún)^(qū)域［4］。將大鼠放置在中央?yún)^(qū)域觀察5min，記錄大鼠在中央?yún)^(qū)域的停留時間、直立次數(shù)和運動總距離。

1.2.4 露臺水迷宮實驗 采用Morriss水迷宮裝置［5］，將水池分為四個象限，將露臺置于水迷宮裝置的某一象限上，訓(xùn)練大鼠從露臺所在位置的對側(cè)象限頭朝池壁入水，時間設(shè)定為120s，記錄大鼠從入水到找到露臺的時間、游泳軌跡（運動總距離）及尋臺速度。

1.2.5 組織學(xué)檢測 ①制備腦組織冷凍切片。取正常組大鼠和模型組大鼠各2只，腹腔注射10%的水合氯醛麻醉，固定大鼠，剪開胸腔暴露心臟，從左心室插入導(dǎo)管注入生理鹽水，再灌注4%的多聚甲醛，持續(xù)60min，待大鼠全身僵硬后取腦，用生理鹽水沖洗，常規(guī)固定、脫水。20μm冠狀切片晾干后放入-80℃冰箱中保存?zhèn)溆?。②蘇木精-伊紅（HE）染色。將冷凍切片放入AFF固定液中固定1min，蒸餾水沖洗后蘇木精染色10min，蒸餾水洗，1%酒精鹽酸分化，蒸餾水洗，1%氨水反藍(lán)；伊紅染色1min，蒸餾水洗，脫水、透明、封片。光學(xué)顯微鏡下觀察黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元形態(tài)變化。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 行為學(xué)檢測

2.1.1 曠場實驗 PD模型組大鼠的直立次數(shù)和運動總距離均明顯少于對照組大鼠，且對照組大鼠在中央格區(qū)域停留的時間明顯短于模型組大鼠，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.01），詳見表1。

表1 曠場實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計表

2.1.2 露臺水迷宮實驗 對照組大鼠的尋臺速度顯著快于PD模型組大鼠，且尋臺時間明顯短于模型組大鼠，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p＜0.01），詳見表2。

表2 露臺水迷宮實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計表

2.2 HE染色下觀察大鼠黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元變化

高倍鏡下觀察PD模型組大鼠黑質(zhì)區(qū)致密部神經(jīng)元胞體形態(tài)各異，大小不均一，數(shù)量明顯少于對照組，詳見圖1。

圖1 HE染色下對照組和模型組大鼠黑質(zhì)區(qū)神經(jīng)元變化

3 討論

多巴胺能神經(jīng)元主要位于中腦黑質(zhì)致密帶，當(dāng)其變性死亡時，會引起紋狀體內(nèi)多巴胺水平的降低。該實驗將6-羥基多巴胺（6-OHDA）注射到大鼠前腦束（MFB）后，多巴胺能神經(jīng)纖維吸收6-OHDA并運輸?shù)胶谫|(zhì)致密部發(fā)揮其毒性作用，多巴胺能神經(jīng)元傳導(dǎo)通路被阻斷，最終導(dǎo)致黑質(zhì)致密區(qū)多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量減少或者變性，成功建立PD大鼠模型。該實驗采用多點注射的方法，提高了制模的成功率和穩(wěn)定性。PD大鼠模型在其病理和生化等方面的改變和人類PD有很多相似之處［6］，可以為深入研究PD以及藥物的療效觀察和毒性作用機(jī)制等方面提供實驗基礎(chǔ)。

該實驗采用曠場實驗觀察并評價PD大鼠自主運動行為能力的變化。結(jié)果顯示，模型組大鼠直立次數(shù)、中央格停留時間、運動速度及運動總距離顯著低于對照組，表明PD模型大鼠運動行為能力下降、運動協(xié)調(diào)性降低。露臺水迷宮實驗是用于檢測動物學(xué)習(xí)記憶及空間認(rèn)知能力的神經(jīng)行為學(xué)方法，實驗中模型組大鼠和對照組大鼠相比尋臺速度明顯下降，尋臺時間顯著延長，表明PD大鼠出現(xiàn)典型的運動功能障礙。HE染色下，模型組大鼠中腦黑質(zhì)致密區(qū)神經(jīng)元數(shù)量減少，尼氏體出現(xiàn)部分溶解消失，證明了采用內(nèi)側(cè)前腦束單側(cè)兩點注射6-OHDA是建立PD大鼠模型的有效方法，同時也提示PD大鼠的行為學(xué)變化有其病理學(xué)基礎(chǔ)。