術(shù)前miR-376c-3p水平與宮頸癌臨床病理特征及預(yù)測(cè)術(shù)后復(fù)發(fā)價(jià)值

李彩榮 吳大保

中國(guó)科學(xué)技術(shù)大學(xué)附屬第一醫(yī)院(安徽省立醫(yī)院)(合肥，230001)

宮頸癌是臨床發(fā)病率最高的婦科惡性腫瘤，分期較早患者及時(shí)行根治性手術(shù)是最理想方案，但患者術(shù)后存在一定復(fù)發(fā)概率，影響復(fù)發(fā)的直接因素尚未明確且是目前臨床研究重點(diǎn)[1-2]。miRNA是一類(lèi)由內(nèi)源基因編碼、長(zhǎng)度為22 個(gè)核苷酸的非編碼單鏈RNA分子，參與多個(gè)生命過(guò)程且被發(fā)現(xiàn)在不同惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展中扮演一定角色。miR-376c-3p是miRNA亞型，已被證實(shí)在調(diào)控人胃腸道間質(zhì)瘤細(xì)胞[3]、宮頸癌細(xì)胞[4]惡性行為方面具有直接作用，但在組織中的表達(dá)變化及可能產(chǎn)生的影響研究極少。本研究探討早期宮頸癌患者術(shù)前病灶組織中miR-376c-3p的表達(dá)變化及與臨床病理特征的關(guān)系，對(duì)術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)等，為宮頸癌靶向干預(yù)尋求可能指標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年1月-2015年1月在本院行宮頸癌根治術(shù)的原發(fā)性宮頸癌患者作為宮頸癌組。納入標(biāo)準(zhǔn)：①經(jīng)術(shù)中冰凍及術(shù)后病理結(jié)果明確原發(fā)性宮頸癌；②國(guó)際婦產(chǎn)科聯(lián)盟(FIGO)分期為Ⅰ-Ⅱa期，符合宮頸癌根治術(shù)指征；③術(shù)前進(jìn)行宮頸病灶組織活檢；④廣泛子宮切除術(shù)+盆腔淋巴結(jié)清掃術(shù)；⑤年齡≥18周歲；⑥本人簽署知情同意書(shū)并配合后續(xù)隨訪。排除標(biāo)準(zhǔn)：①術(shù)前放化療或者其他治療史；②合并嚴(yán)重基礎(chǔ)性心肝腎功能不全；③術(shù)后3月內(nèi)死亡病例。同期本院行宮頸活檢并診斷為宮頸上皮內(nèi)瘤變患者為宮頸良性病變組，入組前3月無(wú)宮頸局部治療史、本人簽署知情同意書(shū)。本研究通過(guò)醫(yī)院倫理審核。

1.2 宮頸組織中miR-376c-3p檢測(cè)

宮頸活檢組織標(biāo)本在離體30min內(nèi)迅速凍存于液氮罐中，復(fù)溫后采用RNAiso Plus試劑提取組織RNA并檢測(cè)其完整性，使用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA純度、濃度。采用microRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，反應(yīng)體系：miRNA ReactionBuffer Mix 10μl，miRNA Prime Script RTEnzyme Mix 2μl，0.1%BSA2μl，Total RNA 1μl，最后用不含RNA酶的dH2O補(bǔ)足至20μl。反應(yīng)條件：37℃ 60min→85℃ 5s，產(chǎn)物﹣20℃?zhèn)溆?。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)擴(kuò)增：miR-376c-3p引物序列5’-AGCTGTAGCCGTAACGTAGT，3’-CTTGAACGTAAGCTGGAGCT，反應(yīng)體系：PCR正向引物0.8μl、PCR反向引物0.8μl、SYBR Premix ExTaqTMⅡ10μl，ROX參比資料Ⅱ0.4μl，DNA模板2.0μl，用不含RNA酶的dH2O補(bǔ)足至20μl。反應(yīng)條件如下：95℃ 30s→95℃ 3s→60℃ 30s，共40個(gè)循環(huán)。當(dāng)目標(biāo)基因的擴(kuò)增效應(yīng)與內(nèi)參照基因相同時(shí)，以U6為內(nèi)參考，測(cè)定Ct值并計(jì)算△Ct值，以2﹣△△Ct表示miR-376c-3p的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 術(shù)后隨訪

電話隨訪，以宮頸癌根治術(shù)完成當(dāng)日作為隨訪起點(diǎn)，以2020年1月1日或之前宮頸癌復(fù)發(fā)時(shí)間為隨訪終點(diǎn)。手術(shù)后復(fù)發(fā)：成功完成宮頸癌根治術(shù)、術(shù)中標(biāo)本切緣陰性，手術(shù)結(jié)束6個(gè)月后出現(xiàn)新發(fā)腫瘤且與原發(fā)腫瘤細(xì)胞一致，最終以病理組織學(xué)或者PET/CT等影像學(xué)檢查共同診斷。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 基本情況

根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)累計(jì)納入90例患者進(jìn)入宮頸癌組，年齡(54.4±7.1)歲(39～76歲)，體質(zhì)指數(shù)(BMI)(23.4±2.6)kg/m2(21～26 kg/m2)；宮頸良性病變組100例，年齡(53.2±6.5)歲(37～73歲)，BMI(23.4±2.6)kg/m2(21～27 kg/m2)。兩組比較無(wú)差異(P>0.05)。術(shù)前病灶活檢組織中miR-376c-3p的表達(dá)水平宮頸癌組(0.65±0.08)低于宮頸良性病變組(0.86±0.10)(t=15.869，P=0.000)。

2.2 宮頸癌組miR-376c-3p表達(dá)與臨床病理特征

宮頸癌組患者術(shù)前miR-376c-3p表達(dá)水平，在不同腫瘤最大直徑、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、間質(zhì)浸潤(rùn)深度等存在差異(P<0.05)，不同年齡、月經(jīng)狀態(tài)、病理類(lèi)型等無(wú)差異(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 宮頸癌組不同臨床病理特征與miR-376c-3p表達(dá)水平比較

2.3 宮頸癌患者miR-376c-3p表達(dá)水平與無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間

90例入組患者均獲得有效隨訪，根據(jù)miR-376c-3p表達(dá)水平中位數(shù)將所有宮頸癌患者分為高miR-376c-3p組、低miR-376c-3p組。高miR-376c-3p組的無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間中位數(shù)63個(gè)月，無(wú)復(fù)發(fā)生存率為88.9%(40/45)；低miR-376c-3p組的無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間中位數(shù)為50個(gè)月，無(wú)復(fù)發(fā)生存率為80.0%(36/45)。Kaplan-Meier生存曲線顯示，高miR-376c-3p組的無(wú)復(fù)發(fā)生存狀況優(yōu)于低miR-376c-3p組(P<0.05)，見(jiàn)圖1。

圖1 宮頸癌患者不同miR-376c-3p水平無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間比較

2.4 術(shù)前miR-376c-3p表達(dá)水平對(duì)宮頸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的預(yù)測(cè)價(jià)值

術(shù)前miR-376c-3p表達(dá)水平預(yù)測(cè)宮頸癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的截點(diǎn)為0.625，對(duì)應(yīng)的曲線下面積(AUC)為0.688(95% CI：0.544～0.833)，靈敏度及特異度分別為52.6%、78.6%。

3 討論

miR-376c-3p是近年研究較多的miRNA亞型。Bhavsar[5]發(fā)現(xiàn)miR-376c-3p可靶向細(xì)胞周期蛋白D1并誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖阻滯；Zhang[6]認(rèn)為miR-376c-3p可通過(guò)下調(diào)LncRNA-LINC00152而降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的惡性行為、促進(jìn)其凋亡。miR-376c-3p在宮頸癌中的研究也有一定開(kāi)展，劉曉娟等[4]研究發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)鏈非編碼RNA linc00152(LINC00152)可靶向下調(diào)miR-376c-3p表達(dá)并促進(jìn)宮頸癌細(xì)胞惡性進(jìn)展。關(guān)于miR-376c-3p在宮頸癌中研究涉及極少，本文發(fā)現(xiàn)宮頸癌病灶組織中miR-376c-3p表達(dá)水平較宮頸良性病變者存在明顯下降，這與既往細(xì)胞研究中miR-376c-3p的表達(dá)變化趨勢(shì)吻合，說(shuō)明在宮頸癌患者中低表達(dá)的miR-376c-3p也參與了疾病的發(fā)生發(fā)展。

宮頸癌患者病情嚴(yán)重程度多與病理特征密切相關(guān)，尤其腫瘤分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等直接決定疾病嚴(yán)重程度[7-9]。本文分析發(fā)現(xiàn)腫瘤最大直徑≥4cm、FIGO分期Ⅱa期、合并淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、間質(zhì)浸潤(rùn)深度≥2/5的宮頸癌患者術(shù)前病灶組織中miR-376c-3p的表達(dá)水平較低，提示miR-376c-3p表達(dá)水平持續(xù)降低預(yù)示著宮頸癌病情較為嚴(yán)重。Zhang[10]研究認(rèn)為上調(diào)miR-376c-3p可通過(guò)靶向ING5減輕葡萄糖缺氧誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷; Liu[11]在對(duì)miR-376c-3p影響胃癌細(xì)胞的機(jī)制分析發(fā)現(xiàn)，miR-376c-3p通過(guò)靶向SYF2并降低SYF2表達(dá)并抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移。miR-376c-3p表達(dá)水平降低促進(jìn)宮頸癌惡性進(jìn)展的具體機(jī)制是否與上述兩種途徑相似目前不得而知，有待后續(xù)開(kāi)展分子研究進(jìn)一步明確。本文中不同年齡、月經(jīng)狀態(tài)、病理類(lèi)型的宮頸癌患者術(shù)前miR-376c-3p表達(dá)水平未見(jiàn)差異，可能與這些特征對(duì)宮頸癌惡性程度的影響較小有關(guān)。

本文中宮頸癌患者處于FIGO分期Ⅰ-Ⅱa期，均符合根治性手術(shù)指征，其術(shù)后復(fù)發(fā)與否及復(fù)發(fā)時(shí)間等對(duì)患者生存結(jié)局產(chǎn)生至關(guān)重要影響[12-14]。術(shù)后長(zhǎng)期隨訪，經(jīng)Kaplan-Meier生存曲線分析發(fā)現(xiàn)，高miR-376c-3p組患者中位無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間較長(zhǎng)且整體無(wú)復(fù)發(fā)生存狀況較優(yōu)。進(jìn)一步明確了術(shù)前miR-376c-3p低表達(dá)可能預(yù)示著根治性手術(shù)后復(fù)發(fā)較早，推測(cè)與miR-376c-3p水平降低后對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖、遷移行為的抑制減弱，導(dǎo)致術(shù)后微小殘留病灶復(fù)發(fā)或者細(xì)胞癌變?cè)俅伟l(fā)生。進(jìn)一步經(jīng)ROC曲線發(fā)現(xiàn)，術(shù)前miR-376c-3p表達(dá)水平預(yù)測(cè)乳腺癌患者術(shù)后復(fù)發(fā)的截點(diǎn)為0.625，對(duì)應(yīng)的AUC為0.688，靈敏度及特異度分別為52.6%、78.6%，提示術(shù)前宮頸病灶組織miR-376c-3p水平對(duì)根治術(shù)后復(fù)發(fā)有一定預(yù)測(cè)價(jià)值，可能對(duì)日后患者的干預(yù)方案調(diào)整有實(shí)踐意義。

綜上所述，宮頸癌患者術(shù)前病灶組織中miR-376c-3p表達(dá)水平異常降低，且與腫瘤最大直徑、FIGO分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、間質(zhì)浸潤(rùn)深度等臨床病理特征有關(guān)，在判斷術(shù)后無(wú)復(fù)發(fā)生存時(shí)間、預(yù)測(cè)術(shù)后復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)方面均有一定價(jià)值。本研究也存在局限，如納入例數(shù)有限、未涉及miR-376c-3p影響宮頸癌病情的分子機(jī)制等，有待后續(xù)大樣本臨床研究、深入的基礎(chǔ)研究等明確。