超聲法與閃式提取法提取紅景天苷的工藝對比試驗

王軍民 ， 陳永虎 ， 包彥強(qiáng) ， 阿依努爾 ， 朱鶴云 ， 韓麗琴

(1. 吉林醫(yī)藥學(xué)院附屬醫(yī)院 ， 吉林吉林132013 ； 2. 吉林醫(yī)藥學(xué)院藥學(xué)院 ， 吉林吉林132013)

紅景天(RhodiolaeCrenulataeRadixEtRhizoma)為景天科植物大花紅景天的根和根莖，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，具有益氣活血、通脈平喘等功效[1]。主要分布于我國東北、華北、西北及西南的高寒山區(qū)。紅景天苷(Salidroside)為紅景天中的主要活性成分，具有緩解疲勞[2-3]、延緩衰老[4-5]、保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)[6-7]和心血管系統(tǒng)[8]等作用。

文獻(xiàn)中報道的紅景天苷提取方法主要有超聲法[9-10]和溶劑提取法[11-12]。本文建立了測定紅景天中主要活性成分紅景天苷的高效液相色譜法(HPLC)，并對比超聲法與閃式提取法提取紅景天中紅景天苷的工藝，為紅景天藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和充分應(yīng)用其藥用價值提供參考。

1 材料與方法

1.1 儀器 LC-20A型高效液相色譜儀(配備Lab solution 色譜工作站)；閃式提取器(JHBE-50S型，河南金鼐科技發(fā)展有限公司)；聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試劑與材料 色譜甲醇,色譜甲酸(國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)；乙醇(分析純，北京化工廠)；紅景天苷對照品(批號：110818-201708，中國食品藥品檢定研究院)，化學(xué)結(jié)構(gòu)見圖1。

圖1 紅景天苷的結(jié)構(gòu)Fig.1 Structure of salidroside

西藏產(chǎn)紅景天藥材，市售。經(jīng)吉林醫(yī)藥學(xué)院雷鈞濤教授鑒定為景天科植物大花紅景天，樣品留存于吉林醫(yī)藥學(xué)院中藥樣品室。

1.3 色譜條件 色譜柱：Shim-Pack GIST柱(250 mm×4.6 mm,5 μm)；流動相：甲醇-0.1%甲酸水溶液(15∶85，v/v)；流速：1 mL/min；柱溫：35 ℃；檢測波長：275 nm；進(jìn)樣量：10 μL。相關(guān)色譜圖見圖2和圖3。

圖2 紅景天苷對照品色譜圖Fig.2 HPLC chromatograms of salidroside1:紅景天苷1:Salidroside

圖3 紅景天樣品色譜圖Fig.3 HPLC chromatograms of Rhodiolae Crenulatae Radix Et Rhizoma sample1:紅景天苷1:Salidroside

1.4 溶液的制備

1.4.1 對照品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取紅景天苷對照品溶解后轉(zhuǎn)移至10.00 mL容量瓶中，甲醇定容，得濃度為1.0 mg/mL的對照品溶液。

1.4.2 供試品溶液的制備 準(zhǔn)確稱取紅景天粉末0.5 g，用25 mL 70%的乙醇，250 W功率下超聲提取0.5 h，精密量取續(xù)濾液5.00 mL，蒸干，用流動相轉(zhuǎn)溶至5 mL客量瓶中，稀釋至刻度，用0.45 μm微孔濾膜過濾，按“1.3”項下色譜條件進(jìn)行HPLC分析。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 精密量取“1.4.1”項下制備的對照品0.1、0.25、0.5、1.0、2.0 mL，甲醇溶液稀釋成濃度為10、25、50、100 μg/mL和200 μg/mL的紅景天苷對照品系列溶液。按“1.3”項下色譜條件依次進(jìn)樣測定色譜峰面積，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：A=3.7×103C+ 2.9×103(r2=0.999 9)。結(jié)果表明，紅景天苷在10～200 μg/mL內(nèi)與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.2 精密度試驗 準(zhǔn)確移取50 μg/mL紅景天苷對照品溶液 200 μL，按上述色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，記錄峰面積，RSD=0.5%，表明儀器精密度良好。

1.1 病理生理特點(diǎn) 正常成人每日水和鈉的攝入量變化很大，水鈉調(diào)節(jié)機(jī)制功能正常時可維持血鈉濃度在135～145 mmol/L。機(jī)體內(nèi)水、鈉的平衡緊密相關(guān)，共同影響著細(xì)胞外液的滲透壓和容量。水平衡主要受渴感和抗利尿激素調(diào)節(jié)，在維持體液等滲方面起重要作用；鈉平衡主要受醛固酮和心房利鈉肽調(diào)節(jié)，在維持細(xì)胞外液的容量和組織灌流方面起重要作用[2]。下丘腦神經(jīng)核合成并轉(zhuǎn)運(yùn)到垂體后葉儲存和釋放的血管加壓素(arginine vasopressin，AVP)能夠促進(jìn)腎集合管水的重吸收，在維持水鈉平衡中起到重要調(diào)節(jié)作用。

2.3 穩(wěn)定性試驗 取同一份供試品溶液，室溫下測定0、2、4、8、12 h和24 h峰面積。結(jié)果RSD=1.2%，表明供試品溶液室溫24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4 重復(fù)性試驗 取同一批樣品6 份，制備供試品溶液，取供試品溶液200 μL，測定峰面積，計算待測成分的含量。結(jié)果紅景天苷的含量平均值(n=6)為1.25%，RSD為1.0%，表明方法重復(fù)性良好。

2.5 超聲法提取紅景天中的紅景天苷

2.5.1 正交試驗設(shè)計 選擇溶劑濃度、液料比、時間、功率 4 個因素，提取率為考察指標(biāo)，采用L9(34)正交設(shè)計表進(jìn)行試驗。超聲法試驗因素水平、正交試驗結(jié)果和方差分析結(jié)果見表1、表2和表3。由表1、表2、表3可知，各因素對紅景天苷提取率的影響順序為時間>功率 >液料比>溶劑濃度，優(yōu)化得超聲法最佳方案為A3B1C2D3，即提取溶劑為90%乙醇，料液比為1∶10，提取時間為30 min，超聲功率為250 W。

表1 超聲法試驗因素水平Table 1 Factors and levels by ultrasonic extraction

表2 超聲法正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test by ultrasonic extraction (n=3)

表3 超聲提取法方差分析結(jié)果Table 3 The results of variance analysis by ultrasonic extraction

2.5.2 驗證試驗 取紅景天供試品3份，按照正交試驗結(jié)果進(jìn)行驗證，結(jié)果提取率=1.92%，比正交試驗高，確定最佳工藝條件。

2.6 閃式提取法提取紅景天中的紅景天苷

表4 閃式提取法因素水平Table 4 Factors and levels by smashing tissue extraction

表5 閃式提取法正交試驗結(jié)果Table 5 Results of orthogonal test by smashing tissue extraction (n=3)

表6 閃式提取法方差分析結(jié)果Table 6 The results of variance analysis by smashing tissue extraction

2.6.2 驗證試驗 稱取紅景天供試品3份進(jìn)行驗證，提取率=2.55%，確定最佳工藝條件。

2.7 不同提取法的提取效果對比 以不同方法提取紅景天苷的條件及提取率對比見表7。由表7可知，閃式提取法省時、高效，提取時間僅為超聲法的1/15。

表7 不同方法提取紅景天中紅景天苷的提取率Table 7 The extraction rate of salidroside from Rhodiolae Crenulatae Radix Et Rhizoma by different extraction technologies

3 討論

本試驗以甲醇-0.1%甲酸水溶液(15∶85，v/v)作為流動相，采用Shim-Pack GIST柱(250 mm×4.6 mm,5 μm) 進(jìn)行分離，分離度R>1.5，分析時間短，峰形好。

超聲提取法是利用超聲波的機(jī)械效應(yīng)、熱效應(yīng)和空化作用等，促使植物細(xì)胞壁及整個生物體的破裂在瞬間完成，從而顯著提高藥物的提取率[13]。閃式提取法是指在適當(dāng)溶劑存在的條件下，依靠高速機(jī)械剪切力數(shù)秒鐘內(nèi)把植物破碎至細(xì)微顆粒，并使組織細(xì)胞內(nèi)部的化學(xué)成分與溶劑充分接觸，增加藥物的提取率[14]。閃式提取法的優(yōu)點(diǎn)是溶劑用量小，提取時間短，效率高[15]。目前已有文獻(xiàn)報道了采用閃式提取法提取積雪草總皂苷、甘草葉總黃酮、三七總皂苷和龍膽苦苷[16-19]。

本試驗采用閃式提取法提取紅景天苷，并對比了超聲法與閃式提取法提取工藝。結(jié)果表明，要獲得相同的提取率，閃式提取法效率更高，其最佳提取工藝為提取溶劑70%乙醇，料液比1∶20，提取時間2 min。