不同品種谷子愈傷組織對拿捕凈脅迫的生理響應(yīng)

趙娟，尹藝臻，王曉璐，馬春英，尹美強，溫銀元，宋喜娥，董淑琦，楊雪芳，原向陽

（山西農(nóng)業(yè)大學農(nóng)學院，山西太谷 030801）

0 引言

【研究意義】谷子（Setaria italicaBeauv.）為一年生禾本科狗尾草屬植物，是中國北方干旱和半干旱地區(qū)重要的區(qū)域性糧食作物，具有抗旱、耐瘠、水分利用效率高、營養(yǎng)豐富等特點，在中國的糧食安全中起重要作用[1-4]。脫殼后的谷子稱為小米，含豐富的蛋白質(zhì)、維生素、脂肪、鈣鐵鋅硒等微量元素，是中國傳統(tǒng)作物和環(huán)境友好型作物[5-7]。谷田雜草種類繁多，危害嚴重，導致養(yǎng)分流失，植株生長矮小，減產(chǎn)可達20%以上，嚴重制約谷子生產(chǎn)，田間除草已成為阻礙谷子大面積推廣生產(chǎn)的重要因素之一[8-9]。目前，使用除草劑仍然是解決田間雜草危害的有效途徑，但如果施用不當就會產(chǎn)生嚴重藥害。因此，開展谷子除草劑抗性研究，了解谷子抗除草劑生理機理，對開展谷子抗除草劑相關(guān)研究和抗性品種篩選具有重要意義?！厩叭搜芯窟M展】溫銀元等[10]研究撲草凈對遠志（Polygala tenuifoliaWilld.）幼苗生長、根系活力、膜脂過氧化、活性氧含量及抗氧化酶活性等的影響，表明遠志幼苗可通過多種抗氧化酶（SOD、POD、CAT、APX等）和非酶抗氧化劑（如脯氨酸）的相互協(xié)調(diào)作用，清除低濃度撲草凈脅迫誘發(fā)產(chǎn)生的活性氧，減輕對細胞的傷害。吳燕等[11]研究滁菊（Dendranthema morifoliumL.）幼苗對除草劑乙草胺的生理響應(yīng)，表明乙草胺處理降低了滁菊葉片抗氧化酶SOD、POD和CAT活性，葉片相對電導率和MDA含量增加，嚴重破壞細胞膜結(jié)構(gòu)。孫昊等[12]用8種除草劑處理中華水韭（Isoetes sinensisPalmer）后發(fā)現(xiàn)其葉片葉綠素含量顯著降低，氣孔導度和蒸騰速率急劇升高，凈光合速率明顯降低。除草劑在谷子上的相關(guān)研究表明，除草劑脅迫對谷子生長發(fā)育、產(chǎn)量形成、生理生態(tài)等方面均有較大影響[13-17]。除草劑脅迫影響谷子種子萌發(fā)，導致谷子生長速率減緩，生物量降低，嚴重影響谷子的生長發(fā)育。高愛保等[18]比較研究了拿捕凈（烯禾啶）對6個不同品種谷子的影響，發(fā)現(xiàn)脅迫后抗性品種葉綠素含量較高，且抗性品種抗氧化酶活性較強。楊慧杰等[19]研究表明除草劑闊世瑪對谷子產(chǎn)生顯著藥害,油菜素內(nèi)酯可以通過提高光合色素含量、增加氣孔導度、提高PSⅡ光化學活性等來緩解闊世瑪對谷子光合作用的抑制。【本研究切入點】近年來，植物組織培養(yǎng)技術(shù)在抗除草劑作物的培育方面發(fā)展較快[20-24]。離體培養(yǎng)獲得的愈傷組織對除草劑十分敏感，容易產(chǎn)生突變體，篩選獲得的突變體再生成植株得到抗性新品種。通過離體篩選，已經(jīng)成功培育了煙草、小麥、玉米、大豆、棉花、高粱等多種作物的抗除草劑品種，但在谷子上進展緩慢[25]。主要原因是逆境條件下植物的響應(yīng)機制復(fù)雜，對谷子在除草劑脅迫下的相關(guān)研究主要集中在大田植株上，從細胞水平對其生理響應(yīng)和抗性機理進行研究的報道較少，且不同感抗性谷子愈傷組織對除草劑脅迫的生理響應(yīng)差異的研究更是鮮見報道。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究選用對拿捕凈有不同抗性的3個谷子品種愈傷組織為材料，在離體培養(yǎng)的條件下對其進行不同濃度的拿捕凈脅迫處理，測定谷子愈傷組織細胞中的MDA、O2-含量和膜透性、滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（SP、Pro、SS）含量和抗氧化酶系（SOD、POD、CAT）活性，分析對拿捕凈感抗性差異顯著的3個谷子品種的響應(yīng)機理差異，從細胞水平對谷子抗除草劑的生理響應(yīng)進行初步研究，為深入研究谷子除草劑抗性機制和抗除草劑品種的離體篩選提供理論參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

選用拿捕凈敏感品種晉谷21號和拿捕凈抗性品種豫谷35號、冀谷42號為試驗材料。除草劑拿捕凈（中農(nóng)立華農(nóng)用化學品有限公司），有效成分含量為12.5%。

1.2 試驗方法

1.2.1 愈傷組織的誘導 以前期試驗篩選出的適宜培養(yǎng)基MS+2.0 mg·L-12,4-D+0.2 mg·L-16-BA為基本培養(yǎng)基，將經(jīng)過滅菌處理的3種谷子種子接種到愈傷組織誘導培養(yǎng)基上，每處理接種70粒種子，在（25±1）℃黑暗中培養(yǎng)3周，誘導獲得愈傷組織。

1.2.2 拿捕凈脅迫處理 選擇生長旺盛、均勻一致的愈傷組織分別接種到以MS+2.0 mg·L-12,4-D+0.2 mg·L-16-BA為基本培養(yǎng)基，添加不同濃度拿捕凈（0、0.5、1、2和3 mL·L-1）的培養(yǎng)基上，以不添加拿捕凈的處理為對照，暗培養(yǎng)2 d后測定不同處理下3種愈傷組織的MDA含量、SOD活性、SP含量等各項生理指標，試驗重復(fù)3次。培養(yǎng)至2周后，觀察比較不同濃度拿捕凈脅迫對3種谷子愈傷組織生長的影響。

1.2.3 生理指標的測定 采用硫代巴比妥酸法測定丙二醛（MDA）含量；采用電導儀法測定細胞膜相對透性；采用羥胺氧化法測定超氧陰離子（O2-）含量；采用NBT光化學還原法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性；采用愈創(chuàng)木酚比色法測定過氧化物酶（POD）活性；采用紫外吸收法測定過氧化氫酶（CAT）活性；采用考馬斯亮藍G-250染色法測定可溶性蛋白（SP）含量；采用蒽酮比色法測定可溶性糖（SS）含量；采用酸性茚三酮法測定脯氨酸（Pro）含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2013軟件對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計并制圖，用SPSS 19.0對數(shù)據(jù)進行多重比較和方差分析。

2 結(jié)果

2.1 拿捕凈脅迫對3種谷子愈傷組織生長的影響

不同濃度拿捕凈脅迫對3個谷子品種愈傷組織生長的影響不同，對晉谷21的影響要明顯大于豫谷35和冀谷42。在附加不同濃度拿捕凈的培養(yǎng)基中，晉谷21的愈傷組織生長明顯受抑，出現(xiàn)褐化皺縮現(xiàn)象，且隨處理濃度升高，褐化皺縮明顯（圖1-d1和圖1-e1）。豫谷35的愈傷組織在附加低濃度拿捕凈的培養(yǎng)基上褐化不明顯，并可繼續(xù)生長增殖，脅迫濃度達到3 mL·L-1時，出現(xiàn)較明顯褐化（圖1-e2）。冀谷42的愈傷組織在附加不同濃度拿捕凈的培養(yǎng)基上均可持續(xù)生長增殖，處理濃度達到3 mL·L-1時，出現(xiàn)輕微褐化（圖1-e3）。

圖1 不同濃度拿捕凈對谷子愈傷組織生長的影響Fig.1 Effect of different concentrations of Sethoxydim on growth of millet callus

2.2 拿捕凈脅迫對谷子愈傷組織MDA、膜透性和O2-含量的影響

2.2.1 丙二醛（MDA）含量 提高拿捕凈處理濃度，3種谷子愈傷組織中MDA含量變化趨勢略有不同（圖2-A）。處理濃度超過0.5 mL·L-1后，隨濃度增加，晉谷21和冀谷42的愈傷組織中MDA含量均不斷增加，二者差異不顯著，處理濃度達3 mL·L-1時，冀谷42愈傷組織中MDA含量低于晉谷21；豫谷35的愈傷組織中MDA含量則先降低后升高，且在每個處理濃度均顯著低于晉谷21號。

2.2.2 細胞膜相對透性 拿捕凈處理濃度低于1 mL·L-1時，隨著拿捕凈處理濃度升高，3種谷子愈傷組織細胞膜相對透性與對照相比均出現(xiàn)上下波動，但變化不明顯；脅迫濃度達到2 mL·L-1時，3種谷子的膜透性均快速上升，以冀谷42上升幅度明顯低于前兩者；脅迫濃度達到3 mL·L-1時，晉谷21和冀谷42膜透性繼續(xù)增加，而豫谷35則明顯降低，三者差異顯著（圖2-B）。

2.2.3 O2-含量 不同濃度拿捕凈處理對3種谷子愈傷組織中O2-含量的影響不同（圖2-C）。晉谷21和豫谷35的O2-含量均隨著拿捕凈濃度的增加呈現(xiàn)先降低后升高的趨勢，但處理濃度高于0.5 mL·L-1后，豫谷35的O2-含量始終顯著低于晉谷21；冀谷42的O2-含量隨著拿捕凈濃度的增加則呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，處理濃度為2 mL·L-1時達到峰值，處理濃度為3 mL·L-1時，O2-含量快速降低，顯著低于晉谷21號。

圖2 拿捕凈脅迫對谷子愈傷組織中MDA含量、膜透性、O2-含量的影響Fig.2 Effects of sethoxydim stress on the content of MDA,membrane permeability, O2- in millet callus

2.3 拿捕凈脅迫對谷子愈傷組織細胞中抗氧酶活性的影響

2.3.1 超氧化歧化酶（SOD）活性 隨拿捕凈處理濃度增加，晉谷21和豫谷35愈傷組織中SOD活性均呈先升高后降低的趨勢（圖3-A），均在脅迫濃度為1 mL·L-1時達到最大值，之后活力大幅降低，但豫谷35的SOD活性始終顯著高于晉谷21號；而冀谷42的SOD活性則隨著拿捕凈處理濃度的增高呈先降低后升高再降低的趨勢，處理濃度為2—3 mL·L-1時，其SOD活性與豫谷35接近，且顯著高于晉谷21號。

2.3.2 過氧化物酶（POD）活性 由圖3-B可見，3種谷子愈傷組織中POD活性變化趨勢不同。晉谷21號的POD活性隨著拿捕凈濃度的增高呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢；豫谷35的POD活性則隨著拿捕凈處理濃度的增加先降低后持續(xù)上升；冀谷42的POD活性在處理濃度為1 mL·L-1時達到峰值，顯著高于其他2個品種。雖然豫谷35和冀谷42的POD活性變化趨勢不同，但在拿捕凈各濃度脅迫下，二者的POD活性均顯著高于晉谷21，且差異顯著。

2.3.3 過氧化氫酶（CAT）活性 隨著拿捕凈處理濃度的提高，晉谷21愈傷組織中CAT活性先降低后升高，在處理濃度為3 mL·L-1時達到峰值，且顯著高于豫谷35和冀谷42（圖3-C）。處理濃度低于3 mL·L-1時，豫谷35和冀谷42 CAT活性雖有上下波動，但始終高于晉谷21，尤其是冀谷42，在處理濃度為2 mL·L-1時達到峰值，且活性顯著高于晉谷21號。

圖3 拿捕凈脅迫對谷子愈傷組織中SOD、POD、CAT活性的影響Fig.3 Effects of sethoxydim stress on SOD, POD, CAT activity in millet callus

2.4 拿捕凈脅迫對谷子愈傷組織可溶性蛋白、可溶性糖和脯氨酸含量的影響

2.4.1 可溶性蛋白（SP）含量 不同濃度的拿捕凈處理對3種谷子愈傷組織中SP含量的影響不同（圖4-A）。晉谷21的SP含量隨著拿捕凈處理濃度的增高呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，當拿捕凈濃度為2 mL·L-1時，SP含量達到最高，隨后快速下降；冀谷42的SP含量隨著拿捕凈濃度的增高變化不顯著，在較高脅迫濃度時略有下降；而豫谷35的SP含量隨著拿捕凈濃度的增高持續(xù)上升，雖然達到最大值時的絕對含量仍低于晉谷21號，但與其對照相比，增幅顯著。

2.4.2 可溶性糖（SS）含量 不同濃度的拿捕凈處理對3種谷子愈傷組織中SS含量的影響不同（圖4-B）。晉谷21的SS含量隨著拿捕凈處理濃度的增高呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，當拿捕凈濃度為1 mL·L-1時，SS含量達到最高，之后含量持續(xù)降低；而豫谷35和冀谷42的SS含量隨著拿捕凈濃度的增高呈現(xiàn)先降低再增高再降低的波動趨勢，拿捕凈濃度低于2 mL·L-1時，SS含量均顯著低于晉谷21號，拿捕凈濃度大于1 mL·L-1后，冀谷42的SS含量則明顯高于晉谷21號。

2.4.3 脯氨酸（Pro）含量 由圖4-C可見，拿捕凈處理濃度為0.5 mL·L-1時，豫谷35愈傷組織中Pro含量顯著降低，在其他處理濃度下，豫谷35和晉谷21的變化趨勢和Pro含量接近，差異不大。而冀谷42愈傷組織中雖然Pro絕對含量低于前兩者，但與對照相比，隨拿捕凈處理濃度增加，Pro含量持續(xù)大幅增加。

圖4 拿捕凈脅迫對谷子愈傷組織中可溶性蛋白、可溶性糖、脯氨酸含量的影響Fig.4 Effects of sethoxydim stress on the content of soluble protein, soluble sugar,proline in millet callus

2.5 各項生理指標相關(guān)性分析

2.5.1 3個品種不同生理指標間的相關(guān)分析 分析比較3個品種谷子愈傷組織在拿捕凈脅迫下所測定的各生理指標之間的相關(guān)性可知，試驗中所測定的各項生理指標相關(guān)性在3個品種間有較大的差異（表1—表3）。晉谷21號的CAT和SOD活性呈極顯著負相關(guān)，豫谷35號的CAT和SOD活性呈顯著正相關(guān)，冀谷42號的CAT和SOD活性呈極顯著正相關(guān)。晉谷21號的SOD活性與O2-含量呈極顯著的負相關(guān)（r=0.655），豫谷35號的SOD活性與O2-含量呈極顯著的負相關(guān)（r=0.973），且豫谷35號SOD的活性明顯高于晉谷21號的活性，這與晉谷21和豫谷35活性變化趨勢一致。豫谷35號的可溶性蛋白含量與其他指標大多呈顯著性或極顯著相關(guān)，而晉谷21號以及冀谷42號的可溶性蛋白含量與其他8個指標相關(guān)性均不顯著，這也表現(xiàn)出3個品種對拿捕凈脅迫的響應(yīng)機制不同。

2.5.2 不同品種間各生理指標的相關(guān)分析 對所測得的9個生理生化指標，3個品種間兩兩進行相關(guān)性分析，結(jié)果表明，所測定的各項生理指標相關(guān)性在3個品種兩兩之間均有明顯差異（表4—表6）。晉谷21和豫谷35、冀谷42的9個測定指標之間多數(shù)成負相關(guān)，且多數(shù)指標之間的負相關(guān)性均達顯著或極顯著水平（表4和表5）?？梢姡貌秲裘{迫對晉谷21號和豫谷35、冀谷42生理生化指標的影響不盡相同。反映出3個品種在拿捕凈脅迫下細胞內(nèi)各種酶及滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)等作用的差異性及拿捕凈抗性的不同。豫谷35號和冀谷42號的9個測定指標的相關(guān)系數(shù)在0.006—0.880，2個品種谷子之間的O2-含量和可溶性蛋白含量呈負相關(guān)，反映出2個抗性品種對拿捕凈脅迫的響應(yīng)過程也不完全一致。

表1 晉谷21號谷子種子愈傷組織各項生理指標的相關(guān)分析Table 1 Correlation analysis of various physiological indexes of millet seed callus in Jingu 21

表2 豫谷35號谷子種子愈傷組織各項生理指標的相關(guān)分析Table 2 Correlation analysis of various physiological indexes of millet seed callus in Yugu 35

表3 冀谷42號谷子種子愈傷組織各項生理指標的相關(guān)分析Table 3 Correlation analysis of various physiological indexes of millet seed callus in Jigu 42

表4 拿捕凈脅迫下晉谷21號和豫谷35號生理生化指標的相關(guān)分析Table 4 Correlation analysis of various physiological indexes of millet seeds callus in Jingu 21 and Yugu 35

表5 拿捕凈脅迫下晉谷21號和冀谷42號生理生化指標的相關(guān)分析Table 5 Correlation analysis of various physiological indexes of millet seeds callus in Jingu 21 and Jigu 42

3 討論

3.1 除草劑拿捕凈脅迫對谷子愈傷組織的生理傷害

植物在受到各種逆境脅迫后，細胞中會產(chǎn)生大量活性氧，打破正常生長條件下植物體內(nèi)活性氧的產(chǎn)生和消除之間的動態(tài)平衡，導致植物細胞膜脂過氧化產(chǎn)生丙二醛（MDA），同時導致膜結(jié)構(gòu)被破壞，膜透性增強。因此，MDA含量及細胞膜相對透性是植物逆境脅迫下膜系統(tǒng)受傷害程度的重要指標[26]。本研究供試的3個谷子品種愈傷組織在拿捕凈脅迫下，MDA和O2-含量均隨脅迫濃度的增加而不斷增加，這與現(xiàn)有研究結(jié)果一致[27-29]。說明，適宜濃度除草劑處理對谷子的生理傷害較小，提高拿捕凈濃度則導致谷子愈傷組織細胞內(nèi)活性氧增加，引起細胞膜脂過氧化，造成MDA積累，并破壞膜結(jié)構(gòu)，傷害細胞。

3.2 除草劑拿捕凈脅迫下谷子生理生化響應(yīng)差異

MDA是膜脂過氧化的重要產(chǎn)物，其含量的變化反應(yīng)膜脂過氧化的程度，細胞膜相對透性反應(yīng)膜受傷害的程度，二者與植物的抗逆性呈負相關(guān)[28-29]。本研究發(fā)現(xiàn)隨著拿捕凈濃度的增高，3種谷子愈傷組織中MDA含量均呈現(xiàn)先降低后增高的趨勢，這與葉亞新等[30]研究除草劑脅迫下蘿卜幼苗內(nèi)MDA含量先增高后降低的趨勢不同，可能與不同植物有關(guān)。當拿捕凈濃度較低時，3種愈傷組織中MDA含量都有所降低，且在3個品種間差異不顯著，這說明低濃度的拿捕凈處理對愈傷組織細胞膜影響不大；提高拿捕凈處理濃度時，MDA、O2-含量隨之增高，膜透性增強，說明膜脂過氧化加劇，細胞膜出現(xiàn)明顯損傷，但豫谷35和冀谷42的MDA含量增長幅度明顯小于晉谷21號，這與SOD和POD活性的變化相協(xié)調(diào)。

植物體內(nèi)存在一個多種抗氧化酶相互協(xié)調(diào)作用的防御體系抑制活性氧對細胞產(chǎn)生的傷害，SOD、POD和CAT是其中重要的保護酶，它們活性的高低與植物的抗逆性有關(guān)[31-33]。本研究發(fā)現(xiàn)晉谷21號隨著拿捕凈濃度的增高SOD和POD活性均呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢，這與申建芳等[32]研究發(fā)現(xiàn)燕麥在除草劑脅迫下SOD和POD的變化趨勢一致，說明愈傷組織對拿捕凈脅迫作出的響應(yīng)，細胞內(nèi)過氧化產(chǎn)物（O2-，H2O2）增多，保護酶活性迅速升高，以除去過氧化產(chǎn)物，維持愈傷組織的正常生長；而豫谷35和冀谷42愈傷組織中SOD和POD活性均隨著拿捕凈濃度的增高而增高，且顯著高于晉谷21，這說明豫谷35和冀谷42愈傷組織的抗氧化能力強于晉谷21。3種愈傷組織中CAT活性隨著拿捕凈濃度的增高均呈現(xiàn)出先增高后降低的趨勢，與SOD和POD活性趨勢有所不同，這可能是由于不同谷子品種抗氧化酶體系中各指標的調(diào)節(jié)協(xié)同機制及響應(yīng)時間與變化程度存在差異。

SP、SS和Pro是細胞內(nèi)重要的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，對細胞的生物膜起到保護作用，是篩選植物抗性的指標[34-36]。研究發(fā)現(xiàn)，隨著拿捕凈濃度的增高晉谷21號愈傷組織中SP、SS和Pro含量均呈現(xiàn)先增高后降低的趨勢，這與宋惠潔等[28]研究的結(jié)果一致，而豫谷35和冀谷42愈傷組織中SP、SS和Pro含量隨著拿捕凈濃度的增高均呈現(xiàn)出不規(guī)則的變化趨勢，這說明細胞通過SP、SS和Pro的合成和降解來調(diào)控胞內(nèi)滲透勢的平衡。

3.3 谷子除草劑抗性的生理生化機理

本研究比較了對拿捕凈有不同感抗性的3個谷子品種愈傷組織在不同濃度拿撲凈脅迫下相關(guān)生理生化指標的變化。相較于敏感品種晉谷21，抗性品種豫谷35和冀谷42對拿捕凈脅迫的生理響應(yīng)一方面表現(xiàn)為受脅迫傷害程度較輕，脅迫后愈傷組織細胞中MDA和O2-積累量較敏感品種少，另一方面晉谷21受脅迫后積累更多的Pro和SP等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，以穩(wěn)定體內(nèi)滲壓平衡，增強細胞保水能力，維護和調(diào)節(jié)體內(nèi)的生理生化活動，降低拿捕凈脅迫對自身的傷害。另外，除草劑脅迫后，抗性品種的抗氧化防御系統(tǒng)的響應(yīng)水平高于敏感品種，其保護酶SOD、POD和CAT活性較敏感品種有明顯增強，以減輕或消除除草劑脅迫造成的膜脂過氧化傷害。本試驗結(jié)果對谷子抗除草劑脅迫機制研究及利用愈傷組織培養(yǎng)體系開展抗除草劑品種的離體篩選提供理論依據(jù)。

4 結(jié)論

谷子種子愈傷組織對除草劑的抗性與各種保護酶的活性及細胞內(nèi)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的含量有關(guān)?？鼓貌秲艄茸臃N子愈傷組織可以通過提高保護酶（SOD、POD等）的活性及調(diào)節(jié)滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)（可溶性蛋白等）含量來提高對除草劑的抗性。