玉米pTAC2影響苗期葉片葉綠素合成的轉(zhuǎn)錄組分析

張穩(wěn)，孟淑君，王琪月，萬(wàn)炯，馬拴紅，林源，丁冬，湯繼華

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院/省部共建小麥玉米作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，鄭州 450002）

0 引言

【研究意義】植物90%以上的干物質(zhì)是通過(guò)光合作用產(chǎn)生，且作物生物學(xué)產(chǎn)量主要來(lái)源于葉片的光合產(chǎn)物[1]。葉綠素含量是決定作物光合效率和生物學(xué)產(chǎn)量的重要因素[2]。光合作用在葉綠體（chloroplast）中進(jìn)行，除了進(jìn)行光合作用之外，葉綠體中還發(fā)生與植物生命活動(dòng)相關(guān)的代謝過(guò)程，如淀粉的合成和轉(zhuǎn)運(yùn)，葉綠素類(lèi)、細(xì)胞色素類(lèi)、蛋白質(zhì)等的合成[3]。葉綠素的合成是受核基因和質(zhì)體基因共同控制的復(fù)雜過(guò)程，其中，某些基因的突變會(huì)導(dǎo)致葉綠素合成減少，葉綠體發(fā)育受損，光合能力嚴(yán)重降低[4]。【前人研究進(jìn)展】質(zhì)體是植物細(xì)胞中的一種特定細(xì)胞器，負(fù)責(zé)光合作用，并參與植物生長(zhǎng)和發(fā)育[5-6]。質(zhì)體基因主要由2種RNA聚合酶轉(zhuǎn)錄，核編碼RNA聚合酶（nuclear gene-encoded RNA polymerase，NEP）和質(zhì)體編碼RNA聚合酶（plastid-encoded RNA polymerase，PEP）[7-8]。質(zhì)體基因至少有3種不同類(lèi)型的啟動(dòng)子，2種不同來(lái)源的RNA聚合酶分別識(shí)別對(duì)應(yīng)啟動(dòng)子調(diào)控基因的表達(dá)[9]?；趩?dòng)子的結(jié)構(gòu)，葉綠體基因可分為3類(lèi)：依賴(lài)PEP指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的基因，包括psaA、psbE、psbB、psaB、psbA、rbcL和petD等；依賴(lài)NEP指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的基因，包括rpoB、accD、rpoA、rpoB、rpoC1、rpoC2和Ycf2等；需要2種聚合酶共同指導(dǎo)轉(zhuǎn)錄的基因，包括ndhB、ndhF、clpP、atpB和atpE等[10]。NEP主要介導(dǎo)葉綠體發(fā)育早期持家基因的表達(dá)，包括PEP核心亞單位和參與質(zhì)體基本功能的基因；而PEP負(fù)責(zé)80%以上葉綠體基因的表達(dá)，它指導(dǎo)產(chǎn)生完全活躍葉綠體所需的光合基因的轉(zhuǎn)錄[11-12]。PEP核心蛋白質(zhì)有2種存在形式：可溶性RNA聚合酶復(fù)合物（soluble RNA polymerase，sRNAP）和轉(zhuǎn)錄激活染色體復(fù)合物（transcriptionally active chromosome，TAC）[13-15]。PFALZ等[15]從擬南芥（Arabidopsis thaliana）和芥菜（Sinapis alba）中鑒定出18個(gè)新的質(zhì)體轉(zhuǎn)錄激活染色體蛋白質(zhì)（plasid transcriptionally active chromosomes，pTACs），并對(duì)pTAC2、pTAC6和pTAC12等基因的缺失突變體進(jìn)行研究，證實(shí)這三個(gè)基因是維持PEP的轉(zhuǎn)錄活性所必需的。在擬南芥中，pTAC12不僅影響葉綠體基因的表達(dá)，還調(diào)節(jié)細(xì)胞核基因的表達(dá)，尤其是在光敏色素信號(hào)傳導(dǎo)中起作用[16]。擬南芥和芥菜中的鐵超氧化物歧化酶FSD2和FSD3均是TAC復(fù)合物的組分[15]。雙突變體fsd3-1fsd2-1表現(xiàn)為嚴(yán)重的白化表型，葉綠體嚴(yán)重受損，對(duì)氧化應(yīng)激高度敏感，F(xiàn)SD2和FSD3通過(guò)保護(hù)葉綠體免受ROS的作用，清除早期葉綠體發(fā)育中的ROS進(jìn)而維持葉綠體的正常發(fā)育[17]。擬南芥中AtpTAC4編碼32 kD囊泡誘導(dǎo)的葉綠體蛋白質(zhì)VIPP1，對(duì)類(lèi)囊體的形成至關(guān)重要[18]。MARéCHAL等[19]報(bào)道了擬南芥中TAC復(fù)合物2種組分pTAC1/AtWhy1和pTAC11/AtWhy3，編碼這兩個(gè)蛋白基因的突變會(huì)造成葉綠體基因組的異常重組，導(dǎo)致葉綠體發(fā)育異常，表現(xiàn)為白化或幼苗致死。對(duì)擬南芥AtpTAC14的敲除導(dǎo)致在葉綠體發(fā)育的初期類(lèi)囊體形成受阻，造成苗期白化致死；同時(shí)AtpTAC14可與AtpTAC12形成復(fù)合體，作為光敏色素依賴(lài)性光信號(hào)調(diào)節(jié)葉綠體基因表達(dá)[20]。pTAC3在轉(zhuǎn)錄的起始，延伸和終止期間與PEP形成復(fù)合物，對(duì)質(zhì)體PEP活性和葉綠素的合成是必需的[21]。擬南芥中AtpTAC7通過(guò)與4種pTACs組分FLN1、TAC10、TAC12和TAC14相互作用，在調(diào)節(jié)PEP依賴(lài)性葉綠體基因表達(dá)和葉綠體發(fā)育中起重要作用[22]。在水稻中對(duì)OsTRXz進(jìn)行定點(diǎn)敲除，OsTRXz功能的缺失會(huì)造成水稻葉綠體的生物合成受阻，依賴(lài)PEP轉(zhuǎn)錄和翻譯基因被嚴(yán)重抑制，OsTRXz與OsFLN1、OsHSA1相互作用，共同參與組成PEP復(fù)合物的形成，在水稻葉綠體基因的轉(zhuǎn)錄及葉綠體合成過(guò)程中必不可少[23]。在水稻葉色突變體中，葉綠素代謝異常通常會(huì)導(dǎo)致葉片黃化或滯綠的表型，如nyc1[24]和pao、rccr1[25]等突變體；而白化表型通常是由于葉綠體發(fā)育的異常造成的，如swl1[26]和al1[27]突變體。水稻中OspTAC2定位于葉綠體中，在osptac2純合突變體中葉綠體發(fā)育受損，葉綠素合成受阻。且PEP（質(zhì)體編碼RNA聚合酶）依賴(lài)性基因的轉(zhuǎn)錄水平在突變體中較CK顯著降低，而NEP（核編碼RNA聚合酶）依賴(lài)性基因的轉(zhuǎn)錄水平顯著增加。表明OspTAC2在葉綠體發(fā)育和葉綠素合成中起關(guān)鍵作用，并表明OspTAC2的分子功能在水稻和擬南芥中是保守的[28]。【本研究切入點(diǎn)】雖然pTACs復(fù)合物各成員在擬南芥中報(bào)道較多，但在大田作物（包括玉米）中的研究仍然較為欠缺。ZmpTAC2經(jīng)鑒定是擬南芥和水稻質(zhì)體轉(zhuǎn)錄活性染色體蛋白2（pTAC2）基因的直系同源基因，利用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)ZmpTAC2進(jìn)行定點(diǎn)突變，轉(zhuǎn)基因純合突變單株表型為葉片白化并且苗期致死，體內(nèi)葉綠素含量較CK顯著降低，葉綠素合成途徑受阻且葉綠體發(fā)育缺陷。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】本研究以白化表型的CRISPR/Cas9-ZmpTAC2轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性純合突變材料（zmptac2）為研究對(duì)象，對(duì)CK和zmptac2幼苗時(shí)期葉片取樣進(jìn)行RNA-seq研究，利用qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果，并結(jié)合葉綠素含量測(cè)定及酵母雙雜交等技術(shù)，篩選和鑒定參與葉綠素合成的相關(guān)基因。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以玉米自交系KN5585為背景材料，利用未米生物科技（江蘇）有限公司開(kāi)發(fā)的高通量CRISPR/Cas9靶點(diǎn)設(shè)計(jì)程序，對(duì)ZmpTAC2（Zm00001d022599）的第一個(gè)外顯子上ATG下游1 319 bp的PPR結(jié)構(gòu)域上設(shè)計(jì)了2個(gè)相距136 bp的編輯靶位點(diǎn)。構(gòu)建目的載體CRISPR/Cas9-ZmpTAC2，運(yùn)用農(nóng)桿菌侵染的方法導(dǎo)入玉米自交系KN5585中。轉(zhuǎn)基因后共獲得15個(gè)獨(dú)立T0轉(zhuǎn)基因苗，其中，葉片表現(xiàn)為正常綠色7株，白化表型8株。

1.2 轉(zhuǎn)基因株系陽(yáng)性鑒定

采用CTAB法提取基因組DNA[29]，利用引物（JC-F：5′-CCGTGTCCTGCTCGATTT-3′和JC-R：5′-CTTCCTGCATACCGAGAAGGT-3′）檢測(cè)轉(zhuǎn)基因材料的編輯情況。PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃ 3 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 8 min。將PCR產(chǎn)物送北京擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，并分析測(cè)序結(jié)果。

1.3 潛在脫靶位點(diǎn)分析

使用CRISPR RGEN Tools（http://www.rgenome.net/cas-offinder/）在線BLAST工具，將ZmpTAC2靶序列在玉米全基因組中進(jìn)行比對(duì)，選取與靶序列同源性較高、錯(cuò)配≤4 bp，且具有PAM序列NGG的位點(diǎn)作為潛在脫靶序列，通過(guò)單克隆測(cè)序評(píng)估其脫靶效應(yīng)。

1.4 zmptac2突變體的葉綠體超微結(jié)構(gòu)觀察

參考文獻(xiàn)[30]制作葉片的透射電鏡樣品。去除幼苗葉脈，切成2 mm×2 mm的小片，立即放入2.5%戊二醛（pH=7.4）中，抽真空30 min使葉片完全下沉后，室溫放置2 h，4℃過(guò)夜；PBS緩沖液室溫固定5 h；用不同濃度無(wú)水乙醇/丙酮溶液梯度脫水；酮/812包埋劑包埋64 h；使用超薄切片機(jī)制備60—80 nm超薄切片之后鈾鉛雙染色，使用HITACHI HT7700型透射電子顯微鏡觀察、拍照（武漢賽維爾生物科技有限公司）。

1.5 葉綠素含量的測(cè)定

根據(jù)先前報(bào)道的分光光度法測(cè)定光合色素含量[31]。切下葉片（約0.2 g鮮重），并在1 mL 100%丙酮中均化，用80%丙酮處理葉片。使用UV-2000分光光度計(jì)（尤尼龍，UV-2000），在663 nm和645 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光值，按照下列公式計(jì)算葉綠素含量。

葉綠素a含量（mg·g-1）= (12.72A663-2.59A645)×Vs×稀釋倍數(shù)/Fw；

葉綠素b含量（mg·g-1）=(22.88A645-4.67A663)×Vs×稀釋倍數(shù)/Fw；

葉綠素總含量（mg·g-1）=葉綠素a含量+葉綠素b含量。

式中，F(xiàn)w（fresh weight）為樣品鮮重；Vs為提取液總體積（mL）。

1.6 苗期葉片RNA提取、轉(zhuǎn)錄組建庫(kù)及測(cè)序

使用TRIzol試劑（Invitrogen，USA）提取幼苗葉片總RNA，并用不含RNase的DNA酶I（TaKaRa，Japan）處理，以獲得純凈RNA。使用NanoDrop One檢測(cè)RNA濃度，并用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)所提取RNA的質(zhì)量，同時(shí)用Agilent 2100檢測(cè)28S/18S以及RIN值。根據(jù)Illumina標(biāo)準(zhǔn)RNA-seq文庫(kù)構(gòu)建試劑盒構(gòu)建鏈特異性文庫(kù)，使用雙端測(cè)序方法進(jìn)行測(cè)序（北京貝瑞和康生物科技有限公司）。

1.7 測(cè)序結(jié)果分析

測(cè)序得到原始數(shù)據(jù)后使用FastQC[32]進(jìn)行質(zhì)控，根據(jù)質(zhì)控結(jié)果，使用Trimmomatic[33]進(jìn)行過(guò)濾。以B73_V4基因組為參考（B73 AGPv4，ftp://ftp.ensemblgenomes.org/pub/plants/release-42/fasta/zea_mays/dna/），使用HiSat2[34]軟件將過(guò)濾后的數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，reads的統(tǒng)計(jì)使用featureCounts[35]軟件。使用R軟件包DESeq2[34]進(jìn)行基因的差異表達(dá)分析，其中p.adjust≤0.01及表達(dá)差異倍數(shù)大于2的基因認(rèn)為是差異表達(dá)基因（DEGs）。利用R軟件包中的Cluster Profiler[36]進(jìn)行差異基因的GO富集及KEGG富集分析。

1.8 qRT-PCR驗(yàn)證

選擇15個(gè)差異表達(dá)的基因進(jìn)行qRT-PCR驗(yàn)證。以CK和zmptac2的葉片總RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈，使用NCBI Primer Blast在線設(shè)計(jì)qRT-RCR反應(yīng)基因特異引物（電子附表1）。cDNA反轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR反應(yīng)體系及反應(yīng)程序按照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（TaKaRa）和TB GreenTM Premix Ex TaqTM Ⅱ（TaKaRa）試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，每個(gè)試驗(yàn)均設(shè)3個(gè)生物學(xué)重復(fù)和3個(gè)技術(shù)重復(fù)。以Zm-β-actin作為內(nèi)參基因，利用2-ΔΔCt法[37]分析基因相對(duì)表達(dá)水平。

1.9 酵母單雜交轉(zhuǎn)錄激活活性分析

按照YE等[38]改進(jìn)的方法進(jìn)行轉(zhuǎn)錄激活活性分析。將含有pG221質(zhì)粒的酵母菌株EGY48接進(jìn)50 mL SD/-Ura培養(yǎng)基中，30℃，220 r/min培養(yǎng)16—20 h測(cè)A600=1.6—2.0，轉(zhuǎn)接OD600=0.2—0.3，30℃，220 r/min 2.5—3.5 h，使終濃度OD600=0.4—0.6，取菌液制作酵母感受態(tài)，將pGBKT7-ZmpTAC2和pGBKT7-ZmpTAC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)，涂SD/-Trp/-Ura培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)2—3 d，將長(zhǎng)出的酵母菌落在SD/-Trp/-Ura+X-gal顯色平板上劃線，30℃培養(yǎng)2 d后觀察顯色情況。

1.10 ZmpTAC2互作蛋白捕捉

使用酵母雙雜交系統(tǒng)探究ZmpTAC2蛋白質(zhì)的互作蛋白。以B73葉片cDNA為模板，PCR擴(kuò)增獲得ZmpTAC2的全長(zhǎng)序列，并將此序列與PGBKT7載體連接構(gòu)建pGBKT7-ZmpTAC2為誘餌載體，轉(zhuǎn)化Y2HGold菌株。驗(yàn)證誘餌蛋白ZmpTAC2的毒性及誘餌載體pGBKT7-ZmpTAC2的自激活特性。將含有pGBKT7-ZmpTAC2的酵母Y2HGold與含有玉米cDNA文庫(kù)的質(zhì)粒用共轉(zhuǎn)的方法進(jìn)行雜交。在SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培養(yǎng)基上篩選，用pGBKT7-AD通用引物pGADT7-F：5′-TAATACGACTCACTATAG GG-3′和pGADT7-R：5′-AGATGGTGCACGATGCAC AG-3′進(jìn)行菌液PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增獲得的PCR片段送交北京擎科生物技術(shù)有限公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果使用NCBI BLAST進(jìn)行比對(duì)分析，挑選候選基因進(jìn)行點(diǎn)對(duì)點(diǎn)回轉(zhuǎn)驗(yàn)證。

2 結(jié)果

2.1 zmptac2表型及轉(zhuǎn)基因植株陽(yáng)性編輯情況

對(duì)獲得的15株T0幼苗進(jìn)行轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性鑒定，發(fā)現(xiàn)7株綠色幼苗中有3株為轉(zhuǎn)基因陰性，4株為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性；8株白化幼苗全部表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性。對(duì)12株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性材料使用特異引物對(duì)含有雙靶點(diǎn)的序列進(jìn)行克隆和靶位點(diǎn)編輯檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性綠色幼苗中2株為未編輯，2株為雜合編輯突變，8株白化幼苗為純合編輯突變，共包含多堿基位點(diǎn)編輯（5株）、158—165 bp的大片段的缺失（4株）及倒位片段重連接（1株）等多種不同編輯導(dǎo)致的突變方式（圖1-B，電子附圖1）。對(duì)轉(zhuǎn)基因陰性材料命名為CK，白化表型且純合編輯的8株突變材料命名為zmptac2（圖1-A）。其中，白化表型的zmptac2-1缺失165 bp、zmptac2-2缺失163 bp、zmptac-3缺失161 bp、zmptac-4缺失158 bp，造成ZmpTAC2蛋白質(zhì)翻譯提前終止；zmptac2-5在靶位點(diǎn)1缺失1 bp，在靶位點(diǎn)2缺失3 bp；zmptac2-6在兩靶位點(diǎn)間存在163 bp長(zhǎng)片段的倒位（圖1-B）。將zmptac2-1、zmptac2-2用于后續(xù)的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。RNA-seq結(jié)果顯示，zmptac2突變體中ZmpTAC2表達(dá)量顯著降低（CK：3 395.3 RPM，zmptac2：363.2 RPM）。利用qRT-PCR技術(shù)，測(cè)定CK與zmptac2中ZmpTAC2的相對(duì)表達(dá)量。結(jié)果顯示，突變體中ZmpTAC2表達(dá)量顯著降低，這與轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果一致。

2.2 zmptac2突變體脫靶效應(yīng)評(píng)估

CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯的主要取決于sgRNA序列的特異性識(shí)別，但由于高等生物基因組較大且較為復(fù)雜，sgRNA可能會(huì)與非靶點(diǎn)DNA序列發(fā)生局部錯(cuò)配，造成CRISPR/Cas9系統(tǒng)基因編輯的脫靶。因此，需要對(duì)ZmpTAC2突變體脫靶效應(yīng)進(jìn)行評(píng)估，選取玉米基因組中與2個(gè)sgRNA序列錯(cuò)配堿基數(shù)在4 bp以?xún)?nèi)且具有PAM序列的位點(diǎn)作為潛在脫靶位點(diǎn)，每個(gè)靶位點(diǎn)選取3個(gè)，共6個(gè)（表1），使用NCBI Primer Blast在線設(shè)計(jì)檢測(cè)引物（電子附表1）。所選取的8個(gè)突變單株的6個(gè)潛在脫靶，這6個(gè)潛在脫靶位點(diǎn)在T0均未產(chǎn)生脫靶效應(yīng)（電子附圖2），表明所設(shè)計(jì)的sgRNA序列具有較高的特異性。

2.3 zmptac2突變體的葉綠體超微結(jié)構(gòu)及葉綠素含量測(cè)定

利用透射電鏡觀察了對(duì)照（CK）和突變體（zmptac2）幼葉的葉綠體超微結(jié)構(gòu)結(jié)果（圖2-A）。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因陰性（CK）具有完整的葉綠體結(jié)構(gòu)，基粒類(lèi)囊體折疊整齊而致密，而zmptac2突變體幼葉的葉綠體內(nèi)基粒類(lèi)囊體基粒數(shù)目明顯少，且排列不規(guī)則，基質(zhì)片層清晰可見(jiàn)，質(zhì)體小球數(shù)目增多，表明葉綠體異常發(fā)育。由此推斷突變體zmptac2的白化表型可能是通過(guò)葉綠體的異常發(fā)育而造成的。

針對(duì)白化表型，對(duì)CK和zmptac2突變體中葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素含量進(jìn)行了測(cè)定分析。結(jié)果顯示，與CK相比zmptac2中葉綠素a、葉綠素b及總?cè)~綠素含量顯著降低（圖2-B）。

圖1 CK與zmptac2的表型鑒定及靶位點(diǎn)檢測(cè)Fig.1 Phenotypic identification and target site detection of CK and zmptac2

表1 CRISPR/Cas9系統(tǒng)潛在脫靶位點(diǎn)突變檢測(cè)Table 1 Mutations detected in the putative CRISPR/Cas9 off-target sites

2.4 CK與zmptac2幼苗葉片轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量分析

選取CK材料苗期葉片2份和zmptac2的純合突變材料（圖1，zmptac2-1和zmptac2-2）苗期葉片2份用于RNA提取及后續(xù)測(cè)序。所測(cè)數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)嚴(yán)格的質(zhì)控后，產(chǎn)生0.48億對(duì)雙末端序列，共計(jì)45.3 Gb的序列數(shù)據(jù)。所測(cè)樣品Q(chēng)30比例均超過(guò)90%，GC含量均低于50%，比對(duì)到參考基因組的比例均在95%以上，結(jié)合以上數(shù)據(jù)可以說(shuō)明轉(zhuǎn)錄組測(cè)序質(zhì)量較高，符合進(jìn)一步的生物信息學(xué)分析要求（表2）。

表2 測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析Table 2 Output statistics of sequencing analysis

2.5 差異表基因的表達(dá)分析及GO功能富集分析

使用p.adjust≤0.01和差異倍數(shù)大于2倍以上為差異表達(dá)基因篩選的閾值。在zmptac2-vs-CK中共檢測(cè)到1 367個(gè)差異表達(dá)基因，其中618個(gè)基因上調(diào)表達(dá)，749個(gè)基因下調(diào)表達(dá)（電子附表2和電子附表3）。對(duì)1 367個(gè)差異表達(dá)基因做GO（gene ontology）注釋?zhuān)凑栈虻募?xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）及參與的生物學(xué)過(guò)程（biological process，BP）進(jìn)行分類(lèi)統(tǒng)計(jì)。對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析，共得到次級(jí)分支45個(gè)，其中，生物學(xué)過(guò)程含有16個(gè)次級(jí)分支，分子功能含有12個(gè)次級(jí)分支，細(xì)胞組分含有17個(gè)次級(jí)分支（這里僅展示前22條，圖3）。

圖3 差異表達(dá)基因GO富集分析Fig.3 Analysis of differentially expressed genes in GO enrichment

根據(jù)GO注釋結(jié)果，上調(diào)表達(dá)的基因主要富集在細(xì)胞周期過(guò)程的調(diào)節(jié)、細(xì)胞修飾的氨基酸代謝過(guò)程的調(diào)節(jié)等過(guò)程。下調(diào)表達(dá)的基因主要富集質(zhì)體基質(zhì)（20個(gè)）、葉綠體基質(zhì)（20個(gè)）、葉綠體（51個(gè)）和質(zhì)體（51個(gè)）等細(xì)胞組分，表明ZmpTAC2主要通過(guò)調(diào)控葉綠體相關(guān)途徑來(lái)調(diào)節(jié)葉綠素的合成途徑。

2.6 差異表達(dá)基因Pathway富集分析

對(duì)差異表達(dá)的1 367個(gè)基因進(jìn)行生物學(xué)代謝途徑（pathway）富集分析，差異基因主要富集在13個(gè)代謝途徑上（圖4）。其中上調(diào)基因主要富集在谷胱甘肽代謝途徑（glutathione metabolism）、色氨酸生物合成（tryptophan biosynthesis）等途徑（圖4-A）；下調(diào)基因主要富集在苯丙氨酸代謝（phenylalanine metabolism）、酪氨酸代謝（tyrosine metabolism）和異喹啉生物堿生物合成（isoquinoline alkaloid biosynthesis）等多種氨基酸代謝途徑（圖4-B）。

2.7 qRT-PCR驗(yàn)證

根據(jù)差異表達(dá)的顯著性及差異表達(dá)基因的功能，挑選15個(gè)差異表達(dá)基因（表3）進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR以驗(yàn)證RNA測(cè)序數(shù)據(jù)的準(zhǔn)確性。qRT-PCR結(jié)果顯示（圖5），這些差異基因在CK與zmptac2材料間的表達(dá)模式均與測(cè)序數(shù)據(jù)相一致，表明RNA-seq測(cè)序結(jié)果是可靠的。

圖4 差異表達(dá)基因KEGG富集分析Fig.4 KEGG enrichment analysis of differentially expressed genes

圖5 zmptac2與CK差異基因的qRT-PCR表達(dá)分析Fig.5 qRT-PCR expression analysis of zmptac2 and CK differential genes

表3 qRT-PCR驗(yàn)證的差異表達(dá)基因Table 3 Differentially expressed genes verified by qRT-PCR

在擬南芥中，已經(jīng)證實(shí)OspTAC2功能缺失時(shí)會(huì)造成PEP活性降低，進(jìn)而引起PEP轉(zhuǎn)錄的質(zhì)體基因表達(dá)降低，同時(shí)促進(jìn)核編碼的RNA聚合酶（NEP）轉(zhuǎn)錄基因的表達(dá)[24]。據(jù)此推測(cè)ZmpTAC2也參與調(diào)控玉米PEP的活性，進(jìn)而影響玉米葉綠體基因的轉(zhuǎn)錄。為了驗(yàn)證這一推測(cè)，在ZmpTAC2轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性株中，對(duì)PEP轉(zhuǎn)錄相關(guān)基因的表達(dá)量進(jìn)行了檢測(cè)。選擇PEP依賴(lài)的基因rbcL、psa A、psbA、psaB和psbK，以及NEP依賴(lài)的基因rpoA、rpoB、rpoC1和rpoC2進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定。結(jié)果顯示，與CK相比，zmptac2中對(duì)PEP依賴(lài)的基因在RNA水平上表達(dá)量顯著降低（圖6-A），而NEP依賴(lài)的基因表達(dá)量則顯著上升（圖6-B）。說(shuō)明ZmpTAC2對(duì)依賴(lài)PEP基因的轉(zhuǎn)錄具有直接影響，而對(duì)依賴(lài)NEP基因的轉(zhuǎn)錄似乎存在反饋調(diào)控。

2.8 酵母雙雜及轉(zhuǎn)錄激活活性分析

為進(jìn)一步研究ZmpTAC2在玉米細(xì)胞內(nèi)的功能，通過(guò)篩選相互作用蛋白，找到了與ZmpTAC2共同調(diào)控葉綠體發(fā)育和葉綠素合成的蛋白。通過(guò)驗(yàn)證，在SD/-Trp培養(yǎng)基上誘餌蛋白ZmpTAC2生長(zhǎng)良好，無(wú)毒性（圖7-B）；pGADT7+pGBKT7-ZmpTAC2在SD/-Trp/-Leu/-His和SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade上無(wú)法生長(zhǎng)，證明誘餌載體pGBKT7-ZmpTAC2無(wú)自激活（圖7-C）。確定誘餌載體pGBKT7-ZmpTAC2可以用于直接與玉米cDNA文庫(kù)雜交。通過(guò)篩選，共獲得了120個(gè)陽(yáng)性克隆。對(duì)陽(yáng)性克隆進(jìn)行菌落PCR的鑒定，隨后在NCBI BLAST上進(jìn)行序列比對(duì)。去除發(fā)生移碼突變的基因及未注釋的基因，共得到32個(gè)可能與pTAC2互作的蛋白（表4）。進(jìn)一步分析這些基因，發(fā)現(xiàn)其中16個(gè)為核基因編碼蛋白，10個(gè)為葉綠體基因編碼蛋白。例如核編碼的ZmpTAC3、α/β水解酶、histone H2A和CPN60等基因；葉綠體編碼的CRS1、ATP-dependent DNA helicase等基因。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組分析，將ZmpTAC3（Zm00001d032790）、CPN60（Zm00001d038857）和ATP-dependent DNA helicase（Zm00001d007417）定為候選基因進(jìn)行點(diǎn)對(duì)點(diǎn)驗(yàn)證。結(jié)果表明，ZmpTAC2和ZmpTAC3在酵母系統(tǒng)中存在互作（圖7-D）。

表4 酵母雙雜篩庫(kù)獲得ZmpTAC2的互作蛋白質(zhì)Table 4 Yeast two-hybrid system sieve library obtains ZmpTAC2 inter-made proteins

將pG221（表達(dá)GAL4結(jié)合結(jié)構(gòu)域）與ZmpTAC2和ZmpTAC3的融合蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)入酵母中，發(fā)現(xiàn)ZmpTAC2和ZmpTAC3各自并不能使GAL4順式序列調(diào)控下的報(bào)告基因LacZ得到表達(dá)形成藍(lán)色菌落（圖7-A）。證明ZmpTAC2和ZmpTAC3蛋白在酵母中不具有轉(zhuǎn)錄激活活性。初步說(shuō)明葉綠素的合成需要質(zhì)體基因間及質(zhì)體基因組和核基因組之間的相互協(xié)調(diào)作用。

圖6 zmptac2突變體內(nèi)依賴(lài)PEP和NEP的相關(guān)基因相對(duì)表達(dá)量Fig.6 zmptac2 mutations in the body rely on PEP, NEP related gene relative expression

圖7 轉(zhuǎn)錄激活分析及互作蛋白篩選Fig.7 Transcriptional activation analysis and interaction protein screening

3 討論

已有大量研究證明大部分白化和幼苗致死突變體在葉綠體發(fā)育或葉綠素合成等方面存在缺陷，這表明葉綠素合成對(duì)植物生長(zhǎng)和發(fā)育至關(guān)重要[39-40]。在本研究中，ZmpTAC2純合突變轉(zhuǎn)基因材料，顯示出白化表型，白化苗不能正常存活，苗期死亡。當(dāng)ZmpTAC2功能缺失時(shí)，zmptac2純合突變轉(zhuǎn)基因材料的總?cè)~綠素、葉綠素a和葉綠素b的含量較CK顯著降低（圖2）。這表明白化表型是由ZmpTAC2突變引起的，ZmpTAC2是葉綠素合成和正常植物生長(zhǎng)所必需的。這些結(jié)果與其他植物中報(bào)道的TAC相關(guān)突變體相似[24]。ZmpTAC2是水稻和擬南芥pTAC2的同源基因（80%和50%氨基酸同一性），且和水稻、擬南芥ptac2突變體有相似的表型，這表明pTAC2基因的分子功能在玉米、水稻和擬南芥之間是保守的。此外，ZmpTAC2與其在其他植物物種中的同源基因的氨基酸序列比對(duì)及系統(tǒng)發(fā)育分析表明ZmpTAC2在高等植物中是進(jìn)化上保守的（電子附圖3）。

對(duì)ZmpTAC2定點(diǎn)編輯后，白色表型材料為編輯陽(yáng)性純合突變。經(jīng)靶點(diǎn)檢測(cè)分析結(jié)果表明，編輯主要為3種狀態(tài)（圖1-B），第一種為2個(gè)靶位點(diǎn)間存在約150 bp左右的長(zhǎng)片段缺失，造成ZmpTAC2蛋白質(zhì)翻譯提前終止；第二種為第一個(gè)靶點(diǎn)單堿基缺失，第二個(gè)靶點(diǎn)缺失4個(gè)堿基；第三種為兩靶點(diǎn)間片段倒位重連。這些編輯均造成了白化表型。在ZmpTAC2的相同基因區(qū)域發(fā)生這些不同類(lèi)型的編輯，說(shuō)明利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯可獲得不同的編輯效果。包括兩個(gè)靶位點(diǎn)間的片段缺失（圖1-B，zmptac2-1、zmptac2-2、zmptac2-3和zmptac2-4），是由Cas9蛋白對(duì)2個(gè)靶位點(diǎn)PAM序列同時(shí)編輯所致；2個(gè)靶位點(diǎn)分別編輯（圖1-B，zmptac2-5），說(shuō)明發(fā)生在2個(gè)位點(diǎn)的編輯事件是相對(duì)獨(dú)立發(fā)生的；2個(gè)靶位點(diǎn)之間片段的倒位在1個(gè)編輯陽(yáng)性事件中被檢測(cè)到（圖1-B，zmptac2-6），說(shuō)明在2個(gè)靶位點(diǎn)間發(fā)生剪切后產(chǎn)生的DNA片段可用作斷裂DNA雙鏈修復(fù)的原料。綜上，在使用CRISPR/Cas9系統(tǒng)進(jìn)行基因編輯時(shí)，使用目標(biāo)基因內(nèi)相近（100—200 bp）外顯子區(qū)域的2個(gè)靶位點(diǎn)可增加陽(yáng)性編輯事件產(chǎn)生的類(lèi)型，進(jìn)而提高編輯效率。

根據(jù)GO富集分析及KEGG富集分析，下調(diào)基因GO注釋富集在質(zhì)體中；KEGG注釋顯示下調(diào)基因在苯丙氨酸代謝、酪氨酸代謝顯著富集（圖3和圖4；電子附表2和電子附表3），與葉綠體、類(lèi)囊體，PSⅠ和PSⅡ及DNA結(jié)合蛋白有關(guān)。苯丙氨酸在人體相關(guān)酶的作用下，可以轉(zhuǎn)化成酪氨酸。若苯丙氨酸和酪氨酸代謝異常，則會(huì)產(chǎn)生白化病[41]。RNA-seq測(cè)序發(fā)現(xiàn)，CtpA3、RPS4A等在白化材料中的表達(dá)量顯著高于CK。利用qRT-PCR技術(shù)驗(yàn)證測(cè)序的表達(dá)模式，證明這些基因在zmptac2突變體中較CK表達(dá)量顯著上調(diào)，且差異倍數(shù)較大。NAKAMURA等[42]研究表明，光合相關(guān)基因的調(diào)控基因glk突變，葉綠素合成及葉綠體發(fā)育受到影響，導(dǎo)致植株光合效率降低。擬南芥中調(diào)控葉綠素合成HEMA1的基因突變，導(dǎo)致葉綠素合成過(guò)程中鎂離子結(jié)合效率降低，光合效率下降[43]。核糖體蛋白（RPs）在核糖體生物合成和蛋白質(zhì)合成中是必不可少的，并且在多種發(fā)育過(guò)程中起關(guān)鍵作用[44]。核糖體蛋白S4（ribosomal protein small subunit 4，RPS4）在原核生物和植物葉綠體的核糖體30S小亞基形成起始過(guò)程中起重要作用；在植物體中，該蛋白由葉綠體rps4編碼[45]。CtpA是D1蛋白的羧基末端加工蛋白酶，在菠菜和大麥中CtpA由單拷貝核基因編碼，CtpA蛋白僅在黃化材料中檢測(cè)到，且定位于類(lèi)囊體腔中[46]。本研究zmptac2突變體中光合作用相關(guān)基因CtpA、psb1和RPS4的表達(dá)量顯著高于CK，而葉綠素的合成依然受阻。說(shuō)明ZmpTAC2與Psb位于葉綠素合成的不同代謝途徑，zmptac2突變直接影響葉綠素的合成，導(dǎo)致白化葉片表型；而葉綠素合成受阻作為一種反饋信號(hào)，誘導(dǎo)了CtpA、psb1和RPS4等基因的表達(dá)。

本研究中，Cyc基因家族中多個(gè)成員、Histone及ClpC1在zmptac2突變體中較CK顯著下調(diào)。細(xì)胞分裂是所有生命體的基本特征之一，在植物生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮著極其重要的作用[47]。細(xì)胞周期是細(xì)胞生命活動(dòng)的重要過(guò)程，細(xì)胞周期和生長(zhǎng)調(diào)控均取決于一類(lèi)重要的細(xì)胞分裂調(diào)控因子-細(xì)胞周期蛋白（Cyclin）。如果細(xì)胞周期調(diào)控異常，細(xì)胞將進(jìn)入病理狀態(tài)，甚至死亡[48]。細(xì)胞周期蛋白cyclin B1與細(xì)胞周期蛋白依賴(lài)性蛋白激酶（cyclin-dependent protein kinases，CDKs）結(jié)合，通過(guò)磷酸化調(diào)節(jié)多種蛋白的活性與分布而參與紡錘體的形成和染色體的分離[49]。Cyclin A2型細(xì)胞周期蛋白，有助于微調(diào)植物發(fā)育過(guò)程中的局部增殖。CYCA2的轉(zhuǎn)錄下調(diào)代表了在植物發(fā)育過(guò)程中協(xié)調(diào)增殖的關(guān)鍵機(jī)制[50]。ClpPRS復(fù)合物是葉綠體生物發(fā)生，類(lèi)囊體蛋白穩(wěn)態(tài)和植物發(fā)育的核心[51]。CLP蛋白酶是ATP依賴(lài)性酪蛋白溶解蛋白酶，ClpC1可以促進(jìn)蛋白酶復(fù)合物活性、葉綠體前蛋白的易位并介導(dǎo)蛋白質(zhì)降解[52]。蛋白質(zhì)組學(xué)分析表明clpc1中光系統(tǒng)蛋白質(zhì)豐度降低，而Hsp70、Cpn60和一些RNA結(jié)合蛋白上調(diào)。擬南芥中ClpC1定位在類(lèi)囊體表面，ClpC1突變后導(dǎo)致葉片褪綠和延遲生長(zhǎng)[53]。本文中突變體表現(xiàn)為白化表型，葉綠體發(fā)育異常，葉綠素含量降低，ClpC1和CPN60顯著降低。本研究在轉(zhuǎn)錄組測(cè)序數(shù)據(jù)中檢測(cè)到zmptac2突變體中與細(xì)胞分裂相關(guān)的Cyclin、與染色質(zhì)重塑相關(guān)的Histone及與葉綠體發(fā)育相關(guān)的ClpC1均較CK表達(dá)量降低。該結(jié)果暗示在突變體中，也許染色質(zhì)趨于開(kāi)放，細(xì)胞周期的異常，導(dǎo)致細(xì)胞分裂嚴(yán)重受阻，這可能是造成突變體葉綠體發(fā)育異常表型的部分原因。

4 結(jié)論

ZmpTAC2定點(diǎn)編輯的陽(yáng)性純合單株表現(xiàn)出嚴(yán)重的白化且幼苗致死；編輯陽(yáng)性單株葉綠體發(fā)育異常，葉綠素含量顯著降低；依賴(lài)PEP轉(zhuǎn)錄的基因表達(dá)量顯著降低。ZmpTAC2是玉米葉綠素合成的重要調(diào)節(jié)基因，且是通過(guò)調(diào)控PEP相關(guān)基因表達(dá)而實(shí)現(xiàn)的。