脫落酸代謝與信號(hào)傳遞及其調(diào)控種子休眠與萌發(fā)的分子機(jī)制

宋松泉，劉軍，徐恒恒，劉旭，黃薈

（1中國(guó)科學(xué)院植物研究所，北京100093；2廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)生物基因研究中心，廣州 510640；3中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物科學(xué)研究所，北京100081；4懷化學(xué)院民族藥用植物資源研究與利用湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/生物與食品工程學(xué)院，湖南懷化418008）

植物通過(guò)長(zhǎng)期不斷地進(jìn)化來(lái)調(diào)控種子的休眠與萌發(fā)，以確保其在不同的自然環(huán)境條件下萌發(fā)和形成幼苗。休眠（dormancy）是指在合適的條件下種子暫時(shí)不能完成萌發(fā)[1]。在許多植物中，特別是一年生的種子植物，種子休眠對(duì)植物的生存與傳播起關(guān)鍵作用，因?yàn)樗荒苁狗N子在環(huán)境條件合適時(shí)萌發(fā)[2-4]。深休眠阻止種子迅速整齊地萌發(fā)，給引種馴化帶來(lái)困難，嚴(yán)重影響植物的生長(zhǎng)發(fā)育與產(chǎn)量；相反，在許多禾谷類作物中，例如水稻（Oryza sativa）、小麥（Triticum aestivum）和玉米（Zea mays），由于長(zhǎng)期的育種選擇，種子的休眠特性被選擇性地喪失，從而導(dǎo)致收獲前成熟種子在適溫和潮濕的條件下在母體植株上迅速發(fā)芽，造成農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中產(chǎn)量和質(zhì)量的巨大損失[5-6]。GUBLER等[6]提出，目前，種子收獲前發(fā)芽（pre-harvest sprouting）是禾谷類作物種子和糧食生產(chǎn)中的最大危害之一。

NONOGAKI[7]提出，種子休眠與萌發(fā)的激素調(diào)控可能是種子植物中的一種高度保守的機(jī)制。在許多物種中，脫落酸（abscisic acid，ABA）是種子休眠誘導(dǎo)和維持的正調(diào)控因子，種子萌發(fā)的負(fù)調(diào)控因子；赤霉素（gibberellin，GA）和乙烯具有促進(jìn)種子萌發(fā)和拮抗ABA的作用[3,8-9]。高水平的ABA和低水平的GA引起種子深休眠和出苗率降低，而低水平的ABA和高水平的GA則誘導(dǎo)種子提早萌發(fā)，也稱為胎萌（vivipary）[4,10-11]；然而，這些激素在種子休眠與萌發(fā)中的拮抗作用機(jī)制仍不夠清楚。

ABA是調(diào)控植物許多發(fā)育過(guò)程包括種子休眠、萌發(fā)和幼苗生長(zhǎng)，以及控制許多非生物脅迫反應(yīng)的關(guān)鍵因子[12-14]。研究結(jié)果證明，ABA在許多物種的種子休眠中起重要作用：外源ABA可以延遲或抑制種子和胚的萌發(fā)；在未成熟種子中，內(nèi)源ABA維持種胚處于發(fā)育而不是萌芽過(guò)程；收獲前的萌發(fā)也與種子中ABA含量較低有關(guān)；由ABA生物合成突變、轉(zhuǎn)基因修飾或者化學(xué)抑制所引起的ABA缺乏的種子是非休眠的；ABA生物合成的化學(xué)抑制也引起一些休眠種子的萌發(fā)；ABA生物合成基因的過(guò)表達(dá)也會(huì)抑制和延遲種子萌發(fā)；在吸脹的最初幾個(gè)小時(shí)，非休眠種子中的ABA含量比休眠種子下降更多[15-17]。ABA在種子休眠與萌發(fā)中的作用主要受ABA代謝（包括生物合成和分解代謝）和信號(hào)傳遞途徑的調(diào)控[12-13,17-19]，環(huán)境因子對(duì)種子休眠和萌發(fā)的影響也是通過(guò)ABA和GA起作用[20]。然而，許多證據(jù)表明GA主要是在種子休眠被解除后起促進(jìn)萌發(fā)的作用，而不是參與解除種子休眠[17,20-21]。本文主要綜述ABA代謝與信號(hào)傳遞的研究進(jìn)展，ABA在種子發(fā)育、休眠與萌發(fā)中的作用，以及種子休眠基因DOG1（DELAY OF GERMINATION1）和ABA信號(hào)組分的關(guān)系；此外，我們提出了該領(lǐng)域需要進(jìn)一步研究的問(wèn)題，試圖為深入研究ABA調(diào)控種子休眠與萌發(fā)的分子機(jī)理提供新的參考。

1 ABA代謝與信號(hào)傳遞

1.1 ABA生物合成和分解代謝

1.1.1 ABA生物合成 ABA的生物合成和分解代謝決定細(xì)胞中的ABA水平，從而決定ABA信號(hào)的強(qiáng)度[18,22]。在陸生植物中，C40環(huán)氧類胡蘿卜素（epoxycarotenoid）是ABA生物合成的前體，是由質(zhì)體中甲基赤蘚糖醇磷酸（methylerythritol phosphate，MEP）途徑合成的異戊烯二磷酸（isopentenyl diphosphate，IPP）產(chǎn)生的（圖1）。β-類胡蘿卜素生物合成基因的突變體由于缺乏葉綠素表現(xiàn)為多效性的ABA缺乏表型，包括幼苗致死和光漂白（photobleaching）。玉米黃質(zhì)環(huán)氧化酶（zeaxanthin epoxidase，ZEP）催化全反式玉米黃質(zhì)（all-trans-zeaxanthin）環(huán)氧化成為全反式紫黃質(zhì)（alltrans-violaxanthin）[22]。全反式紫黃質(zhì)被轉(zhuǎn)化為9-順式紫黃質(zhì)（9-cis-violaxanthin），或者被轉(zhuǎn)化為全反式新黃質(zhì)（all-trans- neoxanthin）。擬南芥（Arabidopsis thaliana）ABA4催化全反式紫黃質(zhì)轉(zhuǎn)化成為全反式新黃質(zhì)[23]。然而，轉(zhuǎn)化全反式環(huán)氧類胡蘿卜素（all-transepoxycarotenoid）、紫黃質(zhì)和新黃質(zhì)形成其相應(yīng)的9-順式異構(gòu)體的異構(gòu)酶仍然不清楚[13]。盡管環(huán)氧類胡蘿卜素和紫黃質(zhì)的9-順式異構(gòu)體可能是9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素二加氧酶（9-cis-epoxycarotenoid dioxygenase，NCED）的底物，但9'-順式-新黃質(zhì)（9'-cis-neoxanthin）被認(rèn)為是NCED的主要底物[23]。

NCED將9-順式-環(huán)氧類胡蘿卜素氧化裂解為黃氧素（xanthoxin）是ABA生物合成的關(guān)鍵調(diào)控步驟[22]。因此，內(nèi)源ABA水平的變化與NCED的表達(dá)密切相關(guān)。在陸生植物中，NCED酶由多基因家族編碼，不同的家族成員在植物發(fā)育過(guò)程和脅迫反應(yīng)中起獨(dú)特的作用[24]。AtABA2編碼一個(gè)短鏈脫氫酶/還原酶，該酶催化黃氧素轉(zhuǎn)化為脫落醛（abscisic aldehyde）（圖1）[25-26]，脫落醛經(jīng)脫落醛氧化酶（abscisic aldehyde oxidase）轉(zhuǎn)化為ABA[22]。醛氧化酶的活性需要一個(gè)鉬輔因子（molybdenum cofactor，Moco）。因此，Moco生物合成缺陷的突變體也表現(xiàn)出ABA缺乏的表型[27]。

1.1.2 ABA合成代謝抑制劑 ABA是由類胡蘿卜素合成的，類胡蘿卜素生物合成抑制劑能夠降低內(nèi)源ABA水平。氟啶酮（fluridone）和氟草敏（norflurazon）是八氫番茄紅素去飽和酶（phytoene desaturase）的抑制劑，用這些化合物處理也能降低內(nèi)源ABA水平；同時(shí)由于葉綠素的光氧化引起植物發(fā)生漂白（圖1）[28]。去甲二氫愈創(chuàng)木酸（nordihydroguaiaretic acid，NDGA）是一種脂氧合酶的抑制劑，脂氧合酶催化多聚不飽和脂肪酸的脫氧作用（deoxygenation），在受到滲透脅迫的大豆（Glycine max）懸浮細(xì)胞中抑制ABA的積累[29]。研究證明，NDGA抑制脂肪的合成和植物生長(zhǎng)[30]，因此，需要研發(fā)更專一的NCED抑制劑。Abamine及其類似物abamineSG是NCED的專一性抑制劑，在擬南芥滲透脅迫處理過(guò)程中可抑制ABA的積累和ABA誘導(dǎo)基因的表達(dá)，但這些化合物對(duì)植物生長(zhǎng)沒(méi)有負(fù)面影響[31-32]。類倍半萜類胡蘿卜素裂解雙加氧酶（sesquiterpene-like carotenoid cleavage dioxygenase，SLCCD）抑制劑13（SLCCD13）阻止擬南芥中由滲透脅迫誘導(dǎo)的ABA積累和抑制ABA反應(yīng)基因（圖1）[33]。

圖1 ABA生物合成和分解代謝途徑（根據(jù)DEJONGHE等[13]修改）Fig.1 ABA biosynthetic and catabolic pathways (Modified from DEJONGHE et al.[13])

1.1.3 ABA分解代謝 ABA的分解代謝包括羥基化作用和與葡萄糖結(jié)合（圖1），其中，8'-羥基化作用是ABA分解途徑中的關(guān)鍵步驟。ABA C-8'位置上的羥基化被CYP707A家族催化，產(chǎn)物8'-羥基-ABA是不穩(wěn)定的，能自發(fā)地異構(gòu)化成為紅花菜豆酸（phaseic acid，PA）[34-35]。CYP707A家族屬于Cyt P450單加氧酶（monooxygenase），在高等植物中被多基因家族編碼[36]，家族中的每一個(gè)成員在不同的生理或者發(fā)育過(guò)程中起作用[37-38]。PA是一種弱的ABA作用類似物[39-40]，被PA還原酶轉(zhuǎn)化成為生物學(xué)活性喪失的二氫紅花菜豆酸（dihydrophaseic acid，DPA）。

ABA的羧基（C-1）和羥基及其氧化分解產(chǎn)物是與葡萄糖結(jié)合的潛在靶點(diǎn)[18]。ABA葡糖酯（ABA glucosyl ester，ABA-GE）是一種最常見(jiàn)的結(jié)合物，被認(rèn)為是ABA的一種儲(chǔ)存或者遠(yuǎn)距離運(yùn)輸形式[18,22]。葡糖基轉(zhuǎn)移酶（glucosyltransferase）催化ABA羧基的葡糖基化。ABA-GE被β-葡糖苷酶水解后釋放ABA，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)局部的ABA濃度[22]。

1.1.4 ABA分解代謝抑制劑 影響ABA分解代謝的化合物包括唑類抑制劑（azole-type inhibitor）和ABA類似物（ABA analog），它們作用于Cyt P450單加氧酶CYP707A（圖1）。唑類抑制劑烯效唑（uniconazole）和烯效醇（diniconazole）抑制CYP707A的活性，增加內(nèi)源ABA水平[41-42]。烯效唑和烯效醇不但抑制CYP707A，而且抑制其他的Cyt P450單加氧酶，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育有負(fù)面影響[43]。Abscinazole-E3M選擇性地抑制CYP707A，從而增加內(nèi)源ABA水平，提高水分脅迫耐性，但對(duì)植物的生長(zhǎng)影響較?。▓D1）[44]。與唑類抑制劑相反，ABA類似物能夠作為專一的ABA分解代謝抑制劑起作用。ABA分解代謝的第一步是CYP707A酶對(duì)環(huán)上8'和9'甲基的羥基化[18]。ABA類似物(+)-8'-次甲基-ABA （(+)-8'-methylidyne-ABA）和(+)-9'-乙炔-ABA（(+)-9'-acetylene-ABA）不可逆地抑制CYP707A活性（圖1），但這些化合物保留了ABA類似物的活性[45]。ABA 8'-羥化酶抑制劑4（ABA 8'-hydroxylase inhibitor 4，AHI4）不表現(xiàn)出ABA活性（例如停滯生長(zhǎng)和抑制種子萌發(fā)），但強(qiáng)烈地抑制CYP707A活性[46]。

1.2 ABA信號(hào)傳遞

核心ABA信號(hào)傳遞組分主要由PYR/PYL/RCAR（pyrabactin resistance 1/pyrabactin resistance 1-like/regulatory components of ABA receptor）蛋白、A組2C類蛋白磷酸酶（group A type 2C protein phosphatase，PP2C）、亞類Ⅲ蔗糖非發(fā)酵-1-相關(guān)蛋白激酶2（subclassⅢ sucrose nonfermenting-1-related protein kinase2，SnRK2）和ABF（ABA-responsive element (ABRE)-binding factor）/AREB（ABRE-binding protein）轉(zhuǎn)錄因子組成（圖2和圖3）[12-13,19,47-49]。ABA通過(guò)與PYR/PYL/ RCAR蛋白中高度保守的氨基酸進(jìn)行直接的和水介導(dǎo)的接觸，被結(jié)合進(jìn)疏水的配體結(jié)合的ABA受體（結(jié)合）口袋中。結(jié)合口袋（binding pocket）含有類似于一只折疊的手的7個(gè)β折疊，以及1個(gè)大的和2個(gè)較小的α螺旋[50-51]。ABA的結(jié)合促進(jìn)了包含β3和β4之間的一個(gè)門環(huán)（gate-loop）的構(gòu)象變化，這種構(gòu)象變化關(guān)閉結(jié)合口袋，形成與ABA的接觸。除了PYR/PYL/RCAR12和PYR/PYL/RCAR13分別含有序列-SDLPA-和-SGFPA-外，在所有的PYR/PYL/ RCAR蛋白的門環(huán)中都含有序列-SGLPA-[13]。β5和β6含有不變的序列-HRL-，它們之間的第二個(gè)“門閂（latch）”環(huán)也發(fā)生構(gòu)象改變；這種改變使受體-配體復(fù)合物對(duì)接和抑制PP2C。PP2C含有一個(gè)高度保守的、定位于A組專一識(shí)別環(huán)中的色氨酸殘基，該殘基能插入到由門環(huán)關(guān)閉所產(chǎn)生的小口袋中，并與ABA的酮基產(chǎn)生水介導(dǎo)的接觸。這個(gè)水分子位于ABA、門的脯氨酸（-SGLPA-）、門閂的精氨酸（-HRL-）和PP2C的色氨酸鎖之間的H-鍵網(wǎng)絡(luò)中心（圖2）[12,50,52]。

圖2 ABA誘導(dǎo)的受體構(gòu)象變化（引自CUTLER等[12]）Fig.2 ABA-induced changes in receptor conformation (From CUTLER et al.[12])

PYR/PYL/RCAR受體能夠間接地控制亞類ⅢSnRK2的活性，SnRK2在對(duì)ABA的反應(yīng)中磷酸化許多脅迫活化的靶點(diǎn)[53-54]。在對(duì)發(fā)育信息或者環(huán)境脅迫的反應(yīng)中，當(dāng)ABA在細(xì)胞中積累時(shí)，ABA與PYR/PYL/RCAR受體結(jié)合，以及觸發(fā)受體的構(gòu)象變化，從而使受體-ABA復(fù)合物與PP2C結(jié)合并抑制其活性（圖2和圖3）[12]。因而，亞類Ⅲ SnRK2被釋放，SnRK2磷酸化和控制下游因子的活性以激活生理反應(yīng)。SnRK2的靶點(diǎn)主要有2種類型，包括膜通道蛋白和轉(zhuǎn)錄因子。膜通道蛋白包括慢陰離子通道1（slow anion channel 1，SLAC1）、擬南芥鉀通道1（potassium channel inArabidopsis thaliana1，KAT1）和NADPH氧化酶呼吸爆發(fā)氧化酶同源物F（NADPH oxidase respiratory burst oxidase homolog F，RBOHF），它們是質(zhì)膜蛋白以及能被SnRK2磷酸化[12,22]。轉(zhuǎn)錄因子包括含有堿性亮氨酸拉鏈（basic leucine zipper，bZIP）結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子，例如ABF、AREB和ABI5，它們能夠在ABA誘導(dǎo)的基因啟動(dòng)子中與ABRE結(jié)合（圖3）[12,22]。另外，ABA誘導(dǎo)的基因還可以調(diào)控與相容性溶質(zhì)生物合成、晚期胚胎發(fā)生豐富（late embryogenesis abundant，LEA）蛋白和熱休克蛋白（heat shock protein）有關(guān)基因的表達(dá)，從而增加脫水耐性。ABI5與植物專一的VP1/ABI3轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，可以控制種子休眠[55]。

圖3 ABA信號(hào)傳遞途徑和DOG1調(diào)控種子休眠的新模型（根據(jù)NONOGAKI[19]修改）Fig.3 ABA signalling pathway and emerging model of seed dormancy regulated by DOG1 (Modified from NONOGAKI [19])

被子植物的PYR/PYL/RCAR受體分為3個(gè)亞家族（Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ）[47,56]。亞家族Ⅰ和Ⅱ存在于除苔蘚植物外的所有陸生植物中（苔蘚植物似乎僅僅含有亞家族Ⅰ）；亞家族Ⅲ幾乎僅存在于被子植物中[56-57]。大多數(shù)亞家族Ⅲ受體形成同源二聚體，它們對(duì)ABA的敏感性比亞家族Ⅰ/Ⅱ受體低；而亞家族Ⅰ/Ⅱ?yàn)閱误w，對(duì)ABA具有較高的親和性。在擬南芥原生質(zhì)體中表達(dá)不同PYR/PYL/RCAR受體的試驗(yàn)表明，亞家族Ⅰ和Ⅱ受體介導(dǎo)非脅迫植物中對(duì)低水平的ABA起反應(yīng)，而亞家族Ⅲ受體需要較高水平的ABA來(lái)啟動(dòng)信號(hào)傳遞；這些差異與它們具有不同內(nèi)在的ABA親和力相一致[58]。然而，遺傳分析表明擬南芥受體亞家族之間存在廣泛的冗余，模擬ABA缺失突變體的表型需要去除所有3個(gè)亞家族受體[49]。

在擬南芥中，有9個(gè)A組PP2C參與ABA的信號(hào)傳遞。一些擬南芥PP2C突變體表現(xiàn)出ABA過(guò)敏感表型，PP2C的活性被ABA受體選擇性地抑制[58-59]。在A組PP2C中，僅僅ABA過(guò)敏感萌發(fā)1（ABA hypersensitive germination 1，AHG1）缺乏保守的色氨酸鎖殘基，在受體-配體-PP2C復(fù)合物中這個(gè)殘基是與ABA的環(huán)已烯酮上的氧形成水介導(dǎo)的氫鍵必需的[58-59]。盡管AHG1對(duì)ABA受體介導(dǎo)的抑制是抗性的，但在種子萌發(fā)分析中ahg1突變體的種子對(duì)ABA過(guò)敏感，表明AHG1參與了ABA反應(yīng)[59-60]。

擬南芥中有9個(gè)SnRK2，其中3個(gè)亞類Ⅲ SnRK2（SRK2D/SnRK2.2、SRK2E/SnRK2.6/OST1和SRK2I/SnRK2.3）被ABA誘導(dǎo)。SnRK2三重突變體在種子萌發(fā)、植物生長(zhǎng)、氣孔關(guān)閉和ABA反應(yīng)基因表達(dá)中幾乎表現(xiàn)出完全ABA不敏感[53,61-63]。因此，ABA的作用是由亞類Ⅲ SnRK2介導(dǎo)的底物（靶）蛋白的磷酸化所觸發(fā)，盡管只有少量SnRK2的直接底物被鑒定。野生型或者用ABA處理的SnRK2三重突變體的磷酸化蛋白質(zhì)組分析鑒定了新的SnRK2候選底物，包括與開(kāi)花、核苷酸結(jié)合、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、信號(hào)傳遞和葉綠體形成有關(guān)的蛋白質(zhì)[64-66]。此外，SnRK2似乎是一個(gè)信號(hào)中樞，能夠被多種途徑調(diào)控；例如，擬南芥OST1（SnRK2.6）以不依賴于ABA的方式被冷脅迫活化，調(diào)節(jié)冷誘導(dǎo)的基因表達(dá)[67]。另外，被調(diào)控的ABA受體和PP2C的蛋白水解、以及受體與不同靶點(diǎn)之間的相互作用已經(jīng)被報(bào)道，表明核心ABA途徑的復(fù)雜調(diào)控作用[68-71]。

2 ABA在種子發(fā)育、休眠解除和萌發(fā)中的作用

2.1 種子發(fā)育

ABA在種子發(fā)育過(guò)程中逐漸積累，在種子成熟中后期達(dá)到峰值。擬南芥種子成熟中期積累的ABA主要由母體組織（包括種皮）合成[72]；在擬南芥和皺葉煙草（Nicotiana plumbaginifolia）中，這種母體來(lái)源的ABA有助于胚的發(fā)育[73]。擬南芥種子初生休眠的誘導(dǎo)和成熟需要合子組織中合成的ABA，這些ABA在成熟后期積累[74]。擬南芥中有5個(gè)NCED，其中NCED6和NCED9在種子發(fā)育過(guò)程中起促進(jìn)ABA的積累和誘導(dǎo)休眠的作用[75-76]；CYP707A1是種子成熟中期ABA失活的主要同源異構(gòu)體，而CYP707A2則是成熟后期ABA失活的主要類型[37]。成熟中期（未成熟）的種子分解代謝活性較高，使母體來(lái)源的ABA失活。在未成熟和成熟種子中，cyp707a1突變體比cyp707a2突變體積累更多的ABA，但cyp707a2突變體由于種子吸脹后ABA的緩慢下降表現(xiàn)出更強(qiáng)的休眠特性[37]。在大麥（Hordeum vulgare）種子發(fā)育過(guò)程中和吸脹后，ABA的代謝和敏感性受環(huán)境條件調(diào)控[16]。

擬南芥哥倫比亞生態(tài)型（Col）干種子中大量?jī)?chǔ)存的mRNA的啟動(dòng)子富含ABRE，同時(shí)也含有豐富的ABI3和ABI4等目標(biāo)順式元件[77]，這些結(jié)果表明，在種子成熟后期ABA可能會(huì)影響含有這些目標(biāo)元件的儲(chǔ)存mRNA的組成。

2.2 種子后熟

后熟（after-ripening）是指成熟種子離開(kāi)母體植株后，需要經(jīng)過(guò)一系列的生理生化變化才能具備萌發(fā)能力的一個(gè)生理過(guò)程。后熟能夠解除許多物種的種子休眠，完成后熟所需要的時(shí)間與種子的休眠類型和休眠程度密切相關(guān)[78]。許多試驗(yàn)表明，在禾谷類植物中，后熟不改變干燥種子中ABA的含量或者ABA代謝；而當(dāng)休眠種子和后熟種子經(jīng)歷吸脹作用時(shí)，ABA含量（或者代謝）發(fā)生顯著的變化。剛收獲的成熟小麥和大麥干燥種子仍然是休眠的，其ABA含量與經(jīng)過(guò)3—4個(gè)月后熟已解除休眠的種子類似；盡管干燥的休眠種胚和后熟種胚中的ABA含量沒(méi)有差異，但后熟種子的萌發(fā)時(shí)間要比休眠種子短很多[79-81]。在吸脹初期的幾個(gè)小時(shí)，休眠種子和后熟種子中的ABA含量迅速下降；但在隨后的幾個(gè)小時(shí)后熟種子中的ABA含量較低，而在休眠種子中保持穩(wěn)定，在一些品種中甚至增加[16,79-80]。

在大麥種子中，后熟對(duì)ABA生物合成基因表達(dá)的影響還不明確，但它顯著地增加ABA分解代謝基因HvABA8'OH1的表達(dá)。在吸脹的最初幾個(gè)小時(shí)內(nèi)，在后熟種子和休眠種子中HvABA8'OH1的表達(dá)都增加，隨后降低；然而，在后熟種胚中的表達(dá)比休眠種胚中強(qiáng)很多[16,79]。HvABA8'OH2的表達(dá)水平在后熟種子和休眠種子的吸脹過(guò)程中都非常低；因此，與休眠種胚比較，在吸脹的最初幾個(gè)小時(shí)，后熟大麥種胚中ABA含量的顯著下降是由于通過(guò)增加HvABA8'OH1的表達(dá)，從而促進(jìn)ABA的分解代謝造成的。在吸脹的后熟種子和休眠種子的HvABA8'OH1原位定位顯示，在后熟種胚中，僅僅在胚根鞘（包圍禾谷類種子胚初生根的組織）中檢測(cè)到HvABA8'OH1的表達(dá)，而在休眠種胚中沒(méi)有被檢測(cè)到[16]。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，胚根鞘在種子休眠的調(diào)控中起重要作用，調(diào)控的機(jī)制可能是基于高水平的ABA阻止胚根鞘的弱化和生長(zhǎng)，導(dǎo)致胚根伸長(zhǎng)受阻，而增加的ABA分解代謝則可解除這一限制[16,82]。

2.3 種子萌發(fā)

種子萌發(fā)表現(xiàn)出3個(gè)階段的水分吸收。第一階段是由于干種子的被動(dòng)吸水，其次是少量的水分吸收（第二階段），進(jìn)一步的水分吸收是與萌發(fā)完成和隨后的幼苗生長(zhǎng)有關(guān)（第三階段）[1]。一系列證據(jù)表明盡管在萌發(fā)早期階段的ABA含量也起一些作用，但萌發(fā)完成前（第二階段后期）種子中的ABA含量是種子萌發(fā)的決定因素[17]。

干種子中存留的ABA會(huì)在種子吸脹后下降，這在休眠（佛得角群島生態(tài)型（Cape Verde Islands ecotype，Cvi））和非休眠（Col）的擬南芥種子中都有發(fā)生，主要取決于CYP707A2的活性[16,37,83-84]。在Col和Cvi種子中，CYP707A2在種子吸脹開(kāi)始后的2—3 h被誘導(dǎo)[84]，導(dǎo)致ABA的迅速下降，結(jié)果表明與CYP707A2蛋白的從頭合成（de novosynthesis）有關(guān)[83]。這種早期誘導(dǎo)能被一些因素例如硝酸鹽[85]、一氧化氮（nitric oxide，NO）[83]和后熟[16]調(diào)控。就整個(gè)萌發(fā)過(guò)程而言，雖然休眠的Cvi種子和熱抑制的Col種子在吸脹早期表現(xiàn)出ABA含量下降，但此后會(huì)有所增加[86]。

此外，在一些物種中胚的周圍組織（胚乳或者外胚乳和種皮）是胚根伸出的物理障礙[78]。在大麥種子中，這些組織也會(huì)引起缺氧，從而抑制ABA的分解代謝和增加對(duì)ABA的敏感性[87]。一些物種例如萵苣（Lactuca sativa）、番茄（Lycopersicum esculentum）和擬南芥的胚乳都是由活細(xì)胞組成的，它們的弱化對(duì)于萌發(fā)的完成是必需的。盡管在番茄種子萌發(fā)過(guò)程中ABA不抑制珠孔端胚乳（micropylar endosperm）內(nèi)-β-甘露聚糖酶活性的增加[88]，但阻止細(xì)胞壁降解酶的合成可能是ABA的一個(gè)重要功能[89]。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，ABA調(diào)控細(xì)胞壁松弛酶的表達(dá)或者活性氧（reactive oxygen species，ROS）的積累，ROS可能氧化細(xì)胞壁多糖[78,90]。

3 ABA信號(hào)傳遞和DOG1與種子休眠

種子的休眠與萌發(fā)不僅與核心ABA信號(hào)途徑有關(guān)，而且受DOG1-AHG1/AHG3途徑的調(diào)控（圖3）[19,91]，這兩條途徑在下游組分PP2C產(chǎn)生重疊[19,48,92]。NONOGAKI[19]認(rèn)為近年來(lái)種子休眠研究的突破是在一定程度上揭示了DOG1的生化功能。下面主要介紹該領(lǐng)域的近期進(jìn)展，包括DOG1對(duì)種子休眠的作用，DOG1表達(dá)和功能的調(diào)控，以及DOG1與ABA信號(hào)途徑的關(guān)系。

3.1 DOG1對(duì)種子休眠的作用

利用擬南芥自然變異的數(shù)量性狀位點(diǎn)（quantitative trait locus，QTL）分析已經(jīng)鑒定了種子休眠的特異位點(diǎn)，包括DOG1[93-95]。DOG1轉(zhuǎn)錄物在種子成熟階段積累，授粉后14—16 d達(dá)到峰值[95]，在剛收獲的種子中減少到約20%，在種子吸脹過(guò)程中消失[96]。DOG1蛋白也在種子成熟階段積累，但在種子接近成熟時(shí)并未降低，故剛收獲的種子含有相對(duì)高水平的DOG1蛋白；即使在后熟13周，種子的休眠狀態(tài)已經(jīng)被解除，蛋白水平仍然保持相對(duì)較高[96]。因此，在后熟種子中，DOG1蛋白的數(shù)量和休眠水平之間缺乏相關(guān)性。研究發(fā)現(xiàn)，DOG1保持種子休眠特性最重要的是其化學(xué)性質(zhì)而不是數(shù)量，在后熟過(guò)程中，DOG1蛋白變化成為非功能形式，從而引起種子萌發(fā)；事實(shí)上，在種子后熟之前和后熟之后，DOG1蛋白的等電點(diǎn)（pI）發(fā)生了變化[96]。dog1突變體種子缺乏休眠是由于DOG1主要在成熟階段起作用，在成熟種子中含有的DOG1蛋白可能是其殘留物[96]。

3.2 DOG1表達(dá)和功能的調(diào)控

DOG1在種子成熟過(guò)程中表達(dá)，其表達(dá)受可變剪接（alternative splicing）[95,97]和可變多腺苷酸化（alternative polyadenylation）的調(diào)控[91,98]。DOG1的幾個(gè)剪接變體（splicing variant）[95]可產(chǎn)生5種轉(zhuǎn)錄物變異體（transcript variant，α、β、γ、δ、ε）和3種不同的蛋白（圖4-A）[97]；其中DOG1-ε不是一個(gè)真正意義上的剪接變體，但是擬南芥發(fā)育種子中的主要形式[97]；可變剪接可以構(gòu)成不同功能的蛋白，包括它們的亞細(xì)胞定位和增加的休眠潛能。這3種蛋白（α、（β、γ、ε）、δ）都能被轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞核[97]，因此，可以認(rèn)為DOG1是作為一種調(diào)控蛋白以同源二聚體的形式起作用[96-97]。過(guò)表達(dá)分析結(jié)果表明，這3種同源異構(gòu)體可以誘導(dǎo)種子休眠，且共表達(dá)時(shí)更為穩(wěn)定。因此，異源二聚體的形成不能解釋DOG1蛋白具有更好的穩(wěn)定性。對(duì)于DOG1的穩(wěn)定性，同源異構(gòu)體共表達(dá)的正作用機(jī)制尚不夠清楚[91]。當(dāng)酵母剪接體組分19號(hào)復(fù)合物相關(guān)蛋白1（nineteen complexrelated protein 1）的擬南芥直系同源物（AtNTR1）被突變時(shí)，它引起DOG1中內(nèi)含子保留和外顯子跳躍（intron retention and exon skipping）的主要缺陷。這種DOG1剪接的錯(cuò)誤能調(diào)控種子減少休眠，但這種表型不會(huì)由可變剪接本身引起，而可能是這種突變體中DOG1表達(dá)水平降低的結(jié)果[99]。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)錄延伸的效率（transcription elongation efficiency）對(duì)于DOG1的表達(dá)和種子休眠是一種重要的因子[7,100-102]，認(rèn)為AtNTR1是在剪接位點(diǎn)控制著RNA聚合酶Ⅱ（PolⅡ）的作用，并可作為轉(zhuǎn)錄延伸的校正點(diǎn)（checkpoint）[99]。

產(chǎn)生轉(zhuǎn)錄變異體的另一種機(jī)制是可變多腺苷酸化，在3'端產(chǎn)生不同的轉(zhuǎn)錄物[98,103]。現(xiàn)已發(fā)現(xiàn)可變多腺苷酸化能產(chǎn)生2種形式的DOG1轉(zhuǎn)錄物——短DOG1（shDOG1）和長(zhǎng)DOG1（lgDOG1）[98]。shDOG1終止于近端轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)（proximal transcription termination site，pTTS），而lgDOG1可延伸至遠(yuǎn)端轉(zhuǎn)錄終止位點(diǎn)（distal transcription termination site，dTTS）。shDOG1和lgDOG1（第2個(gè)內(nèi)含子/第3個(gè)外顯子）的DOG1基因組區(qū)域含有一個(gè)反義方向的啟動(dòng)子，它可驅(qū)動(dòng)反義DOG1RNA（antisenseDOG1RNA，asDOG1）的表達(dá)[104]。試驗(yàn)已經(jīng)證明，從終止子區(qū)域（terminator region）的反義RNA表達(dá)可能是一種常見(jiàn)的現(xiàn)象[105-106]，DOG1中asDOG1的表達(dá)可能通過(guò)轉(zhuǎn)錄控制負(fù)調(diào)控正義DOG1的表達(dá)[91]和減少種子休眠[104]。shDOG1與DOG1-ε相同，而lgDOG1包括DOG1-α、DOG1-β、DOG1-γ和DOG1-δ（圖4-A）。在許多物種中，DOG1蛋白的C末端是缺失的或者是不保守的，因此，C末端對(duì)于DOG1的功能不是必需的。事實(shí)上，shDOG1對(duì)于補(bǔ)償dog1突變和恢復(fù)種子休眠是足夠的[98]。盡管在已發(fā)表的研究結(jié)果中關(guān)于lgDOG1轉(zhuǎn)錄本的重要性存在一些分歧，但一致認(rèn)為由2個(gè)外顯子組成的shDOG1是有功能的，是種子休眠所必需的主要蛋白[97-98,104]。

根據(jù)編碼的多肽序列，DOG1基因組DNA的第3外顯子區(qū)域幾乎沒(méi)有保守性。相反，這一區(qū)域在DNA水平上是高度保守的，它延伸到內(nèi)含子2[104]。在DNA水平，DOG1序列的保守性與相同區(qū)域蛋白序列的低進(jìn)化壓力是矛盾的，暗示DOG1基因組區(qū)域可能是一個(gè)調(diào)控長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA，lncRNA）的產(chǎn)生位點(diǎn)。事實(shí)已證明lncRNA從這個(gè)區(qū)域（和附近）反義方向表達(dá)（asDOG1）（圖4-A）[104]；試驗(yàn)也證實(shí)其表達(dá)不是假的轉(zhuǎn)錄噪音，而是被一個(gè)轉(zhuǎn)錄活性啟動(dòng)子反義方向調(diào)控[104]。AsDOG1的表達(dá)負(fù)影響shDOG1的表達(dá)，表明asDOG1是DOG1表達(dá)和種子休眠的負(fù)調(diào)控因子。（正義鏈）DOG1啟動(dòng)子（dog1-3（T-DNA））、外顯子1（dog1-4（T-DNA））和外顯子2（dog1-1（1 bp刪去））的突變導(dǎo)致減少或者幾乎沒(méi)有種子休眠[95,98,104]。相反，外顯子3（asDOG1啟動(dòng)子）區(qū)域（dog1-5（T-DNA））的突變反而增加種子休眠（圖4-A）[98,104]，這為asDOG1作為種子休眠負(fù)調(diào)控因子起作用提供了令人信服的證據(jù)。

反義DOG1是一種相對(duì)穩(wěn)定的RNA（半衰期約為46 min）[104]，也是典型的調(diào)節(jié)RNA，因此，asDOG1可能在轉(zhuǎn)錄后水平依賴于RNA分子。然而，asDOG1表達(dá)分析顯示，asDOG1不能反式、但能順式起作用[104]；即asDOG1轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)物（RNA分子本身）可能不重要，但轉(zhuǎn)錄本身的“行為”[107-108]可能是DOG1抑制的原因[104]。研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，反義表達(dá)的共轉(zhuǎn)錄作用而不是反義RNA分子的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控引起轉(zhuǎn)錄干擾[108]。轉(zhuǎn)錄干擾可能被不同的機(jī)制介導(dǎo)，包括RNA聚合酶不直接結(jié)合到啟動(dòng)子序列上和啟動(dòng)子競(jìng)爭(zhēng)（圖4-B）[108-110]。在酵母中，反義介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄干擾阻斷IME4的轉(zhuǎn)錄延伸[108,111]。因此，asDOG1的表達(dá)可能影響DOG1的轉(zhuǎn)錄延伸，這是種子休眠的一個(gè)關(guān)鍵因子（圖4-B）[7,100-102]。由于在種子吸脹過(guò)程中DOG1和asDOG1的表達(dá)量降低，因此，asDOG1的作用可能被局限在種子成熟階段[104]，DOG1蛋白功能的修飾而不是它的轉(zhuǎn)錄控制對(duì)于后熟誘導(dǎo)種子萌發(fā)可能是關(guān)鍵的[96,112]。asDOG1在種子成熟階段的表達(dá)水平可能決定成熟種子的休眠深度，但為了理解asDOG1在種子休眠生物學(xué)中的確切作用還有待于進(jìn)一步研究。

3.3 DOG1與ABA信號(hào)傳遞

目前，已經(jīng)報(bào)道DOG1能與AHG1/AHG3和PP2C相互作用[48,92]，而AHG1[60]和AHG3[113]是ABA信號(hào)傳遞和種子休眠的負(fù)調(diào)控因子。AHG1（ahg1-5）或AHG3（ahg3-2）的功能缺失突變將增強(qiáng)種子休眠，雙突變體ahg1-5ahg3-2的種子休眠特性增強(qiáng)[92]，在ahg1-1ahg3-1雙突變體種子中也觀察到類似現(xiàn)象[48]。這些結(jié)果表明，這2個(gè)AHG在種子休眠中起冗余的作用。當(dāng)非休眠突變dog1-2與單一ahg突變的任何一個(gè)組合時(shí)，雙突變體種子（dog1-2 ahg1-5和dog1-2 ahg3-2）是完全非休眠的[92]，這表明DOG1對(duì)AHG1和AHG3的拮抗作用。相反，三重突變體dog1-2 ahg1-5 ahg3-2種子像雙突變體ahg1-5 ahg3-2種子一樣仍然是深休眠的[92]，表明AHG1和AHG3對(duì)DOG1是上位性的（epistatic）。這些遺傳分析表明AHG1和AHG3在DOG1的下游起促進(jìn)萌發(fā)的作用，DOG1通過(guò)束縛它們維持種子休眠[19,48]。

圖4 DOG1表達(dá)和功能的調(diào)節(jié)（引自NONOGAKI[91]）Fig.4 Regulation of DOG1 expression and function (From NONOGAKI[91])

AHG1和AHG3的PP2C功能缺失增加種子對(duì)ABA的敏感性[48,92]。DOG1被認(rèn)為通過(guò)結(jié)合和抑制AHG1和AHG3增加對(duì)ABA的敏感性。這種機(jī)制類似于ABA感受和信號(hào)途徑中通過(guò)ABA受體PYR/PYL/RCAR對(duì)ABI1亞家族PP2C的抑制（圖3）[12,47,49]。PP2C活性的抑制（ABA受體的主要作用）也在DOG1蛋白中觀察到[48]，盡管在不同的實(shí)驗(yàn)室也觀察到一些相互矛盾的結(jié)果，這可能是由于在體外試驗(yàn)中缺失一些因素所致[92]。對(duì)于種子休眠，PP2C的失活可能是DOG1功能的一個(gè)重要部分。

根據(jù)PP2C抑制激酶的典型作用，與種子休眠有關(guān)的PP2C的一個(gè)顯著特征是AHG1（但不是AHG3）對(duì)ABA受體的抑制作用是抗性的[59]。在體外試驗(yàn)中當(dāng)激酶與PP2C一起孵育時(shí)，激酶的自體磷酸化作用被PP2C抑制；而ABA受體和ABA一起加入到同一反應(yīng)體系時(shí)則抑制PP2C的活性和恢復(fù)激酶的自體磷酸化。相反，在ABA和激酶存在下ABA受體和AHG1的共孵育不表現(xiàn)出自體磷酸化，表明AHG1仍然能夠抑制激酶活性，即PP2C對(duì)ABA受體的抑制作用是抗性的[59]。AHG1的另一特征表明即使在高水平的ABA存在下，這些種子表達(dá)的和與休眠相關(guān)的PP2C仍然能夠負(fù)調(diào)控ABA信號(hào)傳遞。這些研究結(jié)果表明只要通過(guò)這個(gè)開(kāi)放的AHG1窗口，種子萌發(fā)程序仍然能夠在含有高水平ABA的發(fā)育種子中運(yùn)行[19]。因此，為了完全暫停萌發(fā)程序，必須關(guān)閉拮抗ABA抑制的AHG1途徑。DOG1的主要生物學(xué)作用可能是阻止AHG1/AHG3途徑以確保種子休眠[19]。DOG1似乎是作為ABA作用的“看門狗（watchdog）”，直到它在種子后熟過(guò)程中被化學(xué)修飾和失活[19]，從而允許種子恢復(fù)萌發(fā)程序。

另一個(gè)種子特異性的ABA信號(hào)是DOG1被認(rèn)為是一種血紅素結(jié)合蛋白（heme-binding protein）。血紅素不是DOG1與AHG1相互作用所必需的，AHG1通過(guò)DOG1 N端區(qū)域中的6個(gè)殘基DSYLEW（位置13—18）介導(dǎo)。然而，在DOG1蛋白的His 245和His 249結(jié)合的血紅素對(duì)于DOG1在種子休眠中的功能是必需的[48]。由于血紅素結(jié)合蛋白是作為O2和NO傳感器起作用[114]，但至今血紅素怎樣與ABA信號(hào)體系相聯(lián)系仍不夠清楚。研究發(fā)現(xiàn)，種子的氧化還原狀態(tài)變化顯著地影響種子的休眠與萌發(fā)[112]。NO觸發(fā)ABI5的S-亞硝?；⊿-nitrosylation），從而引起萌發(fā)抑制因子ABI5的穩(wěn)定性降低[91,115]。血紅蛋白是一種NO的清除劑以及負(fù)影響ABI5的S-亞硝?；饔?，從而穩(wěn)定ABI5[91]；DOG1可能參與了這個(gè)過(guò)程[19]。

4 展望

ABA是調(diào)控種子發(fā)育、休眠與萌發(fā)以及脫水耐性的重要激素，也顯著地影響種子的產(chǎn)量與質(zhì)量和幼苗形成[1-2]；因此，自1960年以來(lái)ABA的代謝、生理作用和信號(hào)傳遞就得到了廣泛的研究[12,48,116-117]。盡管近年來(lái)這些領(lǐng)域已取得了重要的突破，但仍然有一些重要的科學(xué)問(wèn)題尚不清楚。例如，ABA代謝中ABA被CYP707A家族催化成為8'-羥基-ABA，然后自發(fā)地異構(gòu)化成為PA；ABA葡糖基轉(zhuǎn)移酶能將ABA轉(zhuǎn)化成為ABA-GE，作為ABA的儲(chǔ)存池；ABA-GE又能被β-葡糖苷酶水解成為ABA和葡萄糖（圖1）。那么，這些酶及其基因怎樣響應(yīng)發(fā)育和環(huán)境變化以維持正常的ABA濃度是不清楚的。

圖3總結(jié)了種子中ABA信號(hào)途徑的新模型。PYR/PYL/RCAR蛋白與ABA結(jié)合，并抑制A組PP2C的活性；PP2C使SnRK2去磷酸化和阻止活性SnRK2的積累；SnRK2又參與bZIP轉(zhuǎn)錄因子的直接磷酸化；從而負(fù)調(diào)控ABA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄反應(yīng)[12,19,48]。盡管這個(gè)模型能夠解釋核心ABA信號(hào)傳遞途徑，但不能解釋ABA生理的許多重要調(diào)控因子的作用，包括第二信息[12]。因此，研究已知因子例如Ca2+或者ROS與PYR/PYL/RCAR信號(hào)機(jī)制的相互關(guān)系將是今后的任務(wù)之一。此外，DOG1和AHG1/AHG3結(jié)合，調(diào)控下游組分包括SnRK2和ABI5，組成與核心ABA信號(hào)途徑并行的種子休眠與萌發(fā)調(diào)控系統(tǒng)；這兩條途徑在組分PP2C重疊[19,48,92]。值得注意的是，在整合生理?xiàng)l件或者環(huán)境信號(hào)時(shí)PP2C優(yōu)先響應(yīng)哪一條途徑，這兩條途徑怎樣協(xié)調(diào)，以及PP2C還有哪些新的靶組分都還不夠清楚。

組學(xué)（-omics）技術(shù)已經(jīng)應(yīng)用于種子休眠與萌發(fā)的研究[118-120]，結(jié)合種子ABA生物合成和信號(hào)組分突變體，利用相應(yīng)的專一性抑制劑，構(gòu)建新的種子休眠與萌發(fā)的組學(xué)研究體系，包括轉(zhuǎn)錄組、翻譯組、蛋白質(zhì)組、代謝組和環(huán)境組可能產(chǎn)生一些新的知識(shí)和有助于更全面地理解種子休眠的機(jī)制。