猴頭菇菌絲體蛋白制備工藝研究

劉廣建 鄭惠華 蔣 益 桑 花 薛 璟 季宏更 張 蕾

（1江蘇省蘇微微生物研究有限公司，江蘇無錫214063；2江蘇安惠生物科技有限公司，江蘇南通226009）

猴頭菇是一種營養(yǎng)價(jià)值極高的食用藥用真菌，含有豐富的多糖、多肽、萜類、甾醇類等活性成分，具有抗腫瘤，降血糖，降血脂等諸多功效。現(xiàn)代研究表明猴頭菇活性蛋白具有免疫調(diào)節(jié)作用，活性肽則有抗氧化功效。猴頭菇的多肽組合物可以改善老年癡呆小鼠的學(xué)習(xí)能力。Chen Diling等采用化學(xué)分離結(jié)合藥效學(xué)評估方法，從猴頭菇中分離單帶蛋白（HEP3）。該蛋白通過調(diào)節(jié)腸道微生物群落的組成和代謝來改善免疫系統(tǒng)，激活T細(xì)胞的增殖和分化。輔助試驗(yàn)還表明，HEP3可作為腫瘤負(fù)荷小鼠的抗腫瘤免疫抑制劑。近些年來隨著人們養(yǎng)生意識的提高，猴頭菇也因此成了國內(nèi)外極力追捧的明星級食藥用菌。試驗(yàn)以猴頭菇菌絲體為原料，對菌絲體蛋白的多種提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，并用聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）法測定其分子量分布，為猴頭菇菌絲體蛋白和多肽的進(jìn)一步研究和開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

猴頭菇菌絲體由液體發(fā)酵所得，經(jīng)測定蛋白質(zhì)含量35.2%；考馬斯亮藍(lán)G250、R250（分析純）、牛血清蛋白（分析純）、三羥甲基氨基甲烷（Tris）、N，N，N，N-四甲基乙二胺（TEMED）、木瓜蛋白酶（為國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司生產(chǎn)）；蛋白質(zhì)marker（8～180 kD）、SephadexG-100（為常州天地人和生物科技有限公司生產(chǎn)）；其余試劑均為市售分析純。

儀器設(shè)備：Alpha-1500型紫外可見分光光度計(jì)（上海譜元儀器有限公司生產(chǎn)）；JY98-111DN型超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新藝超聲設(shè)備有限公司生產(chǎn)）。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.2.1 堿提酸沉法提取猴頭菇菌絲蛋白最佳工藝條件的確定

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，堿提酸沉法以pH、料液比、溫度、時(shí)間為試驗(yàn)因素。采用4因素3水平L9（34）正交試驗(yàn)，確定最佳菌絲體蛋白提取工藝條件。因素水平見表1。

表1 堿提酸沉法提取菌絲蛋白質(zhì)正交試驗(yàn)因素水平

1.2.2 酶法提取猴頭菇菌絲體蛋白最佳工藝條件的確定

在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，酶法提取以加酶量、料液比、溫度、時(shí)間為試驗(yàn)因素。采用4因素3水平L9（34）正交試驗(yàn)，確定最佳提取工藝條件。因素水平見表2。

1.2.3 超聲波提取猴頭菇菌絲體蛋白最佳工藝條件的確定

采用超聲波輔助浸提的方法，在超聲功率、超聲時(shí)間和超聲溫度單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用Box-Benhnken方法設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)，以蛋白提取率為響應(yīng)值，進(jìn)行響應(yīng)面分析得到優(yōu)化組合條件。試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel進(jìn)行整理和繪圖，Design-Expert 8.0統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行多元二次回歸模型方程的建立及方差分析，運(yùn)用該軟件中響應(yīng)面值優(yōu)化程序求得當(dāng)響應(yīng)面值最大時(shí)各因素的最佳組合。響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平見表3。

表2 酶法提取猴頭菇菌絲體蛋白正交試驗(yàn)因素水平

表3 超聲波提取菌絲體蛋白響應(yīng)面分析試驗(yàn)因素水平

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

考馬斯亮藍(lán)比色法。精確稱取10 mg牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，加入100 mL容量瓶中，用蒸餾水溶解后定容，得到0.1 mg/mL的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液。分別取標(biāo)準(zhǔn)液0、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL于10 mL具塞試管中，加蒸餾水至1 mL，再分別向試管中加入配制好的考馬斯亮藍(lán)G250溶液5 mL，搖勻，避光反應(yīng)5～10 min后，在波長595 nm處測定其吸光度值，繪制牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線。

圖1牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線

1.3.2 猴頭菇菌絲體蛋白等電點(diǎn)確定

蛋白質(zhì)堿提酸沉方法，取等量的堿提離心液調(diào)pH至不同值，離心所得上清液采用考馬斯亮藍(lán)比色法測定其吸光度值，吸光度值最低點(diǎn)的pH就為等電點(diǎn)pI值。

1.3.3 猴頭菇菌絲體蛋白提取

將猴頭菇菌絲體于65℃烘干粉碎后過100目篩，備用。稱取猴頭菇菌絲體粉，在一定條件下浸提，6000 r/min離心15 min，取上清液，用0.1 moL/L的鹽酸調(diào)pH至等電點(diǎn)，靜置1 h，8000 r/min離心15 min，得蛋白質(zhì)沉淀，加一定量蒸餾水溶解蛋白質(zhì)，然后用0.01 moL/L的NaOH溶液中和至pH7.0，冷凍干燥，得猴頭菇菌絲體蛋白。

1.3.4 蛋白質(zhì)的純化及測定

SephadexG-100凝膠柱純化菌絲體蛋白質(zhì)；參照GB5497—1985，用凱氏定氮法測定蛋白質(zhì)含量；SDS-PAGE測猴頭菇菌絲體蛋白分子量。

2 結(jié)果與分析

2.1 等電點(diǎn)確定

由圖2可知，猴頭菇菌絲體蛋白的等電點(diǎn)pI值為3.05。

圖2 等電點(diǎn)的確定

2.2 猴頭菇菌絲體蛋白提取工藝條件確定

2.2.1 堿提酸沉法提取猴頭菇菌絲體蛋白最佳條件的確定

正交試驗(yàn)結(jié)果見表4。由表4可知，極差分析，RA＞RD＞RC＞RB，可見影響菌絲體蛋白提取效果的因素依次為：A＞D＞C＞B，即料液比＞時(shí)間＞溫度＞pH。方差分析結(jié)果表明，溫度、pH、料液比、提取時(shí)間四因素中pH對提取率影響弱。提取蛋白質(zhì)的最佳條件為 A3B3C2D1，即料液比 1∶25，pH10.5，提取 時(shí) 間1.5 h，溫度25℃。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，該條件提取猴頭菇菌絲體蛋白，提取率為22.75%，確為最優(yōu)組合。

2.2.2 酶法提取猴頭菇菌絲體蛋白最佳條件的確定

正交試驗(yàn)結(jié)果見表5。由極差分析可知，4個(gè)因素極差大小順序?yàn)椋篟D＞RA＞RC＞RB，即影響酶法提取工藝的最主要因素是溫度，料液比次之。方差分析結(jié)果表明，溫度、料液比對提取率影響極顯著，酶用量影響較小。最佳提取條件為A3B3C2D1，即料液比為1∶25，1%的木瓜蛋白酶酶液0.3 mL，溫度為25℃，提取時(shí)間為1.5 h。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)，該提取條件提取猴頭菇菌絲體蛋白的提取率為21.04%，確為最優(yōu)組合。

表4 堿提酸沉法提取猴頭菇菌絲體蛋白正交試驗(yàn)結(jié)果

表5 酶法提取猴頭菇菌絲體蛋白正交試驗(yàn)結(jié)果

2.2.3 超聲波提取猴頭菇菌絲體蛋白最佳工藝條件的確定

在單因素試驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)Box-Benhnken設(shè)計(jì)原理，以超聲功率、超聲時(shí)間、超聲溫度3個(gè)因素為自變量，以猴頭菇菌絲體蛋白提取率為響應(yīng)值，采用響應(yīng)面法進(jìn)行三因素三水平的試驗(yàn)設(shè)計(jì)，共包括17組試驗(yàn)方案，試驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表6。

表6 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

模型建立與方差分析：利用設(shè)計(jì)軟件Design-Expert對表6數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得超聲時(shí)間（A）、超聲溫度（B）、超聲功率（C）的二次多項(xiàng)回歸方程為：

Y=23.09-5.46A+2.75B+1.48C+0.15AB-0.14AC+0.24BC-3.31A2-1.52B2-1.14C2，此回歸模型方程的ANOVA分析結(jié)果見表7。

表7 響應(yīng)面試驗(yàn)回歸模型方差分析

圖3 各兩因素交互作用對猴頭菇蛋白提取影響的響應(yīng)面圖及等高線圖

由表7結(jié)果可見：擬合方程具有較高的F值（F=12.55）和非常低的P值（P=0.0015），說明回歸方程達(dá)到比較顯著的水平（P=0.0015，R2=0.9417）；失擬項(xiàng)的P=0.1156＞0.05，試驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型預(yù)測數(shù)據(jù)差異不顯著，表明該擬合方程與實(shí)際擬合較好。試驗(yàn)結(jié)果相關(guān)系數(shù)模型的決定系數(shù)R2為0.9417，表明猴頭菇菌絲體蛋白提取率的試驗(yàn)值與預(yù)測值由較好的一致性，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj為0.8667，說明該模型能解釋86.67%響應(yīng)值的變化，有約總變異13.33%的不能由回歸模型來解釋。綜上所述，該二次回歸模型擬合程度好，試驗(yàn)誤差較小，該模型方程可對猴頭菇菌絲體蛋白提取條件進(jìn)行預(yù)測和分析。

由F值可以看出，3個(gè)因素對猴頭菇菌絲體蛋白質(zhì)提取率影響程度依次為超聲時(shí)間（A）＞超聲溫度（B）＞超聲功率（C）；由響應(yīng)面模型分析得出最佳的提取參數(shù)為提取時(shí)間21.8 min、溫度34.6℃、微波功率758.6 W，提取率為27.3%。

響應(yīng)面分析：根據(jù)回歸模型，由Design-Expert 8.0.6軟件繪制響應(yīng)面分析圖和等高線圖（圖3）。從響應(yīng)面分析圖中可以看出各因素交互作用對猴頭菇菌絲體蛋白質(zhì)提取率的影響：對提取率影響越大的因素，其曲線走勢會相對越陡；在等高線圖中，各因素對猴頭菇菌絲體蛋白提取率的影響體現(xiàn)在其軸向等高線的密集程度上，軸向等高線越密集，說明該因素對猴頭菇菌絲體蛋白提取率的影響越顯著。通過比較圖3中響應(yīng)面分析圖和等高線圖可以看出：超聲時(shí)間（A）與超聲溫度（B）兩因素之間的交互作用對猴頭菇菌絲體蛋白提取率的影響較為顯著，而其他因素兩兩之間的交互作用對提取率的影響較小。

2.3 猴頭菇菌絲體蛋白質(zhì)含量及其分子量的測定

經(jīng)凱氏定氮法測得猴頭菇菌絲體中蛋白質(zhì)含量為35.2%，提取所得猴頭菇菌絲體粗蛋白中蛋白質(zhì)含量為59.53%，通過SephadexG-100凝膠過柱純化后，蛋白質(zhì)含量為81.35%（過柱純化后蛋白質(zhì)得率太低僅為10%，主要為水溶性蛋白）。

樣品蛋白質(zhì)用10%濃度的分離膠，SDS-PAGE分析蛋白亞基分子質(zhì)量，結(jié)果見圖2。主要蛋白質(zhì)分子量為：過柱純化后樣品蛋白質(zhì)57 kD和35 kD（過柱用蒸餾水洗脫，主要為水溶性蛋白，蛋白濃度在0.2 mg/mL，條帶色淺）；堿液復(fù)溶后的樣品蛋白質(zhì)主要有8個(gè)條帶在90～24 kD（樣品緩沖液加20%SDS才能跑出，蛋白濃度3 mg/mL，樣品沒純化）。

圖4 猴頭菇菌絲體蛋白質(zhì)SDS-PAGE分析

3 小結(jié)與討論

猴頭菇菌絲體蛋白的等電點(diǎn)為pH 3.05。生產(chǎn)中可以在等電點(diǎn)附近沉淀蛋白質(zhì)，這樣就不會因?yàn)閜H過低而造成蛋白質(zhì)變性，如本試驗(yàn)以pH4進(jìn)行猴頭菇菌絲體蛋白沉淀，菌絲體蛋白的得率與等電點(diǎn)沉淀蛋白的得率變化不大，而且猴頭菇菌絲體蛋白保持較強(qiáng)的活性。

猴頭菇菌絲體蛋白提取試驗(yàn)結(jié)果表明，堿提酸沉法提取蛋白質(zhì)最佳條件為：料液比1∶25，pH 10.5，時(shí)間1.5 h，溫度25℃，提取率為22.75%；酶法提取蛋白質(zhì)最佳條件為：料液比為1∶25，1%木瓜蛋白酶酶液0.3 mL，溫度為25℃，提取時(shí)間為1.5 h，提取率為21.04%。堿提酸沉法優(yōu)于酶法提取。在堿提酸沉法和酶法提取的基礎(chǔ)上，確定pH10.5、料液比為1∶25，超聲波提取蛋白質(zhì)，運(yùn)用響應(yīng)面研究分析得出最佳提取條件：提取時(shí)間21.8 min，溫度34.6℃，微波功率758.6 W，提取率為27.3%。超聲波提取法比堿提酸沉法，提取率提高了20%以上。

用凝膠柱純化猴頭菇菌絲蛋白，雖提高了蛋白質(zhì)純度，但也損失了大量的不溶性蛋白質(zhì)（得率在10%左右），因此還要加強(qiáng)蛋白質(zhì)溶解性方面以及蛋白質(zhì)純化方法的研究。

經(jīng)SDS-PAGE分析猴頭菇菌絲體蛋白亞基分子質(zhì)量分析，猴頭菇菌絲體蛋白分子量為24～90 kD。

試驗(yàn)表明，超聲波提取方法提取猴頭菇菌絲體蛋白操作簡便，提取效果好，可用于工業(yè)化生產(chǎn)。