豬膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)制備的實(shí)驗(yàn)研究

鄧 飛，胡幗穎，顧漢卿

(1.北京市順義區(qū)醫(yī)院泌尿外科，北京101300；2.天津市泌尿外科研究所，天津300211)

膀胱大面積缺損由腫瘤、結(jié)核等原因引起的是臨床難題。胃腸道替代膀胱是目前最常用的方法，該方法不僅造成供區(qū)的創(chuàng)傷，而且還存在許多并發(fā)癥。近年來，隨著組織工程技術(shù)的發(fā)展，通過脫細(xì)胞方法，可以將產(chǎn)生于膀胱的膀胱粘膜下基質(zhì)作為細(xì)胞支架，再生膀胱組織，以達(dá)到修復(fù)及擴(kuò)大膀胱的目的，去除膀胱內(nèi)細(xì)胞、抗原等成分，使其表面光滑，結(jié)構(gòu)相對(duì)致密，有利于尿路上皮的粘附，且能有效阻止尿液滲入腹腔。研究者為了尋找能完全再生而無不良反應(yīng)的擴(kuò)大及替代膀胱的材料，已經(jīng)進(jìn)行了多年的研究。Meezan的脫大鼠膀胱組織的方法是最早報(bào)道的，后來的許多研究都是基于這一方法。豬與大鼠的膀胱組織不同，其膀胱平滑肌纖維較厚、粗大、機(jī)械強(qiáng)度高、脫細(xì)胞技術(shù)要求高，使用Meezan方法不能制備出合格的豬膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)，以Meezan方法為對(duì)照組。本實(shí)驗(yàn)采用改進(jìn)的Meezan的方法作為實(shí)驗(yàn)組，制備出符合脫細(xì)胞技術(shù)要求的豬膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)。

1 材料和方法

1.1 試劑

牛胰脫氧核糖核酸酶-I(DNAse-I)，牛胰核糖核酸酶-A(RNAse A)，脫氧膽酸鈉，疊氮鈉。

1.2 儀器與材料

恒溫磁力攪拌器，電熱式蒸汽消毒器，生物顯微鏡，手術(shù)相關(guān)器械，微孔濾膜濾器，微孔濾膜(膜孔=0.2 μm)等。

1.3 溶液配制

(1)配制200 mL 1 mol/L NaCl含 DNAse-I 2 000 kU溶液:NaCl 11.7 g，加入200 mL三蒸水，完全溶解混勻分裝，高溫高壓蒸汽消毒滅菌。稱量DNAse-I 3.2 mg，(600 ～1 000 kU/mg)，加入滅菌的200 mL 1 mol/L NaCl溶液中，4℃保存?zhèn)溆谩?2)配制200 mL 1 mol/L NaCl含 DNAse-I 2 000 kU、RNAse 2 000 kU溶液:稱量 DNAse-I 3.2 mg，RNAse 5 mg(400 kU/mg)，加入滅菌的200 mL 1mol/L NaCl溶液中，4℃保存?zhèn)溆谩?3)磷酸鹽緩沖鹽(PBS)溶液:NaCl 8.00 g/L，KCl 0.20 g/L，NaHPO1.56 g/L，KHPO0.20 g/L，將混勻的PBS溶液分裝鹽水瓶內(nèi)，高溫蒸汽消毒滅菌，三蒸水配制7.4% NaHCO溶液1 000 mL，微孔濾膜過濾除菌，用NaHCO溶液調(diào)節(jié)PBS溶液pH值為7.2～7.4，4℃保存?zhèn)溆谩?4)配制4%脫氧膽酸鈉和100 mL 0.1%疊氮鈉溶液:分別稱量脫氧膽酸鈉4 g和疊氮鈉0.1 g，放入100 mL三蒸水中，充分混勻，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 制備方法

1.4.1 取材與預(yù)處理方法 醫(yī)用實(shí)驗(yàn)級(jí)小型豬為取材動(dòng)物，體重約25 kg。手術(shù)當(dāng)天，使用靜脈注射氯胺酮方法麻醉，豬翻身至仰臥位，取下腹部正中切口。手術(shù)區(qū)碘酒酒精消毒，縱切皮膚、皮下脂肪層和肌肉層，拉開兩側(cè)肌肉，腹膜顯露。切開腹膜后，進(jìn)入腹腔，分開腸管，可見盆腔內(nèi)充盈的膀胱，分離膀胱周圍的筋膜組織，找到兩側(cè)的輸尿管連接部及膀胱頸，在此結(jié)扎切開，取下完整的膀胱。把膀胱尿液放盡，從中部縱行剪開膀胱，露出內(nèi)腔面，可見膀胱內(nèi)面的粘膜層，用PBS溶液反復(fù)沖洗膀胱。在0.1%疊氮鈉-PBS溶液中保存，加入預(yù)處理后的膀胱雙抗抗菌溶液，密封，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 豬膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)的制備

1.4.2.1 對(duì)照組:Meezan方法。取出預(yù)處理后的膀胱，用刀片刮去膀胱粘膜層，保留粘膜下的肌層及漿膜層，用PBS溶液反復(fù)沖洗3次后放在200 mL 1 mol/L NaCl含2 000 kU DNAse溶液中，放置在恒溫振蕩器內(nèi)，保持37℃，轉(zhuǎn)速150次/min，時(shí)間10 h后取出，PBS溶液反復(fù)清洗3次后，放在100 mL 4%脫氧膽酸鈉溶液中，37℃，恒溫振蕩，轉(zhuǎn)速150次/min，時(shí)間10 h。共進(jìn)行2次，PBS溶液反復(fù)清洗3次。取出0.5 cm×0.5 cm左右的基質(zhì)，PBS溶液沖洗，福爾馬林溶液固定，行病理切片，HE染色。將制備的基質(zhì)儲(chǔ)存于0.1%疊氮鈉-PBS溶液中，加入雙抗溶液，密封，4℃保存。

1.4.2.2 試驗(yàn)組:本試驗(yàn)改進(jìn)方法。方法步驟同上，只是處理后的膀胱放入200 mL 1mol/L NaCl含2 000 kU DNAse和2 000 kU RNAse溶液中。

2 結(jié)果

2.1 正常的豬膀胱粘膜下組織病理切片結(jié)果

參見圖1。結(jié)果顯示，平滑肌組織的纖維結(jié)構(gòu)，其間有細(xì)胞存在，成簇分布。

圖1 正常豬膀胱粘膜下組織病理切片結(jié)果

2.2 對(duì)照組Meezan方法病理切片結(jié)果

參見圖2。結(jié)果顯示，排列整齊的膠原纖維，細(xì)胞順纖維方向均勻分布，細(xì)胞仍大量存在。

圖2 Meezan方法病理切片結(jié)果

2.3 實(shí)驗(yàn)組改進(jìn)的方法病理切片結(jié)果

參見圖3。結(jié)果顯示，膠原纖維排列整齊，無細(xì)胞出現(xiàn)，也無細(xì)胞碎片存在，但細(xì)胞脫去后仍可見到結(jié)構(gòu)。因此，制備的豬膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)符合脫細(xì)胞技術(shù)要求。

圖3 本試驗(yàn)方法病理切片結(jié)果

3 討論

Meezan最早報(bào)道的大鼠膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)支架制備方法:將大鼠膀胱置于35 mm培養(yǎng)皿中，加入50 mL 10 mmol/L PBS-0.1%的疊氮鈉溶液。膀胱粘膜層用刀片刮去，留下平滑的肌層和漿膜層，用50 mL 10 mmol/L PBS-0.1%疊氮鈉溶液處理，攪拌5～6 h。用40 mL PBS溶液沖洗后，再用含2 000 kU DNAse的50 mL 1 mol/L NaCl溶液處理，攪拌6～8 h。再用0.1%疊氮鈉-4%脫氧膽酸鈉溶液50 mL處理，攪拌5～6 h，必要時(shí)可重復(fù)攪拌1次。制成的基質(zhì)使用PBS溶液清洗，儲(chǔ)存在40%的硫酸新霉素中，密封，4℃保存。Wu等類似于 Meezan的方法，從成年 Sprague Dawley鼠取出膀胱，放入蒸餾水中攪動(dòng)1 h，使細(xì)胞水解。接著用4%脫氧膽酸鈉溶液作用2～4 h，最后放在2000 kU DNAse-I的1 mol/L NaCl的溶液中作用2 h。將BAM置于PBS溶液中，溫度4℃。這種方法的特點(diǎn)是和Meezan方法次序互換，制備時(shí)間縮短。

近年來，為避免使用人工合成材料或非泌尿系組織替代材料所帶來的并發(fā)癥，研究人員積極嘗試?yán)锰烊患?xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行膀胱的修補(bǔ)與替代，采用基質(zhì)移植膀胱脫細(xì)胞化的方法進(jìn)行膀胱組織的替代重建，并且在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方面取得了可喜的研究成果。膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)是利用生物酶和相關(guān)試劑除去膀胱組織中的細(xì)胞和細(xì)胞碎片，留下細(xì)胞外基質(zhì)，成為無細(xì)胞和富含膠原、彈性蛋白、平滑肌結(jié)構(gòu)、血管框架的基質(zhì)。這種材料具有良好的生物相容性和機(jī)械穩(wěn)定性，可以作為細(xì)胞支架用于新生膀胱組織的生長替代重建，完成膀胱缺損的修補(bǔ)、成形、重建，完成膀胱的儲(chǔ)尿和排尿功能。Piechota等研究認(rèn)為，膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)移植物能完全再生膀胱壁的所有成分，體外實(shí)驗(yàn)研究再生的膀胱平滑肌纖維束與宿主的膀胱平滑肌纖維束相比，收縮力高達(dá)50%左右。Probst等使用膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)移植物用于膀胱擴(kuò)大術(shù)，由于材料取自膀胱組織，類似于宿主膀胱的機(jī)械性能、結(jié)構(gòu)和遺傳特性，經(jīng)處理后又明顯降低了抗原性，移植效果相當(dāng)滿意。膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)移植物在同種異體和異種移植中的良好表現(xiàn)及簡單的制備過程，將推動(dòng)其在未來的臨床應(yīng)用。

本研究首先采用Meezan的方法制備膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)，由圖2可見脫細(xì)胞效果不佳，且殘留細(xì)胞較多。分析失敗原因可能因?yàn)樨i與大鼠的膀胱組織不同，豬的膀胱平滑肌纖維更厚實(shí)粗大，機(jī)械強(qiáng)度高，脫細(xì)胞技術(shù)要求高，不能制得合格的豬膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)。我們根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道血管脫細(xì)胞基質(zhì)的制備方法，結(jié)合豬膀胱組織的特點(diǎn)，在生物酶解液中加入了RNAse，配合DNAse的酶解作用，并且把膀胱制成組織片斷，便于生物酶進(jìn)入到組織內(nèi)部，進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。溫度維持在37℃，有利于最大程度發(fā)揮酶解作用。病理切片(圖3)顯示，基質(zhì)內(nèi)脫去了細(xì)胞及細(xì)胞碎片，只留下排列稀疏的纖維組織，纖維之間有許多空穴，而且順纖維方向排列，推測可能是細(xì)胞在不斷攪動(dòng)震蕩時(shí)，細(xì)胞順纖維方向重新分布，當(dāng)用脫氧膽酸鈉脫去細(xì)胞膜和細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)，細(xì)胞被破壞分解進(jìn)入到清洗液中，細(xì)胞脫去后就在基質(zhì)留下空穴。對(duì)比圖2和圖3，可見圖2的細(xì)胞順纖維分布，圖3中相應(yīng)的區(qū)域有明顯的空穴，可以證明判斷的正確性。

不僅我們的研究發(fā)現(xiàn)Meezan的方法不能制得合格的豬膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)。許多研究者也有同樣的結(jié)論，對(duì)制備方法進(jìn)行了改變，主要是針對(duì)豬膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)制備的高技術(shù)難題。如Merguerian等報(bào)道的豬膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)制備方法。整個(gè)膀胱最先放在三羥甲基氨基甲烷(Tris)/KCl/EDTA和1% Triton溶液中，后放入Trizma/EDTA溶液中。然后用配備的DNAse和RNAse溶液處理后，在Tris/SDS溶液中攪動(dòng)。SDS提取后，放在70%乙醇溶液中，存儲(chǔ)在Dulbecco's PBS溶液中，放入冰箱中。另外，Brown等的方法要求更高，其材料來自屠宰場的豬，因此脫細(xì)胞技術(shù)含量更高。在30 min內(nèi)，從豬體內(nèi)迅速取出膀胱，進(jìn)行一系列脫細(xì)胞技術(shù)處理。整個(gè)膀胱放在低滲的Tris緩沖液中(pH=8.0)，含有蛋白酶抑制劑苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride)，濃度為0.35 mL/L，室溫下不斷攪動(dòng)48 h。接著放在含有1% Triton X-100和蛋白酶抑制劑的tris緩沖液，持續(xù)攪拌48 h。取出膀胱，PBS溶液清洗30 min后，室溫下使用DNAse和RNAse作用10 h。再次用PBS溶液清洗，使用含有SDS的Tris緩沖液完成進(jìn)一步脫細(xì)胞過程，時(shí)間為48 h。放入PBS溶液24 h后，制備的基質(zhì)再用70%的乙醇消毒后使用。

我們?cè)谥苽浞椒ㄖ?，結(jié)合了Merguerian PA和Brown AL方法的特點(diǎn)，但他們方法步驟較多，時(shí)間長。我們將整個(gè)制備過程分為4個(gè)質(zhì)量控制環(huán)節(jié):PBS溶液水解細(xì)胞、生物酶分解細(xì)胞內(nèi)成分、清除細(xì)胞脂質(zhì)和PBS溶液清洗。我們?cè)谥苽浞椒ㄉ希贛eezan方法基礎(chǔ)上，在 DNAse酶解過程中加入RNAse，病理切片顯示基質(zhì)內(nèi)無細(xì)胞及細(xì)胞碎片，獲得了合格的膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)通過使用200 mL 1mol/L NaCl含DNAse-I 2 000 kU和RNAse 2 000 kU溶液，將處理后的膀胱粘膜下基質(zhì)，在37℃恒溫振蕩10 h，轉(zhuǎn)速150次/min，PBS溶液反復(fù)清洗3次后放在100 mL 4%脫氧膽酸鈉溶液中，37℃恒溫振蕩10 h，轉(zhuǎn)速150次/min，進(jìn)行2次，PBS溶液反復(fù)清洗3次，制備出豬膀胱脫細(xì)胞基質(zhì)，滿足了脫細(xì)胞要求，可以作為支架用于動(dòng)物移植的實(shí)驗(yàn)研究。