食品中植物源性成分的檢驗(yàn)技術(shù)研究與應(yīng)用進(jìn)展

王利剛 費(fèi)云滟 陳 欣 周正海 黃思瑜 趙 博

（重慶市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)研究院 重慶 401121）

1 前言

隨著社會(huì)的進(jìn)步，我國的食品工業(yè)發(fā)展迅速，市場(chǎng)上可供消費(fèi)者選擇的食品也越來越多。一些生產(chǎn)廠家為了追求更高的經(jīng)濟(jì)利益，會(huì)在產(chǎn)品中添加一些價(jià)格相對(duì)低廉的植物源性成分，如核桃飲料中添加大豆、花生等成分[1]，芝麻醬中添加花生、玉米粉[2]，或者在動(dòng)物源性產(chǎn)品中添加植物源性成分，如羊奶粉中添加大豆成分[3]，這種行為不僅損害了消費(fèi)者的權(quán)利，還可能威脅食用者的身體健康，如果添加的成分中含有對(duì)某些食用者的過敏源，則可能導(dǎo)致嚴(yán)重的過敏反應(yīng)。

對(duì)食品中植物源性成分的檢驗(yàn)方法多集中于分子生物學(xué)方法，其中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）及其衍生方法應(yīng)用最為廣泛，但是也有學(xué)者就蛋白電泳[4]、氣相色譜[5]、電子鼻[6]技術(shù)等方向進(jìn)行了相關(guān)的探索。本文對(duì)廣泛使用的PCR及其衍生方法的發(fā)展以及其他方法的探索進(jìn)行綜述，以期能為食品中植物源性成分的檢驗(yàn)技術(shù)的進(jìn)一步發(fā)展提供參考。

2 PCR及其衍生方法

2.1 PCR法

PCR建立于1983年，1988年后PCR在科學(xué)界的應(yīng)用快速發(fā)展，可靠性也不斷提高，如今在PCR原理的基礎(chǔ)上發(fā)展出了許多實(shí)驗(yàn)方法。PCR是一種核酸體外擴(kuò)增技術(shù)，針對(duì)目標(biāo)序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過控制溫度，使反應(yīng)體系中的Taq酶以目標(biāo)序列為模板，以dNTP為原料，反復(fù)變性、退火、延伸3個(gè)步驟，約30個(gè)循環(huán)即可對(duì)目標(biāo)序列的片段成百萬倍的放大[7，8]，通過對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，就可以確定是否存在目標(biāo)成分。

使用PCR法檢驗(yàn)食品中的植物源性成分已經(jīng)發(fā)展成熟，對(duì)某些特定食品或者整個(gè)食品大類的植物源性成分的研究表明，PCR法的特異性、靈敏度、精確度都能達(dá)到檢驗(yàn)要求，其中某些植物源性成分的檢測(cè)已經(jīng)以內(nèi)源基因等形式存在于植物轉(zhuǎn)基因成分檢測(cè)、過敏源性成分檢驗(yàn)的相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中。已有相關(guān)地區(qū)采用PCR方法作為食品監(jiān)管風(fēng)險(xiǎn)監(jiān)測(cè)的依據(jù)。部分研究者的相關(guān)研究成果詳見表1。

表1 目標(biāo)基因、引物相關(guān)信息

2.2 實(shí)時(shí)熒光PCR法

實(shí)時(shí)熒光 PCR（Real-time PCR，RT-PCR）是PCR技術(shù)的衍生技術(shù)，其在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)的變化實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)PCR反應(yīng)中每一個(gè)循環(huán)擴(kuò)增產(chǎn)物量的變化，通過閾值循環(huán)數(shù)（Ct值）和標(biāo)準(zhǔn)曲線對(duì)起始模板進(jìn)行分析[19]。RT-PCR相對(duì)傳統(tǒng)PCR增加了熒光信號(hào)，可分為擴(kuò)增序列特異和非特異的檢測(cè)兩大類，擴(kuò)增序列非特異性檢測(cè)方法的基礎(chǔ)是DNA結(jié)合的熒光分子。如SYBR green I等熒光染料，熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號(hào)[20]，擴(kuò)增序列特異性檢測(cè)方法是在PCR反應(yīng)中利用標(biāo)記熒光染料的基因特異寡核苷酸探針來檢測(cè)產(chǎn)物，目前應(yīng)用最廣泛、最典型的代表就是TaqMan系統(tǒng)，需要設(shè)計(jì)特異性的熒光探針（表2），兩端分別標(biāo)記一個(gè)報(bào)告熒光基團(tuán)和一個(gè)淬滅熒光基團(tuán)，當(dāng)PCR擴(kuò)增時(shí)，探針的熒光基團(tuán)會(huì)被Taq酶的5’-3’外切酶活性切除下來，從而產(chǎn)生熒光[21]。

該技術(shù)可對(duì)檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行實(shí)時(shí)跟蹤，免去了PCR后進(jìn)行電泳觀察的步驟，還可以對(duì)DNA模板進(jìn)行定量，相對(duì)于傳統(tǒng)PCR，其靈敏度、特異性和可靠性更高，同時(shí)具有自動(dòng)化程度高、無污染性、具實(shí)時(shí)性等優(yōu)點(diǎn)[22]，目前RT-PCR已廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物源性成分檢驗(yàn)。RT-PCR法檢驗(yàn)植物源性成分以內(nèi)源基因的形式存在于出入境檢驗(yàn)檢疫行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)中，且食品監(jiān)督管理部門也專門制定并發(fā)布了相關(guān)的補(bǔ)充檢驗(yàn)方法。

2.3 數(shù)字PCR法

數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Digital Polymer-ase Chain Reaction，dPCR）是繼普通PCR和RT-PCR之后的第3代PCR技術(shù)，是基于單分子目標(biāo)基因PCR擴(kuò)增的絕對(duì)定量PCR技術(shù)。該技術(shù)通過微滴化處理或者微孔式芯片將PCR反應(yīng)液分配到獨(dú)立的反應(yīng)室中，理論上每個(gè)獨(dú)立反應(yīng)室中的目標(biāo)核酸不超過1拷貝，獨(dú)立進(jìn)行熒光PCR擴(kuò)增，通過對(duì)每個(gè)反應(yīng)室進(jìn)行檢測(cè)、統(tǒng)計(jì)陽性和陰性反應(yīng)的數(shù)量，根據(jù)泊松分布進(jìn)行校正，最終計(jì)算出初始樣品中目標(biāo)核酸的精確拷貝數(shù)[36-38]。

表2 目標(biāo)基因、引物及探針相關(guān)信息

國內(nèi)dPCR用于食品中源性成分檢驗(yàn)的研究大多為動(dòng)物源性成分檢驗(yàn)，王珊等[39]建立了一種定量檢測(cè)羊肉制品中羊源和豬源性成分的微滴式數(shù)字PCR方法，并將該方法與行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SN/T 2051—2008中實(shí)時(shí)熒光PCR方法做對(duì)比，結(jié)果表明2種方法均能檢出樣品含有的羊源和豬源性成分，而微滴式數(shù)字PCR方法（ddPCR）能夠?qū)NA模板定量分析。苗麗等[40]為準(zhǔn)確定量肉及肉制品中羊源性成分的含量，建立的微滴數(shù)字PCR定量檢測(cè)系統(tǒng)能夠準(zhǔn)確檢測(cè)出不同樣品中羊肉的含量，并發(fā)現(xiàn)可能存在摻假現(xiàn)象，建立的微滴數(shù)字PCR定量方法在肉及肉制品中羊源性成分檢測(cè)方面具有較大的應(yīng)用潛力。王強(qiáng)等[41]利用ddPCR技術(shù)對(duì)食品和飼料中鵝源性成分進(jìn)行檢測(cè)與精確定量，所設(shè)計(jì)的引物及探針具有良好的種間特異性和種內(nèi)保守性，可用于對(duì)食品和飼料中鵝源性成分進(jìn)行檢測(cè)和精確定量。鄧珍丹[42]建立肉制品含有不同的雞、牛、羊、豬、鴨源性成分檢測(cè)的微滴數(shù)字PCR定量檢測(cè)方法，能夠更加快速、有效的檢測(cè)出動(dòng)物源性成分，特異性強(qiáng)，方法快速準(zhǔn)確。史艷宇等[43]建立的鴨源性成分檢測(cè)方法能夠有效對(duì)鴨源性成分進(jìn)行檢測(cè)，特異性強(qiáng)，靈敏度高，并且其他物種成分的存在對(duì)方法靈敏度檢測(cè)沒有影響，可以實(shí)現(xiàn)畜肉食品中的鴨源性成分檢測(cè)。

dPCR用于食品中植物源性成分檢驗(yàn)的研究相對(duì)較少，楊碩等[44]為市售核桃乳中核桃源及主要摻雜物種大豆兩種源性成分建立準(zhǔn)確、快速定量檢測(cè)方法，結(jié)果顯示該方法引物探針特異性好，目標(biāo)物種間無交叉反應(yīng)；靈敏度高，核桃中摻雜大豆的質(zhì)量檢測(cè)限為0.5%，相對(duì)誤差為5.6%。多重微滴式數(shù)字PCR準(zhǔn)確、快速的定量方法可作為鑒別核桃乳中摻雜使假問題的有效手段。楊碩等建立了市售椰子汁飲料產(chǎn)品中目的種源成分（椰子）和非目的種源成分（大豆、花生）的分子生物學(xué)檢測(cè)鑒定方法，研究顯示ddPCR法對(duì)可疑結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證可避免假陽性結(jié)論[45]。

3 其他檢驗(yàn)方法

3.1 蛋白電泳

通過十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳法（Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE），可鑒定核桃、杏仁、花生、大豆中的蛋白成分。方法采用植物活性蛋白質(zhì)提取試劑盒分別提取預(yù)處理后的核桃、杏仁、花生、大豆等樣品中的蛋白質(zhì)成分，計(jì)算蛋白質(zhì)的相對(duì)分子量，之后分別進(jìn)行SDS-PAGE檢測(cè)得到這幾種蛋白成分的特征條帶，并對(duì)不同樣品中蛋白成分的電泳圖譜進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果顯示，每一物種都有相對(duì)應(yīng)的蛋白指紋圖譜，不同種類的核桃含有相同的蛋白質(zhì)亞基，具有高同源性，但核桃與花生、黃豆和杏仁含有不同種類大小的蛋白，具有高特異性。吳亞君等[46]通過優(yōu)化條件，建立牛乳毛細(xì)管凝膠電泳方法，檢測(cè)到大豆水解蛋白標(biāo)志峰，分別測(cè)定純大豆水解蛋白溶液及牛乳-大豆水解蛋白混合溶液中的水解蛋白標(biāo)志峰峰面積-濃度線性關(guān)系，并將毛細(xì)管電泳與SDS-PAGE垂直板電泳及蛋白芯片電泳進(jìn)行比較，驗(yàn)證了毛細(xì)管電泳結(jié)果。

3.2 色譜法

呂品等[47]采用高效液相色譜-離子阱-飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)飲料中生物堿、皂苷和有機(jī)酸等24種植物源性成分進(jìn)行快速篩查、定性識(shí)別和準(zhǔn)確定量。研究表明，24種化合物在50～750 μg/L范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)均大于0.995。樣品中各化合物的檢出限為 8～20 μg/L。 在 3 種添加量（70 μg/L、250 μg/L、700 μg/L)條件下，其平均回收率為63.0%～126.6%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為4.11%～14.73%。該方法利用精確質(zhì)量數(shù)匹配和自建標(biāo)準(zhǔn)庫檢索，實(shí)現(xiàn)快速篩查，并使用多級(jí)特征碎片離子進(jìn)行確證，具有快速、高效、準(zhǔn)確等優(yōu)點(diǎn)。李瑩瑩等[48]采用基于液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)測(cè)定肉類食品中多種植物源性成分的方法，檢測(cè)肉類食品中的特征多肽，并與標(biāo)準(zhǔn)植物成分的特征多肽進(jìn)行比較，從而判定對(duì)應(yīng)的植物源性成分，可實(shí)現(xiàn)對(duì)特征性多肽的快速篩選以及對(duì)肉類多種植物源性成分的準(zhǔn)確鑒別，且方法在目標(biāo)蛋白篩選過程進(jìn)行了優(yōu)化，集中有效目標(biāo)蛋白的數(shù)量，提高了特異性多肽的篩選速度和效率。為了檢測(cè)樣品中是否含有山崳酸以及檢測(cè)核桃乳中是否摻有花生乳，可通過高效液相色譜法檢測(cè)樣品中是否含有大豆異黃酮來鑒別核桃乳中是否摻有大豆乳。

3.3 電子鼻

電子鼻檢測(cè)技術(shù)是一種分析、識(shí)別物質(zhì)“風(fēng)味”的新型檢測(cè)手段，能夠模擬人類的鼻子檢測(cè)風(fēng)味物質(zhì)，具有分析快，結(jié)果可靠等優(yōu)點(diǎn)。采用電子鼻對(duì)市售不同品牌及不同品種的芝麻醬進(jìn)行識(shí)別，并在芝麻醬中分別添加不同比例的自制花生醬進(jìn)行摻假，對(duì)電子鼻響應(yīng)信號(hào)進(jìn)行主成分分析、辨別因子分析、偏最小二乘回歸分析和統(tǒng)計(jì)質(zhì)量控制分析的結(jié)果表明，電子鼻能有效識(shí)別不同品牌的黑芝麻醬、白芝麻醬及混合芝麻醬；各摻假芝麻醬樣品隨著摻假比例的增加（0%、5%、10%、20%、40%、60%、80%、100%），樣品的分布呈現(xiàn)出一定的規(guī)律性，電子鼻響應(yīng)信號(hào)與摻假樣品之間有較好的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)為0.99；對(duì)摻假芝麻醬建立了偏最小二乘回歸模型，模型預(yù)測(cè)值誤差為0.7%～2.7%。

4 討論

在實(shí)際工作中，PCR法存在一些缺點(diǎn)，如結(jié)果觀察依賴于瓊脂糖電泳，存在環(huán)境污染和人員危害的風(fēng)險(xiǎn)；電泳條帶的大小不能完全確定是否與目標(biāo)條帶大小一致；出現(xiàn)陽性結(jié)果時(shí)還需進(jìn)一步進(jìn)行測(cè)序進(jìn)行確認(rèn)等。若設(shè)計(jì)多重PCR開展多個(gè)項(xiàng)目的檢驗(yàn)，不僅需要在設(shè)計(jì)引物時(shí)考慮引物與引物、引物與模板之間的影響，還要考慮反應(yīng)條件的協(xié)調(diào)，在能滿足以上設(shè)計(jì)需求的情況下，在結(jié)果觀察時(shí)還需要考慮產(chǎn)物條帶的大小，回收時(shí)是否有條帶重疊的情況等，因此，目前尚無開發(fā)多重PCR的報(bào)道。

隨著實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)的發(fā)展，現(xiàn)在已經(jīng)有多種熒光素進(jìn)行標(biāo)記，比如，Cy5、HEX、VIC、FAM、Cyan500、ROX、Red640 等，因此，如果設(shè)計(jì)合理，原則上可實(shí)現(xiàn)同一反應(yīng)中同時(shí)檢測(cè)多個(gè)源性成分的多重PT-PCR方法。在動(dòng)物源性成分檢測(cè)中，有相關(guān)學(xué)者建立了同一管中同時(shí)檢測(cè)出豬、牛、羊、雞、鴨、鵝源性成分的六重實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，在植物源性成分檢驗(yàn)中也有學(xué)者進(jìn)行探索[50]。

dPCR目前應(yīng)用并不多，但由于其自身的特點(diǎn)可以獲得絕對(duì)定量的結(jié)果，可以應(yīng)用于某些食品的含量檢驗(yàn)中。如GB/T 19855—2015《月餅》[51]細(xì)化了蓮蓉月餅的蓮蓉類餡料中蓮子的含量應(yīng)該不低于60%、蓮子含量為100%才能稱為純蓮蓉；栗蓉類月餅的餡料中板栗含量不能低于60%等條件內(nèi)容，目前尚無具體方法進(jìn)行檢驗(yàn)，而dPCR在這一領(lǐng)域具有較好的前景。

電泳法也屬于分子生物學(xué)方法，對(duì)蛋白分子電泳后，通過比較分析分辨是否摻有其他植物源性成分；色譜法和電子鼻等技術(shù)屬于成分分析法，通過篩選獲得特定的目標(biāo)成分作為標(biāo)志物，以此作為其他植物源性成分的指征，這些方法都需要在前期進(jìn)行大量的統(tǒng)計(jì)、分析、篩選工作，以確保實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性，在實(shí)際工作中具有較強(qiáng)的探索意義。

隨著食品安全監(jiān)管對(duì)食品中植物源性成分檢驗(yàn)技術(shù)的需求增加，現(xiàn)階段RT-PCR正逐步成為主流的檢驗(yàn)技術(shù)，且食品安全監(jiān)管部門已經(jīng)發(fā)布基于RTPCR的食品補(bǔ)充檢驗(yàn)方法作為檢驗(yàn)依據(jù)，但隨著監(jiān)管維度的擴(kuò)寬和力度的加深，其他方向的檢驗(yàn)方法也會(huì)在日后檢驗(yàn)技術(shù)的發(fā)展之中占有一席之地。