抗耐甲氧西林金黃色葡萄球菌的中藥化學(xué)成分虛擬篩選△

雷蕾，楊策，亢力，邢雁輝，武紅莉，王忠*

1.中國中醫(yī)科學(xué)院 中醫(yī)藥信息研究所，北京 100700；2.中國中醫(yī)科學(xué)院 中醫(yī)臨床基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所，北京 100700

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(methicillin-resistant staphy lococcus aureus，MRSA)是多藥耐藥性感染的最常見原因之一，具有顯著的發(fā)病率和病死率，已成為醫(yī)院感染和社區(qū)獲得性感染的重要病原菌之一[1]。隨著MRSA對所有種類的抗生素逐漸產(chǎn)生耐藥性，它變得越來越難以控制。因此，筆者們一直在尋找新的藥物來對抗MRSA。

中醫(yī)藥是我國醫(yī)學(xué)瑰寶，隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化發(fā)展，越來越多的中藥化學(xué)成分被分離出來，為新藥開發(fā)提供了寶貴的資源。已經(jīng)有很多從天然產(chǎn)物中開發(fā)出新藥的例子，例如青蒿素的開發(fā)[2]和長春堿的開發(fā)[3]。然而，傳統(tǒng)生物測定篩選的成本高昂。近年來，分子對接方法已成為計算機輔助藥物研究領(lǐng)域的一項重要技術(shù)。它是通過受體的特征以及受體和藥物分子之間的相互作用方式來進行藥物篩選的方法，可以有效地在進行傳統(tǒng)生物學(xué)測定之前進行虛擬篩選，從而降低新藥開發(fā)的成本，并提高命中率。

本研究收集了文獻中有抗菌或者抑菌報道的中藥以及中藥包含的化學(xué)成分，希望篩選出可能具有抗MRSA的化合物。因此，使用分子對接的方法對283味中藥中包含的6193個化學(xué)成分與常見MRSA抑制靶標(biāo)青霉素結(jié)合蛋白2a(PBP2a)進行了分子對接，得到的研究結(jié)果希望能給新藥開發(fā)人員以有價值的參考。

1 資料與方法

1.1 平臺和軟件

本研究所有工作均在Microsoft Windows 2007操作系統(tǒng)中完成，采用Accelrys 公司的Discovery Studio 4.5(DS4.5)軟件。參數(shù)設(shè)置除特殊指明，均為默認值。本研究使用的是CDOCKER程序，是基于CHARMm的柔性對接程序，采用soft-core potentials以及optional grid representation將配體分子與受體活性位點進行對接。首先采用動力學(xué)的方法隨機搜索小分子構(gòu)象，隨后采用模擬退火的方法將各個構(gòu)象在受體活性位點區(qū)域進行優(yōu)化，從而使對接結(jié)果更加準確。分子的吸收、分布、代謝、排泄、毒性(ADMET)計算也是使用DS4.5完成的。

1.2 受體的準備

PBP2a的3D結(jié)構(gòu)(PDB ID：3ZG0，2.60 ?)從Protein Data Bank網(wǎng)站下載(https：//www.rcsb.org/)。MRSA具有多重耐藥性，其產(chǎn)生機制是PBPs改變的結(jié)果，高度耐藥性是由于原有的PBP2與PBP3之間產(chǎn)生一種新的PBP2′(即PBP2a)，低、中度耐藥是PBPs的產(chǎn)量增多或與甲氧西林等親和力下降所致。

PBP2a晶體學(xué)研究給出了抑制劑與蛋白在變構(gòu)位點和活性位點相互作用的信息，變構(gòu)結(jié)合域位于距離dd-轉(zhuǎn)肽酶活性位點60 ?的位置。當(dāng)配體在變構(gòu)位點占用時，多殘留構(gòu)象變化在活性位點達到頂峰，從而允許抑制劑進入[4]。3ZG0是蛋白與2個分子的ceftaroline(頭孢洛林)共結(jié)晶體，配體ceftaroline(ID：1W8)成功觸發(fā)了PBP2a構(gòu)象變化，使蛋白的活性部位可以與另一個ceftaroline分子(ID：AI8)結(jié)合。ceftaroline是FDA批準的抗MRSAβ-內(nèi)酰胺抗生素。目前3ZG0已經(jīng)用于抗MRSA藥物的虛擬篩選[5-6]。

本研究受體的準備和結(jié)合口袋的定義為刪除水分子、原配體分子及其非相關(guān)的蛋白質(zhì)構(gòu)象，經(jīng)clean protein工具處理，再加CHARMm力場進行能量優(yōu)化，定義蛋白為受體，以它的原配體位置為中心，選擇半徑0.50 nm 范圍的殘基為活性殘基，將其定義sphere球，此范圍內(nèi)的空腔為結(jié)合口袋，最后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 配體數(shù)據(jù)的組建

檢索中國生物醫(yī)學(xué)文獻數(shù)據(jù)庫(SinoMed)、中國期刊全文數(shù)據(jù)庫(CNKI)，萬方數(shù)據(jù)庫和維普數(shù)據(jù)庫。檢索詞有：“抑菌”“抗菌”“藥理作用”。時間限制為1949年1月—2017年12月。納入標(biāo)準：采集對中藥或者中藥提取物的藥理作用進行研究的文獻。排除標(biāo)準：排除文獻研究、綜述、非藥理實驗文獻、理論探討、臨床研究、單體成分藥理實驗報道以及重復(fù)報道的文獻。數(shù)據(jù)由人工摘錄的方式從文獻中收集與中藥、中藥提取物和藥理作用相關(guān)的信息。在本研究中，中藥提取物統(tǒng)一為中藥名稱，例如黃芩乙醇提取物規(guī)范統(tǒng)一為黃芩，梔子提取物統(tǒng)一為梔子。最后，根據(jù)計算系統(tǒng)生物學(xué)實驗室TCMSP(http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php)，檢索出化學(xué)成分。

因為中藥常水煎口服，在體內(nèi)需經(jīng)吸收(absorption)、分布(distribution)、代謝(metabolism)以及排泄(excretion)過程，這個過程簡稱ADME。為了預(yù)測化合物ADME的性質(zhì)，本研究以口服生物利用度(OB≥30%)和類藥性(DL≥0.18)為條件篩選化合物。將化合物的mol2格式文件導(dǎo)入DS4.5中，首先依據(jù)Linpiski規(guī)則進行篩選，然后使用small molecules-prepare ligand進一步將配體產(chǎn)生三維結(jié)構(gòu)，加氫，產(chǎn)生異構(gòu)體等。最后使用small molecules-minimize ligands，加CHARMm力場進行能量最小化，保存為分子對接的配體分子集。

1.4 對接方法可信性驗證

含有原配體的蛋白晶體復(fù)合結(jié)構(gòu)，將原配體抽離，然后按設(shè)定的參數(shù)對接回其結(jié)合口袋，計算對接后最高打分的構(gòu)象與原配體結(jié)構(gòu)的均方根偏差值(RMSD)，一般RMSD≤0.20 nm[7]則認為該對接方法可行，說明該套參數(shù)能較好地重現(xiàn)此配體與受體的結(jié)合模式。

1.5 配體分子與受體靶點對接參數(shù)

將上述配體和受體導(dǎo)入DS4.5，調(diào)用CDOCKER對接模塊，參數(shù)均為默認值。

變構(gòu)位點結(jié)合口袋的位置是X=9.965 744，Y=52.253 615，Z=23.244 846，結(jié)合口袋的半徑為11.520 969 ?。

活性位點結(jié)合口袋的位置是X=-35.986 667，Y=44.388 051，Z=66.823 564，結(jié)合口袋的半徑為12.883 887 ?。

1.6 結(jié)果處理

對接完成后，以原配體的對接interaction energy為參考，值高于原配體的予以保留，得到潛在有活性的化合物。

2 結(jié)果

2.1 抑菌抗菌中藥統(tǒng)計

本研究共檢索出252篇文獻，一共出現(xiàn)283味中藥，其中頻次在前10位的見表1。

表1 文獻檢索頻次在前10位的抑菌抗菌中藥

2.2 化學(xué)成分統(tǒng)計

在283味中藥中包含了6193個化學(xué)成分，以O(shè)B≥30%和類藥性DL≥0.18為條件篩選出化合物1137個。進一步使用Linpiski規(guī)則篩選出907個化合物。Lipinski規(guī)則，即類藥五原則(rule of five)，其內(nèi)容如下：1個小分子藥物中要具備以下性質(zhì)：分子量<500；氫鍵給體數(shù)目<5；氫鍵受體數(shù)目<10；脂水分配系數(shù)<5；可旋轉(zhuǎn)鍵的數(shù)量不超過10個。

2.3 可行性驗證結(jié)果

選取3ZG0含有原配體的復(fù)合結(jié)構(gòu)晶體，將原配體抽離，再對接回其結(jié)合口袋，計算對接后構(gòu)象與原配體結(jié)構(gòu)的RMSD 值，<0.2 nm說明該對接方法、所選用的晶體結(jié)構(gòu)及參數(shù)的設(shè)定可行。

2.4 變構(gòu)部位分子對接

將原配體ceftaroline對接回變構(gòu)部位結(jié)合口袋，得到interaction energy為-54.89。完成對接后，能量低于它的化合物有66個，結(jié)合能最低的10個化合物見表2。

2.5 活性部位分子對接

將原配體ceftaroline對接回活性部位結(jié)合口袋，得到interaction energy為-68.65，能量低于它的化合物有6個，見表3。

2.6 作用模式分析

為了研究突變體結(jié)構(gòu)與活性化合物的結(jié)合親和力，進行了作用模式的分析。變構(gòu)位點在整個對接過程中至關(guān)重要，必須先有1個分子與變構(gòu)位點結(jié)合，觸發(fā)PBP2a構(gòu)象變化，使蛋白的活性部位可以與另1個分子結(jié)合，從而達到抗MRSA的作用。實際上，PBP2a表現(xiàn)出耐藥性，是因為在PBP2a的變構(gòu)位點(146位和150位)上發(fā)生了2個氨基酸的變化，這2個氨基酸的變化對頭孢類藥物產(chǎn)生了抗藥性，導(dǎo)致了頭孢類藥物耐藥MRSA菌株的增加[4]。本研究發(fā)現(xiàn)了23個化合物與146位氨基酸殘基可以通過氫鍵和范德華力結(jié)合。而在3ZG0活性位點上，6個化合物除了范德華力和氫鍵外，還通過鹽橋、ππ相互作用等與周圍的蛋白質(zhì)殘基相結(jié)合。

本研究發(fā)現(xiàn)，不論是變構(gòu)部位還是活性部位，lupiwighteone和syringaresinol diglucoside_qt都能以較為穩(wěn)定的構(gòu)象與3ZG0結(jié)合。syringaresinol diglucoside_qt是syringaresinol diglucoside的去糖基的代謝產(chǎn)物，可以認為是腸道菌水解產(chǎn)物。也就是說，lupiwighteone和syringaresinol diglucoside_qt就像一把鑰匙，1個分子可以先與變構(gòu)位點結(jié)合，觸發(fā)PBP2a構(gòu)象變化，使蛋白的活性部位可以與另1個分子結(jié)合，從而達到抗MRSA的作用。

表2 變構(gòu)部位結(jié)合能最低的10個化合物

續(xù)表2

表3 活性部位結(jié)合能低于原配體的化合物

續(xù)表3

3 討論

耐甲氧西林金黃色葡萄球菌對目前所有廣譜抗生素都表現(xiàn)出耐藥性，對公眾構(gòu)成嚴重威脅。在中藥抗耐藥菌的研究中，田應(yīng)彪等[8]觀察了五倍子、黃連、黃柏等16種中藥水煎液對MRSA和MSSA體外抑菌作用，黃文玉等[9]發(fā)現(xiàn)了大蒜、馬齒莧、野菊花等27種清熱解毒中藥對葡萄球菌耐藥菌株的作用，謝大澤等[10]報道了黃連等中藥對淋菌耐藥菌株體外抗菌活性的研究工作。中藥逐漸在耐藥菌的研究中嶄露頭腳，因此本研究希望可以從具有抗菌抑菌作用的中藥中尋找到抗MRSA的候選物，進而為新藥開發(fā)提供參考。

為了能夠盡可能地篩選出候選物，在進行虛擬篩選之前，本研究就使用化合物的ADME的性質(zhì)和Lipinski規(guī)則進行了初步篩選。這一方面可以減少分子對接的計算量，另一方面可以保證最后得到的化合物會有更好的藥代動力學(xué)性質(zhì)，在生物體內(nèi)代謝過程中會有更高的生物利用度，因而也更有可能成為口服藥物。摒除了那些不適合成為藥物的分子，縮小篩選的范圍，并降低藥物研發(fā)成本。

PBP2a蛋白結(jié)構(gòu)很特殊，它有一個變構(gòu)位點，一個活性位點。變構(gòu)位點就像一扇門，打開了它，活性位點才能有效結(jié)合藥物分子。本研究發(fā)現(xiàn)了66個可以與變構(gòu)位點良好結(jié)合的中藥化學(xué)成分，它們都可以作為鑰匙打開第一扇門。同時發(fā)現(xiàn)了6個可以與活性位點良好結(jié)合的成分。值得一提的是，不論是變構(gòu)部位還是活性部位，來自甘草和山豆根的lupiwighteone和來自女貞子的syringaresinol diglucoside_qt都能以較為穩(wěn)定的構(gòu)象與3ZG0結(jié)合。也就意味著lupiwighteone和syringaresinol diglucoside_qt有可能像上市藥物ceftaroline一樣，以2個分子的形式與PBP2a蛋白相結(jié)合，從而達到抗MRSA的目的。