Thermobifida fusca麥芽三糖淀粉酶的重組表達及其在麥芽三糖制備中的應用

胡凡，宿玲恰，吳敬*

1(食品科學與技術(shù)國家重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122) 2(工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)

麥芽三糖淀粉酶(maltotriose-forming α-amylase，EC 3.2.1.11 6，AmyA)由基因tfa編碼，是一種GH13家族的糖苷水解酶。該酶以淀粉或糊精為底物，水解糖鏈中的α-(1→4)糖苷鍵，通過內(nèi)切或外切作用產(chǎn)生麥芽三糖及少量副產(chǎn)物。麥芽三糖是由3個葡萄糖單元經(jīng)α-(1→4)糖苷鍵連接而成的麥芽低聚糖，耐熱耐酸性能比蔗糖、葡萄糖好，不易發(fā)生美拉德反應，用于食品能很好地保護顏色[1]。此外，麥芽三糖滲透壓低，持水性和抗結(jié)晶性好。它還能促進人體對鈣的吸收以及人體有益菌的繁殖，防止蛋白質(zhì)變性，抑制淀粉老化，是一種理想的保健食品原料[2-4]。

1978年，日本KATSUO首先發(fā)現(xiàn)鏈霉菌(Streptomycesgriseus)NA-468能產(chǎn)生一種淀粉酶水解可溶性淀粉產(chǎn)生大約55%的麥芽三糖[5]。隨后，國內(nèi)外相繼研究了BacillussubtilisG3[6]、Microbacteriumimperiale[7]、ChloroflexusaurantiacusJ-10-F1[8]、Natronococcussp. Strain Ah-36[9]、Streptococcusbovis148[10]、ThermobifidafuscaNTU22[11]、Brachybacteriumsp. Strain LB25[12]、Sclerotiniasclerotiorum[13]、Endomycopsisfibuligera[14]、AspergillusnigerCBS513.88[15]等來源的麥芽三糖淀粉酶，其中部分麥芽三糖淀粉酶性質(zhì)參見表1。

表1 不同物種來源麥芽三糖淀粉酶性質(zhì)對照

注：“N.D.”表示未被檢測或鑒定；GenBank/簡稱一列中，“/”前代表GenBank accession number，“/”后表示酶的簡稱；除特殊文獻標注外，表格內(nèi)容參看參考文獻一欄

在上述麥芽三糖淀粉酶中，MiAmyA(商品名為AMT 1.2L)目前只由日本Amano公司生產(chǎn)，該酶先后被日本TAKASAKI等[7]、中國吳春森等[16, 23]、徐貴華等[18]報道，其水解小麥淀粉制備麥芽三糖終產(chǎn)率為47.6%[18]，中國團隊對該酶的研究都是從Amano購買，這極大限制了國內(nèi)麥芽三糖相關(guān)產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。2008年，NORIYUKI等[12]將來源于Brachybacteriumsp. strain LB25的麥芽三糖淀粉酶作用于可溶性淀粉，麥芽三糖終產(chǎn)率為49.24%，但是該酶在40 ℃以上極不穩(wěn)定，不利于工業(yè)應用。

本研究首次將ThermobifidafuscaNTU22來源的麥芽三糖淀粉酶(TfAmyA，編碼基因為Tftfa，NCBI登錄號ABF13430[20])在食品安全菌株[24]BacillussubtilisWS11中進行了分泌表達，并對重組酶進行了酶學定性，在此基礎(chǔ)上探究了制備麥芽三糖的工藝，為麥芽三糖淀粉酶的工業(yè)生產(chǎn)中打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒

BacillussubtilisWS11[25]、EscherichiacoliJM109、pET-20b-Tftfa(本實驗室前期構(gòu)建)、本實驗室改造的高效表達載體pHY300PLK(含有g(shù)4基因)[25]。

1.1.2 酶及主要試劑

限制性內(nèi)切酶Q.cutXbaⅠ、Q.cutNotⅠ，寶生物工程(大連)有限公司；DNA聚合酶2×Phanta Max Master Mix、一步克隆試劑盒ClonExpress Ⅱ One Step Cloning Kit，南京諾唯贊生物科技有限公司；SDS-PAGE凝膠快速配制試劑盒，碧云天生物技術(shù)；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒TIANgel Midi Purification Kit，天根生化科技(北京)有限公司；蛋白胨、酵母粉，英國Oxiod；其他試劑均為國產(chǎn)分析純，購自國藥集團。普魯蘭酶粗酶液，實驗室制備并保存，酶活力為4 000 U/mL。

1.1.3 主要儀器

LS-B50L型立式圓形壓力蒸氣滅菌器，上海醫(yī)用核子儀器廠；SHA-1102C空氣恒溫搖床，上海精密儀器儀表有限公司；Agilent 1200高效液相色譜系統(tǒng)，美國Agilent公司；DYY-6C型核酸電泳儀，北京六一電泳儀廠：FE28-Standard pH計，瑞士Mettler-Toledo公司；超聲波細胞粉碎機，寧波新芝生物科技股份有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱，上海醫(yī)療器械研究所；DKB-600A型電熱恒溫水槽，上海森信實驗儀器有限公司；凝膠成像系統(tǒng)，Bio-Rad 公司；UV-1700紫外可見分光光度計，日本Shimadzu公司；HZ-9212SB恒溫水浴搖床，太倉市華利達實驗設(shè)備有限公司。

1.1.4 培養(yǎng)基

LB液體培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉5，蛋白胨10，NaCl 10；氨芐青霉素(Amp 100 μg/mL)或者四環(huán)素20 μg/mL，固體培養(yǎng)基還應加上瓊脂粉15～20。

TB發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：酵母粉24，蛋白胨12，KH2PO42.31，K2HPO412.54，甘油5；四環(huán)素終質(zhì)量濃度為20 μg/mL。

1.2 實驗方法

1.2.1 引物設(shè)計

依據(jù)載體pHY300PLK和Tftfa基因序列，設(shè)計以下引物(由5’→3’端，下劃線部分代表同源臂序列)：

pHY300PLK F1：AAGCTTGGTAATAAAAAAACACCTCCA

pHY300PLK R1：CATGGCTTCAGCACTCGCAG

1.2.2 PCR獲得載體和基因片段

分別以pHY300PLK-g4和pET-20b-Tftfa為模板，F(xiàn)1/R1、F2/R2為引物擴增pHY300PLK獲得載體片段(5856bp)和基因片段Tftfa(1812bp)。PCR體系如下：2×Phanta Max Master Mix 25 μL，上下游引物各2 μL，模板1 μL，ddH2O補足至50 μL。PCR參數(shù)：94 ℃ 預變性 4 min；進入PCR循環(huán)：98 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸6 min或2 min，30個循環(huán)；最后72 ℃ 10 min，4 ℃保溫[26]。瓊脂糖凝膠電泳后切割目的條帶進行膠回收，獲得純片段。

1.2.3 目的基因的連接及轉(zhuǎn)化

按照瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒回收PCR產(chǎn)物，并一步克隆試劑盒將基因和載體片段進行連接。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliJM109，涂布Amp抗性LB固體培養(yǎng)基并于37 ℃培養(yǎng)10 h，挑取單菌落至Amp抗性LB液體培養(yǎng)基于37 ℃ 培養(yǎng)8～10 h后，收集菌體抽提質(zhì)粒進行雙酶切，并送測序公司測序。測序正確的質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化表達宿主B.subtilisWS11，涂布四環(huán)素抗性LB固體培養(yǎng)基，于37 ℃培養(yǎng)12 h，挑取單菌落至四環(huán)素抗性LB液體培養(yǎng)基于37 ℃培養(yǎng)8～10 h后保存甘油菌B.subtilisWS11/pHY300PLK-Tftfa。

1.2.4 重組菌的搖瓶發(fā)酵及SDS-PAGE分析

取20 μL甘油管菌B.subtilisWS11/pHY300PLK-Tftfa接種至10 mL LB液體培養(yǎng)基(含10 μg/mL四環(huán)素)中，放置于37℃，200 r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)8～10 h，取2.5 mL菌液轉(zhuǎn)接至50 mL TB液體培養(yǎng)基(含20 μg/mL四環(huán)素)中，先放置于37 ℃，200 r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)2 h，然后將搖瓶轉(zhuǎn)移至33 ℃，200 r/min的恒溫搖床中培養(yǎng)48 h。發(fā)酵結(jié)束后，以8 000 r/min離心20 min收集上清液，即為粗酶液。取粗酶液進行SDS-PAGE分析。取甘油管菌B.subtilisWS11不添加四環(huán)素按上述方法進行搖瓶發(fā)酵，最終收集發(fā)酵上清液進行SDS-PAGE分析，條帶作為陰性對照。

1.2.5 重組酶TfAmyA的純化及蛋白濃度測定

由于蛋白末端已帶上His-Tag，故用鎳柱HisTrapTMHP 5 mL純化TfAmyA。結(jié)合緩沖液(A液)成分為：25 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L NaCl，pH 7.4，洗脫緩沖液(B液)成分含300 mmol/L咪唑的A液。用5%的B液洗去雜蛋白后，直接用100% B液洗脫，得到純化的TfAmyA，經(jīng)SDS-PAGE驗證后，得到電泳純的單一條帶。本實驗采用Bradford法測定蛋白濃度[27]。

1.2.6 重組酶TfAmyA最適溫度及溫度穩(wěn)定性測定

用50 mmol/L pH 5.5的PBS配制1%可溶性淀粉，將酶稀釋至適當倍數(shù)后，在40、45、50、55、60、65、70、75 ℃不同溫度下，按照DNS法[28]測算酶活力。將最高酶活力定義為100%，其余條件下酶活力折算為相對酶活力，繪制不同溫度下相對酶活力折線圖。在55 ℃下，將酶溫育不同時長，取樣進行酶活力測定，將初始酶活力定義為100%，其余時長酶活力折算為相對酶活力，按照時長-相對酶活力繪制折線圖。

1.2.7 重組酶TfAmyA最適pH及pH穩(wěn)定性測定

用pH分別為4.0、4.5、5.0、5.5的50 mmol/L檸檬酸-檸檬酸三鈉緩沖液和pH分別為5.5、6.0、6.5、7.0、7.5的50 mmol/L PBS配制1%可溶性淀粉，將酶稀釋至適當倍數(shù)后，在55 ℃下，按照DNS法[28]測算酶活力。在pH 6.0下，將酶溫育不同時長，取樣進行酶活力測定，將初始酶活定義為100%，其余時長酶活折算為相對酶活，按照時長-相對酶活力繪制折線圖。

1.2.8 重組酶TfAmyA活力測定

用50 mmol/L pH 6.0的PBS配制質(zhì)量濃度1%的可溶性淀粉，將酶稀釋至適當倍數(shù)后，按照DNS法[28]測還原糖的量(以葡萄糖作為標準曲線)，計算出酶活力。酶活力定義為：每分鐘釋放1 μmol還原糖所需的酶量計為1個酶活力單位。

1.2.9 制備麥芽三糖的反應條件優(yōu)化

以15%的麥芽糊精(DE 5-7)為底物，用不同pH(4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5)的50 mmol/L的PBS溶解底物溶解底物，分別以不同麥芽三糖淀粉酶加酶量(0、15、30、45、60、75 U/g底物)添加至底物中，普魯蘭酶以不同加酶量(0、4、8、12、16、20、24、28、32、36、40 U/g底物)添加至反應體系中置于轉(zhuǎn)速為150 r/min、不同溫度(40、45、50、55、60 ℃)的水浴搖床中，轉(zhuǎn)化不同時間。用HPLC檢測麥芽三糖生成量，每次控制單一變量，逐步優(yōu)化。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組菌B. subtilis WS11/pHY300PLK-Tftfa的構(gòu)建

提取連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化E.coliJM109的質(zhì)粒進行雙酶切，隨后進行瓊脂糖凝膠電泳，發(fā)現(xiàn)除了未被切完的重組質(zhì)粒外(7 638 bp)，還有2條明顯的分別對應載體和基因的5 190和2 448 bp(圖1)，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入表達宿主B.subtilisWS11，構(gòu)建重組菌B.subtilisWS11/pHY300PLK-Tftfa。

M-DL10000 DNA Marker；1-重組質(zhì)粒酶切條帶

2.2 TfAmyA的表達、純化及酶學性質(zhì)分析

2.2.1 TfAmyA的表達

B.subtilisWS11及重組菌B.subtilisWS11/pHY300PLK-Tftfa經(jīng)TB發(fā)酵48 h后，胞外上清SDS-PAGE結(jié)果見圖2。泳道2為陰性對照，泳道1的63.2 kDa處出現(xiàn)1條蛋白條帶，與TfAmyA理論相對分子質(zhì)量吻合，測得胞外粗酶液的酶活為56.81 U/mL，說明TfAmyA在B.subtilisWS11中成功表達。

M-中分子量蛋白Marker；1-重組菌胞外上清液；2- B. subtilis WS11胞外上清液

2.2.2 TfAmyA的純化

采用鎳離子螯合層析的方法，得到純化的TfAmyA，經(jīng)SDS-PAGE驗證后，得到電泳純的單一條帶(圖3)。

M-中分子量蛋白Marker；1-純化TfAmyA

純化過程參數(shù)見表2，純化倍數(shù)達到19.8倍，純酶的比活為412.2 U/mg。同一來源的TfAmyA在不同宿主里的比活力有差異，本研究在B.subtilisWS11中表達獲得的TfAmyA均高于文獻報道的以大腸桿菌、畢赤酵母及耶氏解脂酵母為宿主菌的TfAmyA比活力(表1)。

表2 重組TfAmyA純化過程參數(shù)

注：粗酶液的純化倍數(shù)與回收率分別按照1和100%表示

2.2.3 TfAmyA的酶學性質(zhì)分析

2.2.3.1 TfAmyA的最適溫度及溫度穩(wěn)定性

溫度影響酶的三維結(jié)構(gòu)、分子熱運動[29-31]，進而能影響酶促反應的催化速率。從圖4可以看出，TfAmyA的最適溫度為55 ℃。在40～55 ℃之間，酶活力有40%以上，且隨溫度提高而提高；在55～65 ℃之間，TfAmyA能維持90%以上的酶活力，在溫度>65 ℃時，酶活力迅速降低。這說明，溫度對酶活的影響很大。此外，由圖5可以看出，在55 ℃溫育時，TfAmyA在初始時酶活力最高，隨后基本呈現(xiàn)降低趨勢。到達195 h，酶活力才降至50%以下，穩(wěn)定性相比于報道的S.fibuligera[14]、B.subtilisG3[6]、Brachybacteriumsp. Strain LB25[32]、S.griseusNBRC13350[33]、S.avermitilisNBRC14893[33]、Kitasatosporasp. MK-1785[34]以及M.imperiale[7]麥芽三糖淀粉酶要好。

圖4 重組TfAmyA的最適酶活力溫度

2.2.3.2 TfAmyA的最適pH及pH穩(wěn)定性

pH影響酶的解離狀態(tài)，能影響酶促反應的催化速率[35]。從圖6可以看出，TfAmyA的最適pH為6.0，與來自Kitasatosporasp. MK-1785[34]、M.thermotoleransDAU221[19]的麥芽三糖淀粉酶一致。當pH在5.5～6.5之間，能保持80%以上的酶活力，超出該范圍，酶活力迅速降低。在pH 6.0下測量酶的pH穩(wěn)定性。由圖7可以看出，酶在初始時酶活最高，隨后持續(xù)降低，超過150 h，酶活力才衰減至50%以下，說明在pH 6.0下該酶穩(wěn)定性很好。

圖5 重組TfAmyA的溫度穩(wěn)定性

圖6 重組TfAmyA的最適pH

圖7 重組TfAmyA的pH穩(wěn)定性

2.3 重組麥芽三糖淀粉酶制備麥芽三糖工藝優(yōu)化

2.3.1 麥芽三糖淀粉酶加酶量對麥芽三糖轉(zhuǎn)化率的影響

TfAmyA是一種內(nèi)切型α-淀粉酶，其作用于麥芽糊精(DE 5-7)能產(chǎn)生以麥芽三糖為主的低聚混合物[20-22]。在加酶量過少時，底物需要長時間反應。增大加酶量，當其達到一定值后，酶轉(zhuǎn)化速率達到飽和，甚至還會水解麥芽三糖[14]，降低轉(zhuǎn)化率。從圖8可以看出，當加酶量為60 U/g底物時，轉(zhuǎn)化率達到最大,為38.8%。繼續(xù)增大加酶量，則會降低轉(zhuǎn)化率，與S.fibuligera[14]、S.griseus[36]來源的麥芽三糖淀粉酶相似，TfAmyA會微弱水解麥芽三糖。

圖8 催化制備麥芽三糖的TfAmyA加酶量優(yōu)化

2.3.2 普魯蘭酶加酶量對麥芽三糖轉(zhuǎn)化率的影響

淀粉或糊精分子的α-(1→6)糖苷鍵會影響麥芽三糖淀粉酶對其水解作用。因此添加普魯蘭酶，使其與麥芽三糖淀粉酶協(xié)同作用，具有提高轉(zhuǎn)化率的實際意義[16, 25, 37]。從圖9中可以發(fā)現(xiàn)，當加酶量逐步增大時，轉(zhuǎn)化率也逐漸增大，但超過32 U/g底物時，轉(zhuǎn)化率不再增大。因此，最優(yōu)加酶量為32 U/g底物，此時轉(zhuǎn)化率為41.1%。

圖9 催化制備麥芽三糖的普魯蘭酶加酶量優(yōu)化

2.3.3 溫度對麥芽三糖轉(zhuǎn)化率的影響

溫度不僅影響底物的物理狀態(tài)，還會影響酶活力和半衰期。在上述最優(yōu)條件基礎(chǔ)上，對反應溫度進行優(yōu)化。從圖10可知，溫度對TfAmyA的催化作用影響較大，酶的最適溫度也是酶轉(zhuǎn)化最優(yōu)溫度。低于55 ℃時，酶催化轉(zhuǎn)化率隨著溫度提高而提高，55 ℃達到最大，為41.1%。當反應溫度繼續(xù)增大時，酶的穩(wěn)定性降低，轉(zhuǎn)化率下降。

2.3.4 pH對麥芽三糖轉(zhuǎn)化率的影響

pH影響酶的電解狀態(tài)，進而會影響酶活力及穩(wěn)定性，從而會影響到酶轉(zhuǎn)化的效果[34-35, 38]，因此實驗探究了不同初始pH對轉(zhuǎn)化率的影響。圖11中值得關(guān)注的是，與酶活力最高的pH不同，酶轉(zhuǎn)化的最適pH是5.5。在初始反應pH<5.5時，轉(zhuǎn)化率隨pH提高而提高，在pH 5.5時達到最大，此時轉(zhuǎn)化率為42.3%，當pH繼續(xù)提高時，轉(zhuǎn)化率會逐漸下降。因此，后續(xù)反應采用pH 5.5的條件。

圖10 催化制備麥芽三糖的溫度優(yōu)化

圖11 催化制備麥芽三糖的初始pH優(yōu)化

2.3.5 反應時間對麥芽三糖轉(zhuǎn)化率的影響

反應時間增長時會導致酶活力略微下降，同時TfAmyA也會繼續(xù)水解麥芽三糖，從而降低轉(zhuǎn)化率[14, 36]。從圖12可知，在反應時間達到11 h之前，轉(zhuǎn)化率隨反應時間增長而增大，11～14 h之間，轉(zhuǎn)化率基本不變。綜合考慮，選擇11 h作為最優(yōu)酶轉(zhuǎn)化時長，此時轉(zhuǎn)化率為44.4%。

圖12 催化制備麥芽三糖的反應時間優(yōu)化

從表1可看出，相比于BbAmyA的轉(zhuǎn)化率49.24%與MiAmyA的轉(zhuǎn)化率47.6%，TfAmyA的轉(zhuǎn)化率要偏低，但是BbAmyA最適溫度低且溫度穩(wěn)定性差，底物濃度也偏低，而MiAmyA相關(guān)信息被商業(yè)壟斷，這2種酶顯然不適于現(xiàn)在的淀粉糖工業(yè)。目前報道的部分其他來源的AmyA的轉(zhuǎn)化率、比活力都不如TfAmyA， 55 ℃下穩(wěn)定的TfAmyA將更適于工業(yè)應用。

3 結(jié)語

目前制備麥芽三糖的方法主要分為2種，一種是利用普魯蘭酶水解普魯蘭多糖獲得，以此法得到的麥芽三糖雖然純度高，但限于普魯蘭多糖的生產(chǎn)成本，不適合用于食品原料的制備；另一種是通過AmyA水解淀粉原料而獲得[2]。

本研究首次將ThermobifidafuscaNTU22來源的麥芽三糖淀粉酶在BacillussubtilisWS11中進行了重組表達。重組菌在TB培養(yǎng)基中發(fā)酵48 h，胞外酶活達到56.81 U/mL。純化后，比活達到412.2 U/mg，比目前所知的其他來源AmyA及同源異種表達TfAmyA的比活力都要高。在此基礎(chǔ)上探究了制備麥芽三糖的工藝。利用TfAmyA對麥芽糊精(DE 5-7)進行酶轉(zhuǎn)化實驗。結(jié)果表明，當麥芽糊精的質(zhì)量濃度為15%，溫度為55 ℃，pH 5.5，TfAmyA加酶量為60 U/g底物，普魯蘭酶加酶量為32 U/g底物，反應11 h時，轉(zhuǎn)化率最高達到44.4%。TfAmyA在一定程度上避免了麥芽三糖淀粉酶的熱不穩(wěn)定及商業(yè)壟斷性，后續(xù)實驗可以從培養(yǎng)基的發(fā)酵優(yōu)化、不同類型或不同質(zhì)量濃度淀粉底物、分子改造提高酶催化產(chǎn)物專一性等方面優(yōu)化麥芽三糖淀粉酶制備麥芽三糖的工藝，為其在食品行業(yè)的應用提供借鑒意義。