大孔樹脂提取側(cè)孢短芽孢桿菌抗菌肽brevilaterin

寧亞維，張明星，蘇丹，付浴男，侯琳琳，王志新，賈英民

1(河北科技大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊，050018) 2(北京工商大學(xué) 食品與健康學(xué)院，北京，100048)

隨著人們對食品安全的重視，防腐劑的安全性越來越受到人們關(guān)注。生物防腐劑為來源于動物、植物、微生物等生物的一類防腐劑，因具有較化學(xué)防腐劑更高的安全性而受到人們青睞。其中，微生物源防腐劑因生產(chǎn)周期短、發(fā)酵成本低等原因成為目前生物防腐劑開發(fā)的重點。微生物抗菌肽是由微生物如乳酸菌、芽孢桿菌、鏈霉菌等代謝產(chǎn)生的一種具有抑菌活性的小分子肽[1]，目前已經(jīng)商品化生產(chǎn)且得以廣泛應(yīng)用的抗菌肽為乳酸鏈球菌素。然而乳酸鏈球菌素在使用中存在一定的局限性，如僅對革蘭氏陽性細菌抑制效果好，對革蘭氏陰性菌卻難以抑制。因此有必要尋求廣譜、高效抑菌的抗菌肽以減少防腐劑的使用種類。本實驗室前期從土壤中篩選到1株能夠高產(chǎn)抗菌肽brevilaterin的側(cè)孢短芽孢桿菌(Brevibacilluslaterosporus)S62-9[2]，前期研究發(fā)現(xiàn)brevilaterin具有抑菌譜廣、抑菌活性高、酸熱穩(wěn)定性好等優(yōu)點，在食品防腐中具有較高的應(yīng)用潛力[3]。但brevilaterin存在于成分復(fù)雜的微生物發(fā)酵液中，需要提取純化才能進一步開發(fā)應(yīng)用。因此，本研究擬開發(fā)brevilaterin綠色高效提取技術(shù)，以期為brevilaterin的工業(yè)化生產(chǎn)提供技術(shù)支持。

近年來，大孔樹脂吸附技術(shù)因產(chǎn)物提取效率高、溶劑損耗小、樹脂再生處理方便等優(yōu)點被廣泛用于天然產(chǎn)物的提取，如從蜂蜜中提取黃酮、甜葉菊中提取糖類、霉菌中提取生物堿等[4-7]。本研究采用大孔樹脂提取側(cè)孢短芽孢桿菌發(fā)酵液中的抗菌肽brevilaterin，首先以樹脂對brevilaterin的吸附解吸附能力為評價指標(biāo)，從8種大孔樹脂中篩選了一種吸附效率好、解吸附率高、回收效果好的樹脂，然后優(yōu)化了其吸附-解吸附的工藝條件，最后進行了吸附機理的探究。本研究為發(fā)酵液中抗菌肽的提取提供了技術(shù)支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BrevibacilluslaterosporusS62-9和StaphylococcusaureusATCC 25923為河北科技大學(xué)食品生物技術(shù)與安全實驗室保藏[8]；HPD722、HPD600、HPD5000樹脂，分析純，北京索萊寶有限公司；NKA-Ⅱ、AB-8、D4020、XAD7HP、XAD1180樹脂，分析純，杭州全豐有限公司。樹脂相關(guān)參數(shù)如表1所示。

表1 大孔吸附樹脂性質(zhì)

1.2 儀器與設(shè)備

UV2300Ⅱ紫外分光光度計，上海天美科學(xué)儀器有限公司；3-18K高速冷凍離心機，德國Sigma公司；BIOTECH-5BG-7000 5 L發(fā)酵罐，上海保興生物設(shè)備工程有限公司；Scan1700全自動菌落計數(shù)儀，法國Interscience公司。

1.3 方法

1.3.1 種子菌懸液及發(fā)酵液制備

將B.laterosporus從甘油管中接入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，于32 ℃，240 r/min的轉(zhuǎn)速培養(yǎng)24 h，然后按照體積分?jǐn)?shù)3%的接種量接入營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基制備B.laterosporus種子液。將種子菌懸液按接種量體積分?jǐn)?shù)5%接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中(液糖6%，魚蛋白胨1.2%，無水CaCl21.38 g/L，ZnCl28.16 mg/L，Tween-20 0.2%，pH 7.0)，于轉(zhuǎn)速300 r/min、溫度32 ℃條件下在5 L發(fā)酵罐中發(fā)酵24 h。發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液高壓滅菌20 min，然后冷凍離心去除菌體，收集上清液置于4 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 抗菌肽brevilaterin抑菌活性的測定

將滅菌后冷卻至50 ℃左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基倒入添加有S.aureus菌懸液(體積分?jǐn)?shù)3%)的平皿中，搖勻并靜置凝固后，將牛津杯置于營養(yǎng)瓊脂表面，加入50 μL待測抗菌肽brevilaterin樣品，于4 ℃冰箱中預(yù)擴散10 h，然后放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12 h，用全自動菌落計數(shù)儀測量待測樣品的抑菌圈直徑。

采用二倍稀釋法測定brevilaterin的抑菌效價，參考HéCHARD等[9]的實驗方法進行適當(dāng)修改。將樣品用生理鹽水進行二倍稀釋，然后用牛津杯法測定抑菌圈大小，將第1個不出現(xiàn)肉眼可見抑菌圈的稀釋液的效價定義為1 AU/mL。根據(jù)效價計算公式(1)可以得到樣品對S.aureus的抑菌效價:

效價/(AU·mL-1)=2n×(1 000 μL÷50 μL)

(1)

式中：n，第1個不出現(xiàn)肉眼可見抑菌圈的稀釋液二倍稀釋的次數(shù)。

1.3.3 大孔樹脂篩選與工藝條件優(yōu)化

大孔樹脂均采用無水乙醇浸泡24 h后，用去離子水洗至無乙醇味，除去多余水分備用。向盛有30 mL同一批次brevilaterin發(fā)酵液的250 mL錐形瓶中加入不同種類的大孔樹脂0.9 g，分別于37 ℃條件下200 r/min振蕩90 min。然后將上述吸附有抗菌肽的大孔樹脂加入250 mL錐形瓶中，加入50∶1(乙醇體積∶樹脂質(zhì)量)的乙醇溶液(體積分?jǐn)?shù)分別為70%、75%、80%、85%、90%、95%)，在37 ℃下200 r/min振蕩24 h進行抗菌肽解吸附。然后抽濾收集濾液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除乙醇得到brevilaterin濃縮液。測定brevilaterin濃縮液效價，并根據(jù)公式(2)和公式(3)計算吸附量與吸附率，篩選吸附效率高的大孔樹脂用于后續(xù)研究。

以篩選的高吸附率大孔樹脂為吸附劑，研究吸附時間(10～180 min)、吸附溫度(20～40 ℃)、大孔樹脂添加量(10～50 g/L)和發(fā)酵液pH值(4～8)對抗菌肽吸附率的影響；基于上述優(yōu)化條件，考察乙醇濃度(70%～95%)、乙醇體積/樹脂質(zhì)量(10∶1、20∶1、30∶1、50∶1、70∶1)、解吸附溫度(20～40 ℃)與時間(20～120 min)對解吸附率的影響，最終綜合吸附量、吸附率和回收率3個指標(biāo)選取最佳提取條件。

根據(jù)以下公式計算吸附量Qt、吸附率A、解吸附率D與回收率R。

(2)

(3)

(4)

(5)

式中：C0,brevilaterin發(fā)酵液初始效價,AU/mL；Ce,吸附平衡后上清液的效價,AU/mL；Vi,加入brevilaterin發(fā)酵液的體積,mL；m,加入大孔樹脂的干重,g；Cd,樹脂解吸附后旋蒸液的效價,AU/mL；Vd,大孔樹脂解吸附后旋蒸液的體積,mL。

1.3.4 吸附等溫線與吸附熱力學(xué)

在25、30、35 ℃溫度下，分別用大孔樹脂XAD-7HP(30 g/L)吸附效價為4 200、4 000、3 600、3 300、3 000 AU/mL的brevilaterin溶液，200 r/min振蕩吸附3 h，收集上清液并測定效價，計算吸附量Qe和平衡濃度。以吸附量Qe對抗菌肽吸附平衡濃度作圖，得到等溫吸附曲線，采用Langmuir模型與Freundlich模型擬合。吸附等溫線與熱力學(xué)方程如公式(6)～(11)所示：

(6)

(7)

(8)

(9)

ΔG=-nRT

(10)

(11)

式中：Qe,單位質(zhì)量吸附劑對吸附物的吸附量,AU/g；Qmax,單位質(zhì)量吸附劑對吸附物的最大吸附量,AU/g；RL,無量綱因子；KL,Langmuir方程的吸附常數(shù)(mL/AU，與結(jié)合位點、親和力有關(guān))；Ce,吸附后上清中被吸附物的濃度,AU/mL；C0,初始吸附物濃度,AU/mL；KF、1/n,Freundlich方程的吸附常數(shù)；K，Langmuir方程的吸附平衡常數(shù)，KL；R與T分別為理想氣體常數(shù)，8.314 J/(mol·K)和絕對溫度(K)；A、ΔH、ΔS與ΔG分別為常數(shù)、焓變(kJ/mol)、吉布斯自由能(kJ/mol)與熵變(J/mol·k)。

1.3.5 吸附動力學(xué)

在35 ℃下，采用大孔樹脂XAD-7HP(30 g/L)吸附效價分別為2 200、2 400、2 600、2 800、3 000 AU/mL的brevilaterin溶液，吸附不同時間(2、4、6、8、10、15、20、25、30、40、50、60、90、120、180 min)后，收集上清液測定效價。對擬一級動力學(xué)方程、擬二級動力學(xué)方程、Elovich方程和粒子擴散方程進行非線性擬合[10-11]。

吸附動力學(xué)方程如公式(12)～(15)所示：

ln(Qe-Qt)=lnQe-K1t

(12)

(13)

(14)

(15)

式中：Qt,t時刻吸附劑對吸附物的吸附量,AU/g；K1,吸附速率常數(shù),min-1；K2,吸附速率常數(shù),min-1；a,初始吸附速率[AU/(g·min)]；b,解吸常數(shù),g/AU；C,截距,AU/g；Kt,顆粒內(nèi)擴散速率常數(shù),[AU/(g·min0.5)]。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂的篩選

大孔樹脂的結(jié)構(gòu)與特性(如孔徑、表面積)是決定樹脂吸附能力的關(guān)鍵因素[12-13]，因此選取8種不同樹脂考察對抗菌肽brevilaterin的吸附解吸附能力，結(jié)果如圖1所示。

A-大孔樹脂種類對brevilaterin吸附率的影響；B-乙醇濃度對大孔樹脂提取brevilaterin解吸附率的影響；C-解吸附時間對大孔樹脂提取brevilaterin回收率的影響

從圖1-A中可知，樹脂D4020的吸附率最高，達到了95.64%；其次是HPD722、XAD-7HP和XAD1180分別是94.43%、94.09%和92.81%；其中吸附率最低的是樹脂NKA-Ⅱ為31.79%。由表1可知，NKA-Ⅱ與HPD600均為極性樹脂，然而兩者吸附能力差異極顯著，表明brevilaterin吸附率與大孔樹脂極性不相關(guān)，推測可能與樹脂比表面積有關(guān)[14]。

不同樹脂對抗菌肽brevilaterin的解吸附能力不同，會影響brevilaterin的回收率，因此進一步通過解吸附率篩選對抗菌肽提取率高的大孔樹脂(圖1-B)。結(jié)果顯示乙醇濃度對解吸附率影響較大，乙醇濃度增大反而不利于brevilaterin的解吸附；樹脂類型可影響解吸附率，其中D4020樹脂解吸附率較低，推測brevilaterin與該種樹脂結(jié)合較強，因此brevilaterin難以解吸附下來[15]。根據(jù)回收率選取了在70%乙醇濃度下回收率較高的4種樹脂HPD722、XAD-7HP、HPD5000和XAD1180進行解吸附時間比較。由圖1-C可以看出樹脂XAD1180的回收率低于其他樹脂，而樹脂XAD-7HP(2 h)與HPD5000(2 h)達到了80%以上，再根據(jù)樹脂的吸附能力，最終選擇XAD-7HP大孔樹脂進行brevilaterin的提取。

2.2 大孔樹脂提取brevilaterin的工藝條件優(yōu)化

2.2.1 大孔樹脂吸附brevilaterin的工藝條件優(yōu)化

首先考察了大孔樹脂XAD-7HP吸附時間對brevilaterin吸附率的影響(圖2-A)，結(jié)果表明初始10 min吸附較快，吸附率達到40.5%；隨著吸附量的增加，吸附速率減緩，在90 min時吸附率達到94%，之后繼續(xù)延長吸附時間吸附率增加不顯著，因此選擇樹脂吸附時間為90 min。其次，考察了吸附溫度對brevilaterin吸附率的影響(圖2-B)，發(fā)現(xiàn)溫度對吸附率影響顯著，升高溫度有利于brevilaterin的提取。吸附溫度增加到35 ℃時，吸附率達到95%，之后增加溫度對吸附率提高不顯著。綜合考慮提取效率與能耗，選取35 ℃進行后續(xù)研究。然后，考察了大孔樹脂添加量對brevilaterin吸附率的影響(圖2-C)，結(jié)果顯示大孔樹脂的最佳添加量為30 g/L，此時brevilaterin的吸附率達到了94.4%，吸附量為43 394 AU/g。最后，研究了發(fā)酵液pH對brevilaterin吸附率的影響(圖2-D)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)發(fā)酵液pH值對brevilaterin吸附率無影響，無需調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值即可提取brevilaterin。

A-吸附時間對吸附率的影響；B-吸附溫度對吸附率的影響；C-樹脂添加量對吸附率及吸附量的影響；D-發(fā)酵液pH值對吸附率的影響

2.2.2 大孔樹脂解吸附brevilaterin的工藝條件優(yōu)化

在上述大孔樹脂篩選得到的解吸附工藝條件基礎(chǔ)上，進而考察了解吸附溫度(圖3-A)與乙醇用量(圖3-B)對brevilaterin解吸附率的影響，研究發(fā)現(xiàn)解吸附效率隨溫度升高先升高后降低，在25與30 ℃時效率最好，選擇室溫25 ℃進行brevilaterin解吸附。此外，研究了乙醇用量對brevilaterin解吸附效率的影響，發(fā)現(xiàn)乙醇用量對解吸附效率有顯著影響，當(dāng)乙醇與大孔樹脂液料比為50∶1(mL∶g)時，解吸附效率最好，因此選取乙醇大孔樹脂液料比為50∶1。

A-解吸附溫度對brevilaterin解吸附率的影響；B-乙醇與大孔樹脂比例對brevilaterin解吸附率的影響

2.3 大孔樹脂吸附brevilaterin機理研究

2.3.1 吸附等溫線與吸附熱力學(xué)

采用Langmuir與Freundlich模型對樹脂XAD-7HP吸附brevilaterin的實驗數(shù)據(jù)進行擬合，結(jié)果如圖4所示。從表2可以看出Langmuir與Freundlich模型擬合的R2都大于0.90，表明大孔樹脂XAD-7HP對brevilaterin的吸附符合單分子層模型[16]。其次，由Langmuir參數(shù)可求出表示吸附劑與被吸附物質(zhì)之間親和性的無量綱因子RL：當(dāng)01時不利于吸附；當(dāng)RL=1時是線性吸附；當(dāng)RL=0時是不可逆吸附[17-19]。由圖3-C可知，RL值小于0.05，且隨著C0的增加逐漸趨近于0，表明brevilaterin有利于大孔樹脂吸附[20]。此外，實驗數(shù)據(jù)與Freundlich方程的擬合度也較好(R2>0.92)，方程中1/n表示吸附能力：1/n在0.1～0.5范圍時吸附容易發(fā)生，1/n>1時表示吸附發(fā)生困難[21]。Freundlich方程的1/n在0.1～0.5之間，說明XAD-7HP對brevilaterin的吸附易發(fā)生。

熱力學(xué)參數(shù)可以提供吸附過程中能量變化信息[22]，根據(jù)公式(9～11)計算不同溫度下的ΔH、ΔG與ΔS(表2)，結(jié)果顯示ΔH>0，說明樹脂XAD-7HP吸附brevilaterin的過程為吸熱過程，與吸附工藝條件優(yōu)化結(jié)果提高溫度可以增加吸附率結(jié)果一致。不同溫度下ΔG<0，說明吸附過程是自發(fā)的。ΔH

A-Langmuir等溫線模型擬合結(jié)果；B-Freundlich等溫線擬合結(jié)果；C-無量綱因子RL隨抗菌肽初始濃度變化的曲線

表2 大孔樹脂XAD-7HP吸附brevilaterin的熱力學(xué)參數(shù)

2.3.2 吸附動力學(xué)

吸附動力學(xué)研究主要涉及底物在大孔吸附樹脂表面吸附過程中的擴散行為模式，研究分別采用擬一級動力學(xué)、擬二級動力學(xué)、Elovich方程與粒子擴散模型對大孔樹脂XAD-7HP吸附brevilaterin的實驗數(shù)據(jù)進行擬合(圖5)，相關(guān)動力學(xué)參數(shù)如表3所示。由時間吸附曲線(圖5-A)可以看出吸附分3個階段，即0～30 min快速吸附、30～60 min緩慢吸附、60 min后吸附逐漸達到平衡，因此樹脂XAD-7HP吸附brevilaterin屬于快速吸附[23]。擬一級動力學(xué)通常適用于吸附過程的初始階段，擬二級動力學(xué)模型假設(shè)限速步驟為化學(xué)吸附，并可以預(yù)測整個吸附過程的行為[24]。依據(jù)表3數(shù)據(jù)可知(以抗菌肽2 200 AU/mL為準(zhǔn))，擬二級動力學(xué)R2(0.997)優(yōu)于擬一級動力學(xué)R2(0.946)，且擬二級動力學(xué)模型Qe計算值為75 208 AU/g與Qe實驗值73 157 AU/g接近，表明XAD-7HP吸附brevilaterin符合擬二級動力學(xué)[25]，主要吸附機制為化學(xué)吸附。上述大孔樹脂XAD-7HP對brevilaterin的吸附機制與樹脂D301對重金屬粒子以及XAD-16樹脂對黃酮類化合物的吸附機理相似，吸附過程均符合擬二級動力學(xué)模型，以化學(xué)吸附為主[22,26]。

Elovich方程描述了非均質(zhì)表面的化學(xué)吸附，通常用于證實化學(xué)吸附機理[27]。Elovich方程的相關(guān)參數(shù)如表3所示，該方程的R2為0.92，再次表明化學(xué)吸附是主要的吸附機制。粒子擴散方程雖然不能代表整個吸附過程，但可以用來給出一個明確的吸附機制[24]。粒子擴散方程評估膜擴散或內(nèi)部擴散對擴散過程的控制。根據(jù)文獻，如果粒子擴散方程圖為直線且經(jīng)過零點，則說明粒子內(nèi)擴散是控制吸附的重要因素，若方程曲線未經(jīng)過零點，則說明邊界擴散與粒子內(nèi)擴散是主要的控速步驟[28]。如圖5-E所示，擬合為弱線性，因此整個過程分為3個階段，這表明樹脂XAD-7HP吸附抗菌肽可能包含多個過程：第1階段(0～30 min)屬于邊界層擴散，第2階段(30～60 min)描述了吸附過程中顆粒內(nèi)擴散速率加快的過程，第3階段(>60 min)屬于最終平衡階段。擬合直線沒有經(jīng)過原點(R2=0.90)，說明邊界層擴散與顆粒內(nèi)擴散是主要的控速步驟[29]。

3 結(jié)論

通過吸附-解吸附實驗從8種大孔樹脂中篩選了可高效提取brevilaterin的大孔樹脂XAD-7HP，經(jīng)過pH、溫度、乙醇濃度等關(guān)鍵工藝條件優(yōu)化，brevilaterin的回收率達到82%。吸附等溫線方程顯示樹脂XAD-7HP吸附brevilaterin與Langmuir和Freundlich模型擬合較好，吸附動力學(xué)研究顯示吸附過程符合擬二級動力學(xué)模型，因此推測XAD-7HP對brevilaterin的吸附屬于單分子層的化學(xué)吸附；Elovich方程擬合結(jié)果表明吸附過程主要分為3個階段：邊界層擴散、顆粒內(nèi)擴散、最終平衡?？傊?，大孔樹脂XAD-7HP可以通過單分子層化學(xué)吸附方式提取brevilaterin，該工藝綠色環(huán)保、提取效率高，具有較高的工業(yè)化生產(chǎn)潛力。

表3 大孔樹脂XAD-7HP吸附brevilaterin的動力學(xué)參數(shù)

A-動力學(xué)時間吸附曲線；B-擬一級動力學(xué)擬合結(jié)果；C-擬二級動力學(xué)擬合結(jié)果；D-Elovich方程擬合結(jié)果；E-粒子擴散方程擬合結(jié)果