唾液乳桿菌CCFM 1054通過改變腸道菌群緩解空腸彎曲桿菌在小鼠體內的感染

金星，賀禹豐，周永華，陳曉華，王剛*，趙建新，張灝，陳衛(wèi)

1(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122) 2(國家衛(wèi)生健康委寄生蟲病預防與控制技術重點實驗室，江蘇 無錫，214064)3(衡陽師范學院 生命科學與環(huán)境學院，湖南 衡陽，421008)

在許多國家，彎曲桿菌屬會導致結腸炎的發(fā)生[1]。在美國，受到彎曲桿菌感染而發(fā)病的概率已經達到4.4‰，并且每年已經被統計在案的病例超過130萬例[2]。而在我國，每年的發(fā)病率也達到了1.2‰[3]?？漳c彎曲桿菌(Campylobacterjejuni)屬于彎曲桿菌，會導致某些外周神經性疾病的發(fā)生，比如說格林-巴利綜合征[4]。在雞、鴨等家禽體內，空腸彎曲桿菌被發(fā)現的頻率頗高，而其他農副產品，比如豬肉和牛肉，也會成其宿主。全球零售肉制品及其他農副產品中彎曲桿菌的感染率超過50%，人類食入未煮熟或已經受污染的食物及水源都會引起感染[5]。

迄今為止，尤其是在禽類行業(yè)，對空腸彎曲桿菌的治療還是集中在抗生素方面。伴隨抗生素的濫用，具有抗性的空腸彎曲桿菌呈逐年遞增之態(tài)，嚴重的二次污染以及宿主體內微生態(tài)紊亂等問題也會隨之而來[6-8]。隨著研究的深入，乳酸菌可以在人體腸道內有效定植并在維持腸道功能和宿主健康方面發(fā)揮至關重要的作用已經成為不爭的事實。目前，乳酸菌已被證明可用于預防彎曲桿菌感染。NISHIYAMA等[9]從健康的雞糞便中分離出的格氏乳桿菌LactobacillusgasseriSBT2055可以在雞體內有效降低空腸彎曲桿菌的定植量。另一項研究顯示，受空腸彎曲桿菌感染的火雞在接受唾液乳桿菌LactobacillussalivariusNRRL B-30514治療后，病原菌的侵襲明顯減少，通過對NRRL B-30514的抑菌成分研究發(fā)現，其生長產生的細菌素能有效抑制空腸彎曲桿菌的繁殖。另外，NRRL B-30514在體內對空腸彎曲桿菌形成的競爭性排斥也是其抑制病原菌體內占位定植的機制之一[10]。

筆者研究發(fā)現，唾液乳桿菌(L.salivarius)CCFM 1054體外培養(yǎng)后具有較強的產酸能力，且能抑制空腸彎曲桿菌的生長，在人工模擬胃腸液的情況下具備良好的耐受能力，并且能夠在共培養(yǎng)的條件下對空腸彎曲桿菌生長產生抑制作用。與此同時，CCFM 1054具備了對HT-29細胞的高黏附性及較強的自我成膜能力；干預于空腸彎曲桿菌和弓形蟲復合感染的小鼠，能顯著改變腸道菌群的組成，降低空腸彎曲桿菌在小鼠體內的定植率并緩解其在體內的感染。

1 材料與方法

1.1 菌株、細胞及小鼠

唾液乳桿菌LactobacillussalivariusCCFM 1054、鼠李糖乳桿菌LactobacillusrhamnosusLGG、植物乳桿菌LactobacillusplantarumN49，空腸彎曲桿菌NCTC 11168，人結腸癌細胞株HT-29均來自于江南大學食品學院生物技術中心菌種庫。

實驗小鼠采用C57BL/6品系，SPF級，雌性，3周齡，購于上海斯萊克實驗動物有限公司，于江蘇省血吸蟲病防治研究所動物房中分籠飼養(yǎng)。

1.2 實驗試劑

MRS培養(yǎng)基，青島海博生物技術有限公司；腦心浸液肉湯(BHI)，Oxoid(英國)公司；無菌綿羊血，杭州新銳生物工程有限公司；胎牛血清，HyClone(美國)公司；哥倫比亞血平板培養(yǎng)基，Oxoid(英國)公司；青霉素/鏈霉素溶液以及慶大霉素，上海生物工程有限公司；RPMI-1640培養(yǎng)基，Gibco(美國)公司；糞便樣品基因組提取試劑盒(Fast DNA SPIN Kit for Feces)，美國MP公司；膠純化回收試劑盒(QIAquick Gel Extraction Kit)，德國Qiagen 公司。

人工胃液：pH 2.0、3 g/L胃蛋白酶(Sigma)的PBS(5.0 g/L)，過0.22 μm無菌微孔濾膜。

人工腸液：pH 8.0、1 g/L胰蛋白酶(Sigma)和0.3 g/L牛膽鹽的PBS(5.0 g/L)，過0.22 μm無菌微孔濾膜。

1.3 儀器與設備

第二代高通量測序儀(Mi Seq)，Illumina(美國)公司；生物安全柜，Labconco(美國)公司；小型臺式高速離心機(5415R)，Eppendorf(德國)公司；pH計(starter3100)，Haus(美國)公司；三氣培養(yǎng)箱(BD150L)，Bingd(德國)公司；凝膠成像儀( Universal hood II)，美國伯樂(Bio-Rad)公司；酶標儀，Thermo(美國)公司；隔水式恒溫培養(yǎng)箱(GRP-9160型)，上海森信實驗儀器有限公司；光學顯微鏡(Leica DM2000)，Leica光學儀器(日本)公司；電子天平(ME3002E/02)，上海METTLER TOLEDO儀器有限公司。

1.4 細菌菌懸液及上清液(CFS)的制備

乳酸菌：在液體MRS中按照2%的接種量接種，37 ℃下培養(yǎng)24 h為一代，傳代2次，8 000 r/min，6 min，4 ℃條件下離心，收集發(fā)酵上清液及菌體。用PBS清洗2次菌體，重懸，調整所需濃度備用；采用 0.22 μm無菌微孔濾膜對上清液進行過膜處理，4 ℃冰箱保存。

空腸彎曲桿菌：在液體BHI培養(yǎng)中按照2%的接種量接種，置于三氣(氣體成分為5% O2、10% CO2和85% N2)培養(yǎng)箱，37 ℃隔天培養(yǎng)48 h為一代，傳代2次， 5 000 r/min、10 min、4 ℃條件下離心，用PBS清洗2次菌體，重懸，調整所需濃度備用。

1.5 乳酸菌產酸能力與體外牛津杯抑菌實驗

將pH計探頭插入乳酸菌上清液中，測定其pH。采用牛津杯法[11]測定乳酸菌發(fā)酵上清液對空腸彎曲桿菌的生長抑制效果，實驗進行了3次重復。

1.6 乳酸菌對模擬人工胃腸液的耐受實驗

(1)人工模擬胃液耐受性實驗

人工胃液重懸乳酸菌菌體，使其濃度為109CFU/mL，37 ℃培養(yǎng)2 h，梯度稀釋后涂布培養(yǎng)進行平板菌落計數，實驗進行了3次重復。

(2)人工模擬腸液耐受性實驗

人工腸液重懸乳酸菌菌體，使其濃度為109CFU/mL，37 ℃培養(yǎng)2 h，梯度稀釋后涂布培養(yǎng)進行平板菌落計數，實驗進行了3次重復。

1.7 乳酸菌對與空腸彎曲桿菌共培養(yǎng)生長的測定

以體積分數為5%的牛血清的液體BHI重懸空腸彎曲桿菌菌體，使其濃度為107CFU/mL，加入以體積分數為10%的乳酸菌活細胞(107CFU/mL)，置于三氣培養(yǎng)箱中，37 ℃條件下0、24、48 h后取樣，梯度稀釋并涂布于哥倫比亞血平板中，三氣條件下37 ℃培養(yǎng)48 h后進行菌落計數[12]，實驗進行了3次重復。

1.8 乳酸菌對HT-29細胞的粘附實驗及自身生物膜的形成

(1)粘附實驗

將生長融合至80%的HT-29細胞消化，將蓋玻片放置在6孔培養(yǎng)板中，加入2 mL/孔的細胞完全培養(yǎng)懸液(1×105個/mL)，37 ℃條件下放入5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞貼壁后，棄去培養(yǎng)基，加入1 mL/孔的乳酸菌菌懸液(1×108CFU/mL)，補加基礎細胞培養(yǎng)液至2 mL，隨后孵育2 h。結束后，用PBS清洗以除去未粘附的乳酸菌，甲醇固定20 min后進行革蘭氏染色，顯微鏡觀察。隨機選取20個視野計算每百個細胞所黏附的細菌數目，即為粘附指數，實驗進行了3次重復。

(2)生物膜形成量

根據姚沛琳[13]的實驗方法，測定乳酸菌生物膜的形成量。

1.9 動物實驗

(1)小鼠分組及處理

5～6只小鼠為一組，300 μL/只為小鼠的灌胃劑量。第1天，對小鼠灌胃弓形蟲，弓形蟲灌胃劑： 300 μL 含20個包囊的弓形蟲腦勻漿懸液[14]；第2、3、4天正常飼養(yǎng)；第5、6天對小鼠分別灌胃空腸彎曲桿菌菌懸液和乳酸菌菌懸液，間隔1 h；第7、8、9、10天正常飼養(yǎng)，小鼠表現出空腸彎曲桿菌感染癥狀；第11天小鼠處死。

(2)小鼠糞便中空腸彎曲桿菌活菌數的檢測

取小鼠新鮮糞便，稱重，采用PBS對其進行梯度稀釋，吸取 100 μL菌懸液涂布于哥倫比亞血平板中，置于三氣培養(yǎng)箱37 ℃培養(yǎng)48 h，隨后進行菌落計數。

(3)小鼠糞便菌群豐度檢測

按照WANG[15]的方法進行糞便微生物基因組DNA提取及上機測序。最后采用QIIME分析16S rRNA的序列數據。

1.10 統計與繪圖

采用SPSS對數據進行單因素方差分析、相關性分析，繪圖采用Graphpad Prism 6、TBtools，LEfSe分析在http://huttenhower.sph.harvard.edu/galaxy/完成。所有實驗結果表示為Mean±SD。小寫字母(abcdef)以及“*”表示為(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 CCFM 1054 產酸能力及對空腸彎曲桿菌的體外抑制

本研究在考察唾液乳桿菌L.salivariusCCFM 1054的各項體外指標時，引入已市場化的對人體有益的鼠李糖乳桿菌L.rhamnosusLGG和中心自行篩選的植物乳桿菌L.plantarumN49作為對照菌株。利用發(fā)酵上清液的pH表征乳酸菌的產酸能力，采用抑菌圈實驗檢測了CCFM 1054拮抗空腸彎曲桿菌的能力。實驗結果如表1所示。

表1 各菌株發(fā)酵上清液pH值及牛津杯法對C. jejuni的抑制效果

注：-，沒有抑菌圈；++，抑菌圈為10～12 mm；+++，抑菌圈為12～15 mm

從表1數據可以看出，CCFM 1054的pH值為(3.87±0.03)，表明其產酸能力較強。有文獻顯示，乳酸作為一種乳酸菌代謝生成的物質，能顯著抑制Salmonellatyphimurium的生長[16]。另外，乳酸菌代謝產生有機酸累積所導致的低pH環(huán)境，使得其代謝產物中某些非蛋白類物質及熱穩(wěn)定成分保持較強的活力，兩者協同促進對病原菌的抑制[17]。從抑菌圈直徑的大小來看，CCFM 1054具有明顯的抑菌能力，顯著高于LGG和N49，然而后兩者的產酸能力，卻和CCFM 1054沒有明顯的差異。結果表明，CCFM 1054具有明顯體外拮抗空腸彎曲桿菌的功效，但其發(fā)揮抗菌作用不只局限于其產生的有機酸。

2.2 CCFM 1054 在模擬人工胃腸液中的耐受情況

乳酸菌，能夠在胃腸道中存活，是其在宿主體內發(fā)揮益生功效的前提條件。人體胃液pH值在3.0左右，1～2 h通常為食物在其內的駐留時間，此時，胃蛋白酶原會被激活且具有一定的殺菌作用；當乳酸菌進入到小腸后，腸液中的各種酶和膽汁酸成分，也會對活菌造成損失[18-19]。本實驗采用人工胃液和腸液模擬體內胃腸道環(huán)境，結果如表2所示。

表2 乳酸菌在模擬人工胃腸液中的耐受情況

注：*表示為(P<0.05)

由表2可知，CCFM 1054在pH 2.0的人工胃液中培養(yǎng)2 h后，活菌數達到107CFU/mL，雖下降約2個數量級，但存活率仍較高；在人工腸液中培養(yǎng)后，其活菌數變化不明顯。從結果而言，CCFM 1054對人工胃液及人工腸液的良好耐受性使其具備了在真實人體胃腸道環(huán)境中存活的能力，擁有了對宿主發(fā)揮有益功能的潛質。趙煜等[20]發(fā)現,植物乳桿菌(Lactobacillusplantarum)N9以及ZL5對人工胃液和人工腸液的耐受能力良好，這2株菌在人工胃液中處理2 h以及人工腸液中處理2 h后，活菌存活的數量級和本研究類似。相比之下，LGG和CCFM 1054類似，對模擬人工胃腸液具有較好的耐受性，而N49的耐受效果卻比較差。

2.3 CCFM 1054 與空腸彎曲桿菌共培養(yǎng)生長的測定

為了進一步證實CCFM 1054拮抗空腸彎曲桿菌的能力，進行了其與空腸彎曲桿菌共培養(yǎng)的測定，結果如圖1所示。

圖1 乳酸菌活菌與空腸彎曲桿菌共培養(yǎng)下空腸彎曲桿菌的活菌數

由圖1結果可知，空腸彎曲桿菌的活菌數在CCFM 1054與病原菌的共培養(yǎng)體系中逐步下降。共培養(yǎng)24 h后，空腸彎曲桿菌的活菌數未能超過3.5×107CFU/mL；實驗進行48 h后，空腸彎曲桿菌的活菌數下降到約4.5×106CFU/mL。相比于CCFM 1054，市售的LGG能在48 h時使得空腸彎曲桿菌的活菌數與對照相比下降近1個數量級，而N49，在本實驗中幾乎對空腸彎曲桿菌的活菌數沒有造成影響。

2.4 CCFM 1054對HT-29細胞的粘附及自身生物膜形成的能力

乳酸菌作用于宿主細胞，必須借助其良好的粘附性能。同樣，優(yōu)越的黏附性也為乳酸菌在宿主體內生長、定植和繁殖提供必要動力。乳酸菌黏附腸上皮細胞后，形成腸黏膜屏障，對致病菌而言，形成占位優(yōu)勢并抑制其粘附，從而修復腸道黏膜，調節(jié)免疫應答，抵御病原菌的侵襲[21-22]。HT-29細胞系屬于人體結腸癌細胞，在細菌粘附中是使用最為廣泛的體外模型[23]。本文所采用的對比菌株LGG，在HT-29細胞上擁有較高的黏附能力[24-25]。在某些環(huán)境下，乳酸菌的生長會伴隨著生物膜的形成，具有該特性的乳酸菌有著更為強大的穩(wěn)定特性和抗逆特性[26]，更易于在人體中發(fā)揮有益作用。研究考察了CCFM 1054對HT-29細胞的粘附及自身生物膜形成的能力，如圖2所示。

由圖2可知，CCFM 1054有著比LGG更高的黏附指數，其數值可高達(16.98±1.36)，ADAWI等[27]的研究顯示，L.bulgaricusDSMZ 20080可以有效抑制病原菌粘附、侵襲Caco-2等細胞系，并使得由病原菌脂多糖引起的TNF-α表達大幅度減少。由此可見，CCFM 1054具有良好的黏附特性可能是其在體內競爭性結合腸上皮細胞粘附位點從而抑制病原菌粘附宿主細胞、降低病原菌感染的先決條件。同時，在595 nm處的吸光度代表了菌株自身生物膜的形成量，圖2結果也表明，CCFM 1054具有著較強的自身成膜能力，而LGG和N49卻幾乎不具備生物膜的形成能力。

a-粘附指數;b-生物膜形成能力

2.5 CCFM 1054 在弓形蟲和空腸彎曲桿菌共同感染小鼠模型中對腸道菌群的影響

在普通健康小鼠體內，強大且穩(wěn)定的腸道菌群已經形成，本文所研究的空腸彎曲桿菌NCTC 11168，由于其偏弱的致病性無法在腸道中大量定植并發(fā)揮毒力作用，因此小鼠幾乎不會有患病的臨床表現。因此，弓形蟲感染模型被引入用于破壞健康小鼠的免疫力，從而使得空腸彎曲桿菌可以順利入侵并在小鼠體內大量生長與定植[15]。3株乳酸菌干預灌胃后小鼠腸道菌群在門水平上的變化如圖3所示。

從圖3可知，當小鼠受到弓形蟲和空腸彎曲桿菌共同感染后，厚壁菌門與擬桿菌門的比例出現下降，另外，包含著多種病原菌(例如侵襲性大腸桿菌、沙門氏菌和志賀氏菌)的變形菌門，它的豐度也得到了提高，這和WANG[15]所得到的結果是一致的。

當CCFM 1054干預后，厚壁菌門與擬桿菌門的比例得到了升高，變形菌門的豐度得到了降低。這意味著從門水平上來說，CCFM 1054的干預使得菌群在一定程度上得到了恢復。與此同時，3株乳酸菌干預灌胃后小鼠腸道菌群在種屬水平上的變化也同樣被分析，結果如圖4所示。

圖3 乳酸菌干預后小鼠腸道菌群在門水平上的變化

在屬水平上，針對表現出差異的部分種屬制作了熱圖，且對具有顯著差異的彎曲桿菌屬、乳桿菌屬、片球菌屬、糞球菌屬、分節(jié)絲狀桿菌以及未命名的腸桿菌屬進行了單獨分析。由圖4可知，CCFM 1054的干預使得彎曲桿菌屬的豐度顯著下降，而乳桿菌屬的豐度得到了顯著提高(P<0.05)，這意味著CCFM 1054有可能通過改變腸道某些特定菌群的豐度來緩解空腸彎曲桿菌在體內的感染。據報道，乳桿菌和雙歧桿菌，它們在腸道受到致病菌例如空腸彎曲桿菌感染后，通過外界的補充使其豐度升高，可修復腸道復雜的生態(tài)系統并提供特定的抗炎特性來修復腸道損傷[29-30]。PHILLIP等[31]也報道了利用乳桿菌和雙歧桿菌治療空腸彎曲桿菌感染免疫缺陷性小鼠的例子，隨著彎曲桿菌屬的減少，乳桿菌屬和雙歧桿菌屬的豐度也達到了增強，菌群的變化使得小鼠的免疫系統得到了提高。此外，片球菌屬、糞球菌屬和分節(jié)絲狀桿菌屬在小鼠腸道中的豐度在受到CCFM 1054干預后，也得到了明顯的提高(P<0.05)。片球菌屬和糞球菌屬在宿主腸道中豐度的提高，會引導機體調節(jié)B細胞的反應和IgA的產生[32]。分節(jié)絲狀桿菌與宿主免疫有著密切的聯系，可以促進腸道Th17細胞的分化和成熟，分節(jié)絲狀桿菌屬豐度的提高有助于機體免疫力的增強，且對腸道環(huán)境的穩(wěn)定性有著巨大的貢獻[33]。據報道，感染某些病原體會增加腸道中腸桿菌科的水平[34-35]。本文中感染模型組相比于空白組，未命名的腸桿菌屬的增加已被證明是空腸彎曲桿菌感染的一種表現，另外，未命名的腸桿菌屬豐度的提高會導致宿主免疫系統的下降[36]。而在本文中，CCFM 1054的干預也使得未命名的腸桿菌屬的豐度得到了顯著下降(P<0.05)，這在某種程度上也暗示著機體免疫的恢復及空腸彎曲桿菌感染的緩解。

a-部分種屬熱圖;b-彎曲桿菌屬豐度變化;c-乳桿菌屬豐度變化;d-片球菌屬豐度變化;e-糞球菌屬豐度變化;f-分節(jié)絲狀桿菌屬豐度變化;g-未命名的腸桿菌豐度變化

2.6 CCFM 1054 干預后小鼠體內空腸彎曲桿菌定植檢測及腸道菌群和體內外指標的相關性分析

病原菌能夠感染宿主，先決條件是其能在體內進行有效定植。本文研究了第9天不同乳酸菌干預組小鼠糞便中空腸彎曲桿菌的活菌數，與此同時，被挑選出的具有顯著差異的種屬也和乳酸菌拮抗空腸彎曲桿菌的相關體內外指標進行了相關性分析，結果如圖5所示。

由圖5可知，CCFM 1054干預后在第9天時空腸彎曲桿菌的活菌數下降到約為105CFU/g，與感染模型組相比下降了4個數量級(P<0.05)。這表明CCFM 1054可以通過在小鼠體內顯著降低空腸彎曲桿菌定植的方式，緩解空腸彎曲桿菌在小鼠體內的感染。數據也迎合了2.5中關于菌群變化影響空腸彎曲桿菌在體內感染的猜想。與我們結果類似的是，FORDER等[37]發(fā)現白羽雞體內的不同腸道菌群會刺激產生黏蛋白基因MUC2，其能夠抑制空腸彎曲桿菌粘附雞小腸上皮細胞，減少空腸彎曲桿菌在宿主中的定植。此外，菌群變化和乳酸菌與拮抗空腸彎曲桿菌相關的體內外特性的相關性表明，CCFM 1054對細胞的高黏附性及其較強的生物膜形成能力與其在小鼠體內顯著改變特定菌群豐度最為相關。如文獻報道，腸道正常菌群粘附腸上皮細胞，可有效促進腸道組織的發(fā)育和成熟，包括黏膜免疫系統，從而抵御病原菌對腸道的侵襲[38]。ELSIA[39]和NABIL[40]的研究也證實了乳酸菌生物膜形成具有一定的益生功能，可以有效抑制李斯特菌或者是其他食源性致病菌的生長，腸道中成膜能力較強菌株往往具備優(yōu)良的穩(wěn)定性與抗逆性，其豐度的上升使得腸上皮表面形成一道天然的屏障，提高腸道免疫系統，增強機體對致病菌的抵御能力。

a-乳酸菌干預后小鼠體內空腸彎曲桿菌定植;b-腸道菌群和體內外指標的相關性分析

3 結論

本研究考察了唾液乳桿菌L.salivariusCCFM 1054體外培養(yǎng)特性，發(fā)現其不僅能夠在體外抑制空腸彎曲桿菌的生長，而且具有較強的粘附HT-29細胞的能力以及自身形成生物膜的能力。CCFM 1054干預灌胃于空腸彎曲桿菌和弓形蟲復合感染的小鼠后，能顯著改變腸道菌群的豐度組成，降低空腸彎曲桿菌在小鼠體內的定植進而緩解病原菌在體內的感染，結果證實CCFM 1054擁有預防人體及家禽空腸彎曲桿菌感染的潛力。