高濃度糖皮質(zhì)激素對(duì)垂體-腎上腺軸的影響

鄧 瓊， 梁 輝， 張建文， 朱婉蓉， 杜 野， 應(yīng) 晶

(南方醫(yī)科大學(xué) 附屬深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院，廣東 深圳 518109)

糖皮質(zhì)激素由腎上腺皮質(zhì)分泌，生理作用廣泛，可調(diào)節(jié)物質(zhì)、水鹽代謝，影響器官系統(tǒng)的功能作用，增強(qiáng)應(yīng)激抵抗力，同時(shí)，糖皮質(zhì)激素在藥理劑量下還具有抗炎、抗休克和免疫抑制作用[1-4]。大腦皮層接受應(yīng)激信號(hào)后激活下丘腦-垂體-腎上腺軸。首先，下丘腦分泌血管升壓素(Arg-Vasopressin，AVP)和促腎上腺皮質(zhì)激素釋放激素(Corticotropin releasing hormone，CRH)進(jìn)入垂體的門靜脈循壞，AVP與CRH通過結(jié)合垂體促腎上腺皮質(zhì)激素(Adreno-Cortico-Tropic-Hormone,ACTH)細(xì)胞膜上的受體，激活相應(yīng)的信號(hào)通路，刺激細(xì)胞分泌ACTH。最后，ACTH作用于腎上腺皮質(zhì)部分，促進(jìn)糖皮質(zhì)激素的合成和分泌。糖皮質(zhì)激素通過與細(xì)胞內(nèi)的受體(Glucocorticoid Receptor,GR)結(jié)合發(fā)揮作用，對(duì)機(jī)體適應(yīng)應(yīng)激和維持正常的代謝活性極其重要[5]。糖皮質(zhì)激素的分泌遵循晝夜節(jié)律，在睡眠或安靜時(shí)分泌水平低一些。在晝夜節(jié)律下，糖皮質(zhì)激素還遵循1h/脈沖的超日節(jié)律[6]。應(yīng)激時(shí)糖皮質(zhì)激素分泌快速上升至應(yīng)激水平，回落的時(shí)間取決于刺激的強(qiáng)度和維持的時(shí)間。在應(yīng)激條件下糖皮質(zhì)激素分泌快速增加的這種模式的對(duì)于機(jī)體適應(yīng)應(yīng)激和維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)極其重要，這種模式受到影響將會(huì)引起代謝，行為，繁殖，免疫和心腦血管等系統(tǒng)的紊亂。

2010年Lightman等提出糖皮質(zhì)激素對(duì)CRH刺激引起的ACTH分泌的快速抑制作用是介導(dǎo)糖皮質(zhì)激素分泌超日節(jié)律的生成機(jī)制的一部分[7,8]。早在1990年，Engler等研究發(fā)現(xiàn)，斷開羊的下丘腦和垂體并不影響皮質(zhì)醇分泌的超日節(jié)律[9]。最近，Lightman等研究發(fā)現(xiàn)持續(xù)給大鼠灌注低劑量的CRH誘導(dǎo)皮質(zhì)酮的脈沖式分泌[10]。這些研究結(jié)果表明了垂體可直接調(diào)控腎上腺分泌糖皮質(zhì)激素，不受下丘腦的控制。

庫欣綜合癥，也稱為皮質(zhì)醇增多癥，最早由Harvey Cushing醫(yī)生于1912年報(bào)道。庫欣綜合征是內(nèi)分泌學(xué)中的經(jīng)典綜合征，這種疾病多是由垂體皮質(zhì)營(yíng)養(yǎng)腺瘤過度分泌ACTH導(dǎo)致皮質(zhì)醇分泌過多引起的[11]。它是一種罕見的疾病，如果沒有有效的治療，會(huì)導(dǎo)致高死亡率和發(fā)病率。內(nèi)源性的糖皮質(zhì)激素濃度過高大部分是由于分泌ACTH的垂體促腎上腺皮質(zhì)激素腺瘤，也有較少是由于異位ACTH分泌的神經(jīng)內(nèi)分泌腫瘤或ACTH非依賴性腎上腺皮質(zhì)醇分泌過多[12]。過高的糖皮質(zhì)激素對(duì)糖皮質(zhì)激素的分泌和生理功能的影響，以及具體的機(jī)制仍然不是十分明確。鑒于此，我們?cè)O(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)，通過體外培養(yǎng)垂體細(xì)胞，建立灌注系統(tǒng)模擬體內(nèi)垂體生理環(huán)境，研究不同濃度糖皮質(zhì)激素條件對(duì)糖皮質(zhì)激素快速反饋的作用，并闡明和補(bǔ)充糖皮質(zhì)激素快速反饋的分子機(jī)制。本研究對(duì)了解慢性應(yīng)激和高循環(huán)糖皮質(zhì)激素引起的疾病中HPA軸的調(diào)節(jié)作用具有重要意義，也有助于進(jìn)一步闡明糖皮質(zhì)激素反饋的分子機(jī)制，并為臨床治療庫欣綜合征提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

本研究中所用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物雄性Sprague Dawley(SD)大鼠來源于廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心(佛山，廣東)。本研究項(xiàng)目經(jīng)深圳市龍華區(qū)人民醫(yī)院動(dòng)物倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)。細(xì)胞培養(yǎng)試劑和材料分別購(gòu)自Gibco(Thermo Fisher，USA)和Corning(NY，USA)，原代垂體細(xì)胞分離培養(yǎng)的試劑購(gòu)自Sigma Aldrich(USA)。

1.2 垂體細(xì)胞的分離培養(yǎng)

垂體細(xì)胞的分離培養(yǎng)方法沿襲于已發(fā)表的論文[13,14]。簡(jiǎn)而言之，研究所用雄性SD大鼠(250±25g)，到達(dá)SPF級(jí)飼養(yǎng)間后自由采食，穩(wěn)定飼養(yǎng)5天以上。實(shí)驗(yàn)大鼠以CO2麻醉昏迷，斷頸法處死后立即打開顱腔取垂體組織。將組織在PBS清洗兩次，清除血塊后將組織剪成大小為1mm3的小塊。PBS清洗一次后，加胰蛋白酶在37℃水浴鍋中來回震蕩15min，加DNase置于冰上以沉降組織塊，去除上清液后加胰蛋白酶抑制劑37℃水浴鍋中來回震蕩10min終止消化，而后分別以2mM和1mM EDTA溶液孵育洗滌組織。用吸管將組織轉(zhuǎn)移至15ml的離心管中，來回反復(fù)輕輕吹打至混濁，置于冰中1min后吸上清液至80目細(xì)胞篩過濾，反復(fù)重復(fù)吹打細(xì)胞，直至將組織塊消化完全。1000rpm離心10min收集細(xì)胞，重懸細(xì)胞后將以細(xì)胞培養(yǎng)基將細(xì)胞稀釋至1.5×106個(gè)/ml，加入Cytodex珠子。37℃，5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中穩(wěn)定培養(yǎng)2h，后加入馬血清及雙抗。

1.3 垂體細(xì)胞灌注

將穩(wěn)定培養(yǎng)48～72h的垂體細(xì)胞轉(zhuǎn)移至灌注系統(tǒng)中，以37℃預(yù)熱的含0.1%BSA的無血清培養(yǎng)基將細(xì)胞平衡2h或6h，設(shè)置轉(zhuǎn)速為0.25ml/min，每5min收集的1.25ml培養(yǎng)液作為一個(gè)樣品。在CRH給藥刺激前，收集6個(gè)樣品作為基礎(chǔ)水平參照。將細(xì)胞灌注液轉(zhuǎn)換成含激素(CRH、皮質(zhì)酮或抑制劑)的培養(yǎng)液，并標(biāo)注給藥的時(shí)間區(qū)間和對(duì)應(yīng)的樣品管號(hào)。以ACTH化學(xué)發(fā)光ELISA試劑盒(Phoenix Pharmaceutical,INC.CEK-001-21)測(cè)定樣品中ACTH的濃度。

1.4 蛋白免疫印跡

小鼠垂體瘤細(xì)胞系A(chǔ)tT20購(gòu)自ATCC Global Bio-resource Center(ATCC，編號(hào)為CRL-1795)。細(xì)胞培養(yǎng)基為DMEM(GlutaMAX-1,Gibco)，添加10%胎牛血清，MEM非必需氨基酸和雙抗。細(xì)胞培養(yǎng)板預(yù)先以多聚賴氨酸包被。細(xì)胞長(zhǎng)滿培養(yǎng)板的80%～85%時(shí)更換活性木炭剝離血清培養(yǎng)基過夜，次日換0.1%BSA培養(yǎng)2h或6h，以皮質(zhì)酮刺激30min，收集細(xì)胞，按照試劑盒說明書提取細(xì)胞膜、細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核蛋白。檢測(cè)GR的抗體來源于Santa Cruz Biotechnology(H-300，1∶1000)，各組分蛋白的持家蛋白分別為GAPDH(細(xì)胞質(zhì)，V-18，Santa Cruz Biotechnology，1∶1000)，Pan Cadherin(細(xì)胞膜，Abcam，1∶5000)和HDAC1(細(xì)胞核，C-19，Santa Cruz Biotechnology，1∶1000)。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

采用軟件SigmaPlot 15.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異性檢驗(yàn)采用One way ANOVA分析。顯著性差異設(shè)置為P<0.05。

2 結(jié)果

2.1 CRH刺激對(duì)ACTH分泌的作用

為研究糖皮質(zhì)激素的反饋?zhàn)饔?，我們需建立穩(wěn)定的ACTH分泌體系。與已發(fā)表文獻(xiàn)所描述一致[12]，如圖1A所示，垂體細(xì)胞接受濃度遞增(30pM，100pM，300pM，1nM，3nM)的5min CRH脈沖刺激，30pM和100pM CRH刺激引起ACTH分泌的顯著增加。更高濃度的CRH則促進(jìn)ACTH的分泌量更大幅度地提高，這些數(shù)據(jù)顯示CRH以劑量依賴的方式刺激ACTH的分泌。

細(xì)胞在受持續(xù)的CRH刺激之前接受5min的CRH脈沖刺激。100pM CRH給藥刺激快速引起ACTH分泌增加，當(dāng)持續(xù)給藥刺激后，ACTH分泌隨時(shí)間推進(jìn)出現(xiàn)了逐漸下降的趨勢(shì)(圖1B)。10pM CRH刺激則不能引起ACTH分泌的升高(圖1C)。30pM的CRH能夠誘導(dǎo)持續(xù)穩(wěn)定的ACTH分泌(圖1D)。因此，我們采用30pM CRH建立垂體細(xì)胞ACTH穩(wěn)定分泌體系。

2.2 皮質(zhì)酮在2小時(shí)和6小時(shí)平衡灌注后對(duì)CRH刺激引起的ACTH分泌的作用

灌注系統(tǒng)中的垂體細(xì)胞接受CRH刺激前以含0.3%BSA的M199培養(yǎng)基預(yù)先孵育2h或6h。孵育2h后，100nM的皮質(zhì)酮似乎有抑制ACTH分泌的趨勢(shì)，統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示，與皮質(zhì)酮添加前的ACTH分泌均值相比，100nM皮質(zhì)酮無法顯著抑制ACTH分泌(n=3,P>0.05)，更高濃度的皮質(zhì)酮，1μM對(duì)CRH刺激引起ACTH穩(wěn)定分泌產(chǎn)生了顯著的抑制(圖2B)。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果表明ACTH的分泌在添加1μM的皮質(zhì)酮25min后才開始出現(xiàn)顯著性的抑制(n=3,P<0.05)。

圖1 垂體細(xì)胞灌注系統(tǒng)中不同劑量CRH對(duì)ACTH分泌的作用Figure 1 CRH-stimulated ACTH secretion in Pituitary Cell PerfusionA.ACTH對(duì)不同劑量CRH給藥刺激的反應(yīng)；B.100pM CRH對(duì)ACTH分泌的影響；C.10pM CRH對(duì)ACTH分泌的影響；D.30pM CRH刺激引起ACTH穩(wěn)定分泌黑色實(shí)心長(zhǎng)條狀(圖B，C和D)代表CRH給藥刺激的時(shí)間區(qū)間A.Effect of different doses of CRH on ACTH secretion；B.ACTH secretion stimulated by 100pM CRH;C.ACTH secretion stimulated by 10pM CRH;D.30pM CRH induced constant ACTH secretion.The long black solid bars in figure B,C and D represent the period of CRH administration.

圖2 皮質(zhì)酮對(duì)CRH刺激引起的ACTH分泌的影響Figure 2 The inhibitory effect of corticosterone on ACTH secretion after 2h preincubationA.100nM皮質(zhì)酮;B.1μM皮質(zhì)酮黑色實(shí)心長(zhǎng)條狀代表CRH給藥刺激的時(shí)間區(qū)間，虛線空心長(zhǎng)條狀代表皮質(zhì)酮給藥刺激的時(shí)間區(qū)間，對(duì)照組取皮質(zhì)酮給藥刺激前CRH刺激引起的ACTH分泌值A(chǔ).100nM corticosterone; B.1μM corticosteroneThe long black solid bars represent the period of CRH administration,and the dotted hollow strips represent corticosterone infusion.The control was set as the ACTH secretion by CRH prior corticosterone administration.

圖3 6h清除后基礎(chǔ)水平的皮質(zhì)酮(10nM)對(duì)CRH刺激引起的ACTH分泌的影響Figure 3 The inhibitory effect of corticosterone on ACTH secretion stimulated by CRH following 6h clearance.10nM corticosterone rapidly prevented CRH-stimulated ACTH secretion.黑色實(shí)心長(zhǎng)條狀代表CRH給藥刺激的時(shí)間區(qū)間，虛線空心長(zhǎng)條狀代表皮質(zhì)酮給藥刺激的時(shí)間區(qū)間The long black solid bars represent the period of CRH administration,and the dotted hollow strips represent corticosterone infusion.

與之對(duì)應(yīng)的是，孵育6h后，10nM皮質(zhì)酮能抑制CRH刺激引起的ACTH分泌(圖3)。在預(yù)先孵育6h后，皮質(zhì)酮給藥刺激5min后顯著抑制ACTH分泌(n=5,P<0.05)，終止給藥刺激5min后ACTH分泌恢復(fù)至給藥前分泌水平(n=5,P<0.05)。以上研究結(jié)果表明，糖皮質(zhì)激素的快速反饋敏感程度與給藥刺激前的無血清培養(yǎng)液孵育時(shí)間有極強(qiáng)的相關(guān)性。

2.3 預(yù)孵育2h或6h的細(xì)胞中GR的表達(dá)水平

采用放射免疫學(xué)法測(cè)定預(yù)孵育2h或6h后細(xì)胞培養(yǎng)液中的糖皮質(zhì)激素濃度(細(xì)胞在皮質(zhì)酮(30分鐘，10nM)給藥以無血清培養(yǎng)基孵育2h或6h)，并以蛋白免疫印跡檢測(cè)GR的表達(dá)。結(jié)果顯示，孵育2h后培養(yǎng)基中的皮質(zhì)醇含量為19.3nM，而6h后為7.2nM。蛋白免疫印跡結(jié)果顯示，基礎(chǔ)生理水平下6h組細(xì)胞的細(xì)胞膜蛋白中GR的表達(dá)與2h組相比要稍低一些(圖4A)，且皮質(zhì)酮刺激引起了細(xì)胞膜蛋白中GR表達(dá)的顯著增加(P<0.05，圖4B)，在2h組中未見顯著變化。細(xì)胞核蛋白中兩組GR的表達(dá)水平以及在皮質(zhì)酮刺激后的改變趨勢(shì)基本一致(圖4C)。

2.4 皮質(zhì)酮的抑制作用是非基因組作用

為進(jìn)一步確定皮質(zhì)酮的抑制作用是非基因組作用，在垂體細(xì)胞灌注系統(tǒng)中添加轉(zhuǎn)錄抑制劑放線菌酮D和蛋白翻譯抑制劑嘌呤霉素，研究二者對(duì)皮質(zhì)酮快速抑制作用的影響。

研究結(jié)果顯示(圖5)，放線菌酮D給藥組和嘌呤霉素給藥組與對(duì)照組相比，兩組的ACTH分泌模式均未出現(xiàn)明顯改變，放線菌酮D及嘌呤霉素對(duì)皮質(zhì)酮的CRH刺激引起的ACTH分泌的抑制作用沒有顯著性影響。這些數(shù)據(jù)表明，皮質(zhì)酮對(duì)ACTH分泌的抑制作用是非基因組作用。

圖4 預(yù)孵育2h或6h后皮質(zhì)酮對(duì)GR表達(dá)水平的影響Figure 4 The effect of corticosterone on GR expression after 2h or 6h pre-incubation.Cells were incubated with serum free medium for 2h or 6h as indicated prior 30 min corticosterone(10nM)administrationA.蛋白免疫印跡檢測(cè)在基礎(chǔ)生理?xiàng)l件下和皮質(zhì)酮刺激后細(xì)胞膜和細(xì)胞核中的GR的表達(dá)水平；B.細(xì)胞膜蛋白組分統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)；C.細(xì)胞核蛋白組分?jǐn)?shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)來源于三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，數(shù)據(jù)以平均值±SEM表示。Con，Control，對(duì)照組；CORT，10nM皮質(zhì)酮刺激30分鐘。*，P<0.05；**，P<0.01A.Representative blots show GR association in membrane and nucleus in cells at basal condition and corticosterone-stimulated cell fractions,with 2h or 6h pre-incubation；B.Statistical date of the membrane fraction；C.Statistical date of the nucleusStatistical data were collected from three repeated experiments,panel.Data were expressed as Mean±SEM.Con,Control;CORT,10nM corticosterone,30min.*,P<0.05;**,P<0.01.

圖5 抑制劑放線菌素D和嘌呤霉素對(duì)皮質(zhì)酮快速反饋和ACTH前體POMC轉(zhuǎn)錄的作用Figure 5 The inhibitory effect of Actinomycin D and puromycin on ACTH secretion and ACTH precursor POMC hnRNA transcriptionA.放線菌素D不能阻止皮質(zhì)酮對(duì)ACTH分泌的抑制作用;B.放線菌素D抑制垂體細(xì)胞中POMC hnRNA的轉(zhuǎn)錄;C.嘌呤霉素不能阻止皮質(zhì)酮對(duì)ACTH分泌的抑制作用黑色實(shí)心長(zhǎng)條狀代表CRH給藥刺激的時(shí)間區(qū)間，虛線空心長(zhǎng)條狀分別代表放線菌素D(嘌呤霉素)和皮質(zhì)酮給藥刺激的時(shí)間區(qū)間。放線菌素D給藥濃度為0.3μg/ml，嘌呤霉素為10μg/ml。A.Actinomycin D is not able to prevent the inhibitory effect of corticosterone on CRH-stimulated ACTH secretion.B.Actinomycin D decreased the transcription of POMC hnRNA;C.Puromycin could not prevent the inhibitory effect of corticosterone-induced ACTH secretion.The long black solid bars represent the period of CRH administration,and the dotted hollow strips represent corticosterone and actinomycin D/puromycin infusion,respectively.Actinmycin D:0.3μg/ml,Puromycin:10μg/ml.

3 討論

在垂體細(xì)胞灌注系統(tǒng)中，CRH刺激引起ACTH水平升高。然而，垂體門靜脈循環(huán)中CRH的最低值(10pM)并不能引起ACTH分泌的升高；100pM CRH快速誘導(dǎo)ACTH分泌升高，持續(xù)刺激后，ACTH水平降低，提示受體可能脫敏；30pM CRH誘導(dǎo)穩(wěn)定的ACTH分泌，因此該濃度被用于建立穩(wěn)定的ACTH分泌體系用于研究糖皮質(zhì)激素的快速反饋。劑量反應(yīng)實(shí)驗(yàn)中，ACTH的水平隨著CRH濃度的增加而升高，表明細(xì)胞灌注系統(tǒng)運(yùn)行良好。

細(xì)胞經(jīng)無血清培養(yǎng)基預(yù)孵育2h，10nM和100nM的皮質(zhì)酮并不能抑制ACTH分泌。應(yīng)激水平的皮質(zhì)酮(1μM)顯著降低ACTH分泌水平。這些數(shù)據(jù)表明，只有應(yīng)激水平皮質(zhì)酮的才能抑制垂體細(xì)胞的ACTH分泌，這是與體內(nèi)生理?xiàng)l件是不一致的。我們推測(cè)，有可能是培養(yǎng)條件，如糖皮質(zhì)激素的存在，影響皮質(zhì)酮反應(yīng)的敏感性。有研究表明，地塞米松治療ACTH腺瘤細(xì)胞比非腺瘤性垂體細(xì)胞，引起的ACTH分泌和POMC mRNA水平的抑制作用要更小一些[15]。

RIP結(jié)果顯示經(jīng)過2h孵育后細(xì)胞培養(yǎng)液中的皮質(zhì)醇濃度為19.3nM，延長(zhǎng)至6h時(shí)濃度為7.3nM。這也就意味著垂體細(xì)胞在灌注時(shí)仍處于高濃度的糖皮質(zhì)激素環(huán)境，高濃度的糖皮質(zhì)激素環(huán)境可能影響ACTH細(xì)胞中糖皮質(zhì)激素的快速反饋。為了清除和擺脫培養(yǎng)液中的糖皮質(zhì)激素，我們嘗試更換含活性炭剝離血清的培養(yǎng)基孵育細(xì)胞過夜，但是細(xì)胞是黏附在Cytodex beads上一起培養(yǎng)的，這給換液帶來了一定的難度，同時(shí)，也降低了細(xì)胞的活性。更換含活性炭剝離血清的培養(yǎng)基后，第二天觀察細(xì)胞發(fā)現(xiàn)，與Cytodex Beads黏附的細(xì)胞數(shù)目減少，細(xì)胞活性降低，轉(zhuǎn)入灌注系統(tǒng)后同樣數(shù)目的細(xì)胞ACTH分泌水平降低。究其原因，我們猜測(cè)一方面是在換液的過程中機(jī)械的損傷導(dǎo)致垂體細(xì)胞與磁珠的解離，另一方面可能是應(yīng)激作用，垂體細(xì)胞并不適應(yīng)活性炭剝離血清的培養(yǎng)基。

在進(jìn)一步的研究中，我們比較了2h和6h無血清培養(yǎng)基孵育后小鼠垂體瘤細(xì)胞系A(chǔ)tT20細(xì)胞中GR的表達(dá)和定位情況。研究結(jié)果顯示，與孵育2h相比，6h后AtT20細(xì)胞中細(xì)胞膜和細(xì)胞核在對(duì)照組的GR表達(dá)水平相對(duì)要更低一些。而皮質(zhì)酮處理30min后，6h的細(xì)胞膜蛋白GR表達(dá)水平變化差異顯著，2h組無顯著差異；兩組的細(xì)胞核的GR含量變化并無顯著性差異。這一結(jié)果與我們之前發(fā)表的文章中提到的GR的膜轉(zhuǎn)運(yùn)可能參與糖皮質(zhì)激素的快速抑制作用高度一致[13]。有研究統(tǒng)計(jì)，皮質(zhì)醇增多癥患者GR mRNA水平降低或者基因雜合性丟失，GR在庫欣綜合征的發(fā)生和臨床表現(xiàn)中起重要作用[16]。

經(jīng)過6h預(yù)孵育后，10nM的皮質(zhì)酮能夠抑制ACTH的分泌，表明了糖皮質(zhì)激素反饋的敏感性取決于在給予皮質(zhì)酮之前，垂體細(xì)胞環(huán)境的類固醇濃度。這一結(jié)果對(duì)于慢性應(yīng)激和高循環(huán)糖皮質(zhì)激素引起的紊亂的HPA調(diào)節(jié)具有重要的意義。細(xì)胞接受重復(fù)皮質(zhì)酮刺激可引起ACTH脈沖式分泌。這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果與之前Lightman提出的垂體-腎上腺的前饋/反饋機(jī)制是介導(dǎo)糖皮質(zhì)激素分泌的晝夜節(jié)律分子機(jī)制的一部分是一致的，也在一定程度上反駁了Abou-Samra[17]和Widmaier[18]所提出的關(guān)于下丘腦可能是糖皮質(zhì)激素快速反饋中心這一假說。

糖皮質(zhì)激素對(duì)CRH刺激的ACTH的快速抑制作用的動(dòng)力學(xué)表明這種作用是非基因組作用。0.3μg/ml轉(zhuǎn)錄抑制劑-放線菌素D，在有效劑量時(shí)未能阻止皮質(zhì)酮的抑制作用，表明糖皮質(zhì)激素對(duì)ACTH分泌的抑制作用是非基因組的，不受轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)。嘌呤霉素是蛋白質(zhì)合成的抑制劑，同樣對(duì)皮質(zhì)酮的快速反饋無顯著作用，暗示這一快速反饋與蛋白質(zhì)合成無直接關(guān)聯(lián)。垂體ACTH細(xì)胞中糖皮質(zhì)激素的快速反饋是前饋/反饋機(jī)制的一部分，介導(dǎo)糖皮質(zhì)激素分泌的晝夜節(jié)律，不受下丘腦CRH分泌脈沖的影響。

總而言之，我們采用了垂體細(xì)胞灌注系統(tǒng)，模擬了體內(nèi)生理環(huán)境，以30pM CRH建立了穩(wěn)定的ACTH分泌體系，培養(yǎng)體系中殘留的糖皮質(zhì)激素降低糖皮質(zhì)激素反饋的敏感性，并且糖皮質(zhì)激素反饋由細(xì)胞膜上的GR介導(dǎo)，不被轉(zhuǎn)錄抑制劑或蛋白翻譯抑制劑阻斷。本研究進(jìn)一步豐富了糖皮質(zhì)激素作用的分子機(jī)制，有助于揭示皮質(zhì)醇增多癥的病因，并為臨床診治提供一定的參考。