檢測豬瘟病毒膠體金和量子點試紙條的初步研制

江地科 尹清清 項明源 王印 姚學(xué)萍 羅燕 楊澤曉 張鵬飛 張保海 周麗軍

摘要：為建立快速、簡便檢測豬瘟病毒（CSFV）抗體的方法，本研究采用膠體金和量子點免疫層析技術(shù)，將純化的重組CSFV E2蛋白作為捕捉抗原，以純化的抗CSFV E2蛋白多克隆抗體和HRP兔抗豬IgG分別包被于硝酸纖維素膜上，作為質(zhì)控線（C線）和檢測線（T線），優(yōu)化反應(yīng)條件，制備免疫層析試紙條，用于臨床檢測。結(jié)果表明，制備的2種試紙條都可用于檢測CSFV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清，使用不同批次試紙條進行檢測，結(jié)果無差異。2種試紙條與CSFV陽性血清反應(yīng)呈陽性，與偽狂犬病毒（PRV）、豬乙型腦炎病毒（JEV）、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（PRRSV）和圓環(huán)病毒2型（PCV2）反應(yīng)呈陰性;膠體金試紙條在臨床樣品中陽性檢出率為84.38%（81/96），與CSFV抗體檢測ELISA試劑盒檢測陽性符合率為92.05%（81/88）;量子點試紙條陽性檢出率為87.50%（84/96），與ELISA試劑盒檢測陽性符合率為95.45%（84/88）。本研究制備的2種試紙條都具有較好的特異性、敏感性、重復(fù)性和穩(wěn)定性。

關(guān)鍵詞：豬瘟病毒;E2蛋白;膠體金;量子點

中圖分類號：S852.65+1文獻標(biāo)識碼：A文章編號：1000-4440（2020）01-0116-06

Abstract：Two test strips for rapid detection of the classical swine fever virus（CSFV） antibody were developed based on colloidal gold and quantum dots immunochromatographic assay. The recombinant CSFV E2 protein was incubated on test strip as capture antigen， and the rabbit anti-pig IgG was immobilized on the test line as detection antibody. In addition， anti-CSFV E2 protein polyclonal antibody was blotted on the control line of the nitrocellulose membrane. The results showed that the two test strips could be used to detect the CSFV positive serum. The test strips did not capture unspecific virus proteins which derived from pseudorabies virus（PRV）， Japanese encephalitis virus（JEV）， porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV） and porcine circovirus type 2（PCV2）. In the detection of clinical samples， the positive detection rate of colloidal gold immunochromatographic strip was 84.38% （81/96）， and the coincidence rate was 92.05%（81/88） compared with CSFV antibody IDEXX kit （ELISA）. The positive detection rate of quantum dot immunochromatographic strip was 87.50%（84/96）， and the coincidence rate was 95.45%（84/88）compared with CSFV antibody IDEXX kit （ELISA）. The two test strips prepared in this study have good specificity， sensitivity， repeatability and stability.

Key words：classical swine fever virus;E2 protein;colloidal gold;quantum dots

豬瘟（Classical swine fever， CSF）是由豬瘟病毒（Classical swine fever virus，CSFV）引起的豬的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病，該病發(fā)病率和病死率都在90%以上，給養(yǎng)豬業(yè)造成了極大經(jīng)濟損失，并且被世界動物衛(wèi)生組織（Office International des Epizooties ，OIE）列為通報疾病，被中國列為一類動物疫病 [1-2]。目前，針對CSFV最有效的防控措施就是采用疫苗免疫。農(nóng)業(yè)部宣布2020年底爭取全國所有種豬場和部分區(qū)域達到豬瘟凈化標(biāo)準(zhǔn)，并且從2017年開始取消對該病毒的強制免疫，意味著在未來豬群體內(nèi)存在較少或無CSFV抗體，通過檢測抗體就能判斷該豬群是否感染CSFV病毒。目前，ELISA是檢測CSFV抗體的主要方法，但該方法需要實驗室儀器支撐，且存在操作繁瑣、耗時長等問題，無法滿足中小型豬場及臨床獸醫(yī)工作人員的需求，因此建立一種快速、簡便、靈敏和特異的CSFV抗體檢測方法是有必要的。已有研究結(jié)果表明，豬瘟病毒的E2囊膜糖蛋白能刺激宿主產(chǎn)生大量的中和抗體，可用于建立血清學(xué)檢測方法[3-4]。

膠體金免疫層析（Colloidal-gold immunochromatography assay， GICA）技術(shù)具有快速、簡便、靈敏等特點[5-6]，適用于臨床大量樣品檢測，在畜禽疾病監(jiān)測上已得到廣泛的研究與引用。量子點（quantum dots， QDs）又名無機半導(dǎo)體納米晶體，是近年來發(fā)展起來的一種新型熒光納米材料，組成的元素一般在II—VI族，組成的球形顆粒直徑在1～10 nm[7]。與傳統(tǒng)的有機染料相比，該技術(shù)具有顏色豐富、光化學(xué)性質(zhì)穩(wěn)定、不宜被分解等特點，將其與免疫層析技術(shù)結(jié)合，不僅可提高檢測的靈敏性和穩(wěn)定性，而且還能進行定量檢測[8-9]。

本研究采用膠體金和量子點免疫層析技術(shù)，選用CSFV E2蛋白作為捕捉抗原，將純化的抗CSFV E2蛋白多克隆抗體和HRP兔抗豬IgG分別包被質(zhì)控線（C線）和檢測線（T線），并對HRP兔抗豬IgG濃度優(yōu)化和CSFV E2重組蛋白多克隆抗體進行稀釋倍數(shù)優(yōu)化，制備膠體金和量子點免疫層析試紙條，用于臨床檢測。

1材料與方法

1.1試驗材料

豬偽狂犬病毒（Pseudorabies virus， PRV）陽性血清、豬乙型腦炎病毒（Swine japanese encephalitis virus， JEV）陽性血清、豬繁殖與呼吸綜合征病毒（Porcine reproductive and respiratory syndrome virus， PRRSV）陽性血清、豬瘟病毒（CSFV）陽性血清、豬瘟病毒（CSFV）陰性血清、圓環(huán)病毒2型（Porcine circovirus type 2， PCV2）陽性血清由本實驗室保存，聚乙二醇20000（PEG20000）、牛血清白蛋白（BSA）、氯金酸、檸檬酸三鈉購自博大萬科有限公司，硝酸纖維膜（NC膜）Millipore HilFlow-135、吸水紙Paper-20300、玻璃纖維素膜（金標(biāo)墊）Gls-17930、聚酯纖維素（樣品墊）VL 983、PVC底板SM31-40購于北京吉森生物科技有限公司，水溶性量子點（CdSe）、牛血清白蛋白（BSA）、1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（EDC·HCl）和N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、2-嗎啉乙磺酸（MES）、甘氨酸（Gly）購于北京索萊寶生物科技有限公司，其他試劑為國產(chǎn)分析純。

1.2膠體金顆粒的制備

采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金顆粒，透射電鏡觀察，4 ℃避光保存，備用[10]。

1.3量子點與重組蛋白偶聯(lián)

將20 μl QDs加入1.5 ml離心管中，以200 μl 1% PBS進行稀釋，再加入一定體積的EDC·HCl（5 mg/ml）溶液和NHS溶液，37 ℃恒溫旋轉(zhuǎn)搖床避光孵育2 h，加入一定體積的β-巰基乙醇至上述離心管中，再將重組E2蛋白加入溶液中，37 ℃反應(yīng)過夜后加入7.5%甘氨酸（Gly）溶液+1% BSA溶液，將未與蛋白偶聯(lián)的已活化羧基進行封閉處理，37 ℃反應(yīng)2 h。14 000 r/min離心15 min后進行復(fù)溶，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4金標(biāo)蛋白和QDS偶聯(lián)條件篩選

1.4.1試紙條最適pH的篩選

1.4.1.1膠體金標(biāo)記最適pH的篩選取6只1.5 ml的離心管，每管加入1 ml膠體金溶液，加入100 μl（1 mg/ml）經(jīng)過處理的重組蛋白，分別用K2CO3 （0.2 mol/L） 調(diào)整pH為6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5，靜置1 h，離心，重懸觀察，記錄保持原色的最低pH值。

1.4.1.2量子點偶聯(lián)最適pH的篩選取4只1.5 ml的離心管，加入20 μl QDs和200 μl PBS混勻，分別用硼酸緩沖液調(diào)節(jié)pH為7、8、9、10，加入一定量體積的5 mg/ml的EDC和5 mg/ml的NHS活化2 h后，用PBS清洗EDC/NHS后加入重組E2蛋白，37 ℃避光偶聯(lián)8 h后，加入封閉液封閉2 h，離心觀察偶聯(lián)狀態(tài)，紫外燈下觀察結(jié)果。

1.4.2試紙條最適蛋白質(zhì)量的篩選

1.4.2.1E2最適蛋白質(zhì)量的篩選取6只1.5 ml的離心管，每管加入1 ml已優(yōu)化pH值的膠體金溶液，加入10 μl 、20 μl、30 μl、40 μl、50 μl、60 μl不同體積重組E2蛋白，靜置1 h，離心重懸，觀察顏色變化并記錄溶液保持紅色的最低穩(wěn)定蛋白質(zhì)含量。

1.4.2.2量子點偶聯(lián)最適蛋白質(zhì)量的篩選取5只1.5 ml的離心管，分別加入20 μl已純化的量子點和200 μl的PBS，pH調(diào)節(jié)至最佳，加入已優(yōu)化的EDC/NHS活化2 h后，加入0.5 mg/ml重組E2蛋白5 μl、10 μl、15 μl、20 μl、25 μl，37 ℃避光偶聯(lián)過夜后，加入封閉液封閉2 h，離心觀察偶聯(lián)狀態(tài)。

1.4.3膠體金標(biāo)記E2蛋白的獲取根據(jù)上述步驟將E2蛋白緩慢加入已優(yōu)化pH值的膠體金溶液中，室溫攪拌30 min，加入終濃度為1%的BSA和PEG20000膠體金穩(wěn)定保護液，4 ℃靜置1 h，10 000 r/min離心30 min，吸取上清液，將沉淀用金標(biāo)稀釋液懸浮，最終體積為原始體積的1/20，4 ℃保存。

1.4.4試紙條的組裝參照文獻[11]中的方法，將金標(biāo)墊、NC膜、樣品墊、吸水墊和PVC膠板裝配成寬度為4 mm的檢測試紙條。

1.5膠體金和量子點試紙條檢測線與質(zhì)控線檢測條件的優(yōu)化

1.5.1兔抗豬IgG（T線）濃度的優(yōu)化取10 μl兔抗豬IgG，分別按照1∶2、1∶4、1∶8、1∶16比例稀釋后劃線至檢測線（T線），其他條件不變，加陽性CSFV血清抗體觀察結(jié)果，量子點需在紫外線條件下觀察結(jié)果。

1.5.2兔多克隆抗體（C線）濃度的優(yōu)化取適量的兔抗重組E2蛋白多克隆抗體分別按照1∶2、1∶4、1∶6、1∶8、1∶10比例稀釋后，劃線于NC膜上作為質(zhì)控線（C線），其他條件不變，加入PBS觀察檢測結(jié)果。

1.6膠體金和量子點試紙條性能評價

1.6.1特異性分別將CSFV陽性血清和陰性血清以及PRV、 JEV、PRRSV和PCV-2的陽性血清進行膠體金和量子點試紙條檢測，觀察檢測結(jié)果判定其特異性。

1.6.2靈敏度將CSFV陽性血清分別進行1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30稀釋，取50 μl稀釋后的血清滴加于試紙條樣品墊，室溫靜止10～15 min，將試紙條檢測的最大稀釋倍數(shù)定為試紙條靈敏度。

1.6.3重復(fù)性試驗利用3個不同批次的試紙條分別檢測陽性血清，設(shè)立3個重復(fù)，觀察檢測結(jié)果。同時，將同一批次制備的試紙條，設(shè)置3個重復(fù)試驗分別進行陽性標(biāo)準(zhǔn)血清檢測，觀察檢測結(jié)果。

1.6.4臨床樣本檢測將本研究建立的膠體金及量子點免疫層析試紙條和IDEXX 公司CSFV抗體檢測ELISA試劑盒分別對臨床采集的血清（96份）進行檢測，對比檢測結(jié)果，計算符合率。

2結(jié)果與分析

2.1膠體金的制備及質(zhì)量鑒定結(jié)果

制備的膠體金溶液呈酒紅色，由Nanodrop 2000測量可知，制備的膠體金波長為530 nm。隨機取50個膠體金通過透射電子顯微鏡觀察顆粒大小，測量其直徑，粒徑均為30 nm。

2.2試紙條最適pH值

2.2.1膠體金標(biāo)記最適pH值膠體金標(biāo)記E2蛋白最適pH值試驗結(jié)果顯示，每1 ml膠體金溶液中添加0.2 mol/L K2CO3 調(diào)整pH值至7.5時，標(biāo)記膠體金離心呈油滴狀，復(fù)溶后易溶解。

2.2.2量子點標(biāo)記最適pH值按照方法1.4.1.2的方法，離心管中加入20 μl QDs（1 mmol/L），加入50 μl（0.5 mg/ml）重組蛋白和相應(yīng)比例的EDC/NHS，用硼酸調(diào)整溶液pH值。結(jié)果表明，當(dāng)溶液pH值為7以及加入的QDs與EDC/NHS的劑量比為1∶5時，溶液偶聯(lián)狀態(tài)表現(xiàn)穩(wěn)定。

2.3試紙條最適蛋白質(zhì)量

2.3.1膠體金標(biāo)記最適蛋白質(zhì)量膠體金標(biāo)記E2蛋白試驗結(jié)果顯示，每1 ml膠體金溶液中至少添加30 μl（1 mg/ml）E2蛋白能使溶液保持紅色，在臨床實踐中，需在此基礎(chǔ)上增加15%～30%。

2.3.2量子點標(biāo)記最適蛋白質(zhì)量量子點標(biāo)記E2蛋白試驗結(jié)果顯示，加入少量的E2蛋白，離心管底部會出現(xiàn)大量聚沉，當(dāng)加入20 μl （0.5 mg/ml）的重組E2蛋白時，量子點偶聯(lián)狀態(tài)穩(wěn)定（圖1）。

2.4試紙條檢測線與質(zhì)控線檢測條件的優(yōu)化

2.4.1膠體金試紙條檢測條件的優(yōu)化本試驗制備膠體金試紙條T線（兔抗豬IgG）的最佳稀釋倍數(shù)為1∶8（1 mg/ml）;C線（兔多克隆抗體）最佳稀釋倍數(shù)為1∶6;優(yōu)化條件后檢測CSFV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清和陰性血清的結(jié)果見圖2A。

2.4.2量子點試紙條檢測條件的優(yōu)化本試驗制備量子點試紙條T線（兔抗豬IgG）的最佳稀釋倍數(shù)為1∶8，濃度為1 mg/ml;C線（兔多克隆抗體）稀釋倍數(shù)為1∶8時，C線依舊清晰，但考慮后續(xù)與膠體金試紙條進行對比檢測，故選擇C線包被稀釋倍數(shù)為1∶6（圖2B）。

2.5特異性試驗結(jié)果

利用本研究制備的膠體金和量子點試紙條，進行不同病毒陽性血清檢測，結(jié)果顯示2種試紙條都能與CSFV陽性血清反應(yīng)呈陽性，與其余病毒陽性血清反應(yīng)均呈陰性，表明制備的試紙條特異性好，不與其他病原發(fā)生交叉反應(yīng)（圖3）。

2.6靈敏度

膠體金和量子點試紙條靈敏度試驗結(jié)果顯示，將CSFV陽性血清稀釋至1∶25時T線仍可出現(xiàn)（圖4），表明制備的2種試紙條都具有良好的靈敏性。

2.7膠體金和量子點試紙條重復(fù)性試驗結(jié)果

將不同批次制備的膠體金和量子點試紙條進行CSFV標(biāo)準(zhǔn)陽性血清檢測，每個批次進行3次重復(fù)，結(jié)果表明所有重復(fù)都能清楚顯示T線和C線，說明這2種試紙條具有良好的重復(fù)性。

2.8臨床樣本檢測結(jié)果

臨床樣本檢測結(jié)果（表1）顯示，本試驗制備的膠體金（GICA）試紙條檢測陽性率為84.38%（81/96），量子點（FICA）試紙條檢測陽性率為87.50%（84/96）;ELISA試劑盒檢測陽性率為91.67%（88/96），與膠體金（GICA）試紙條和量子點（FICA）試紙條符合率分別為92.05%（81/88）和95.45%（84/88）。

3討論

法國、荷蘭、德國、比利時等國家曾經(jīng)對外宣布已消滅豬瘟達到凈化的標(biāo)準(zhǔn)，但仍可能存在復(fù)發(fā)的跡象[12]。自2012年5月，中國將豬瘟列入重點防治病種，經(jīng)過幾年不懈努力，豬瘟疫情得到有效控制。2017年3月，農(nóng)業(yè)部取消對豬瘟強制免疫工作[13]，也意味著在未來中國部分地區(qū)豬群可能存在少量或者無CSFV抗體，因此只需檢測CSFV抗體就能判斷豬群是否感染CSFV病毒。2018年9月，日本岐阜市爆發(fā)豬瘟疫情，中國作為其鄰近國家，存在豬瘟病毒進入中國的風(fēng)險。目前，中國主要采用ELISA方法監(jiān)測免疫豬群的抗體水平[14-15]，此方法耗時較長、操作繁瑣，并且需要借助酶標(biāo)儀等儀器進行操作。膠體金試紙條技術(shù)融合了免疫層析技術(shù)、酶聯(lián)免疫吸附試驗和膠體金標(biāo)記等技術(shù)的特點，具有快速、準(zhǔn)確、簡便和靈敏等特點，不受場地、溫度等外界環(huán)境因素影響，適合基層獸醫(yī)及養(yǎng)殖場技術(shù)人員使用[16]。量子點作為一種新型熒光材料，具有激發(fā)光譜范圍寬，發(fā)射線窄，發(fā)光效率高，發(fā)光顏色可調(diào)，穩(wěn)定性強等優(yōu)點，是目前抗原抗體快速檢測方法學(xué)的熱點話題[17-18]，并且中國還未見有關(guān)量子點免疫層析技術(shù)進行豬瘟病毒檢測的研究，故本研究采用膠體金和量子點標(biāo)記重組E2蛋白，兔抗豬IgG經(jīng)8倍稀釋作為檢測線（T線），兔抗重組E2蛋白多克隆抗體經(jīng)6倍稀釋作為質(zhì)控線（C線），進行試紙條組裝，檢測CSFV陽性血清。

本研究制備的膠體金和量子點試紙條特異性試驗結(jié)果顯示，2種試紙條都能和CSFV陽性標(biāo)準(zhǔn)血清反應(yīng)呈陽性，和其余各病毒陽性血清反應(yīng)均呈陰性，表明2種試紙條具有良好的特異性;靈敏度試驗結(jié)果顯示，將CSFV陽性血清稀釋至25倍時膠體金和量子點試紙條均可見陽性反應(yīng)，該試紙條檢測靈敏度高于尹梅等[19]研制的膠體金試紙條。臨床樣品檢測試驗結(jié)果顯示，量子點試紙條陽性率和符合率都高于膠體金試紙條，并且這2種試紙條檢出率基本和ELISA試劑盒檢出率基本一致。因此，本研究制備的2種試紙條可為快速檢測豬瘟病毒抗體奠定基礎(chǔ)。

參考文獻：

[1]YUAN J， ZHU M， DENG S， et al. Classical swine fever virus induces pyroptosis in the peripheral lymphoid organs of infected pigs[J]. Virus Research， 2018，250（5）：37-42.

[2]陳姝承，孫慧敏，李素，等.針對豬瘟病毒E2蛋白的嵌合豬源化單克隆抗體的表達及抗病毒活性鑒定[J].生物工程學(xué)報，2017，33（8）：1235-1243.

[3]XU X G， TONG D W， LIU H W. Baculovirus surface display of E0E1E2 envelope glycoprotein of CSFV and immunogenicity of the displayed proteins in mouse model[J]. Journal of Northwest A & F University，2009，37（12）：73-79.

[4]GONG Y， TROWBRIDGE R， MACNAUGHTON T B， et al. Characterization of RNA synthesis during a one-step growth curve and of the replication mechanism of bovine viral diarrhoea virus[J]. Journal of General Virology， 1996， 77（11）：2729-2736.

[5]孫雪霏. 豬弓形蟲抗體間接ELISA方法的建立及膠體金試紙條的制備[D].長春：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)， 2016.

[6]傅秋玲，程龍飛，萬春和，等.半番鴨胚中鵝細小病毒的分離鑒定及其基因組分子特征分析[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報， 2017， 48（11）：2148-2156.

[7]KOBAYASHI H， HAMA Y， KOYAMA Y， et al. Simultaneous multicolor imaging of five different lymphatic basins using quantum dots[J]. Nano Letters， 2007， 7（6）：1711-1716.

[8]QIU W， XU H， TAKALKAR S， et al. Carbon nanotube-based lateral flow biosensor for sensitive and rapid detection of DNA sequence[J].Biosensors and Bioelectronics，2015， 64（2）：367-372.

[9]LIU C Y， JIA Q J， YANG C H， et al. Lateral flow immunochromatographic assay for sensitive pesticide detection by using Fe3O4 nanoparticle aggregates as color reagents[J]. Analytical Chemistry，2011，83（17）：6778-6784.

[10]王向鵬，孫元，楊增岐，等.檢測豬瘟病毒野毒株膠體金免疫層析方法的建立[J].中國預(yù)防獸醫(yī)學(xué)報，2010，32（6）：441-445.

[11]魏后軍，范志宇，王芳，等.檢測兔出血癥病毒抗體膠體金試紙條的研制及初步應(yīng)用[J].畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2018，49（3）：614-619.

[12]TARRADAS J， EUGENIA D L T M， ROSELL R， et al. The impact of CSFV on the immune response to control infection[J].Virus Research，2014，185（6）：82-91.

[13]韓燾，張寧寧，齊魯，等.豬瘟退出強制免疫后的若干問題[J].中國動物檢疫， 2017（5）：60-63.

[14]袁莉，楊順利，尚佑軍，等.豬瘟病毒結(jié)構(gòu)蛋白抗體間接ELISA檢測方法的建立及評價[J].西北農(nóng)業(yè)學(xué)報，2018，27（9）：43-49.

[15]藺輝星，周紅，童澤鑫，等.豬瘟病毒血清抗體間接ELISA檢測方法的建立[J]. 中國獸醫(yī)科學(xué)，2017（1）：9-15.

[16]張杰，胡軍，劉楊，等.肺炎支原體快速檢測方法的建立及應(yīng)用評價[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2016，37（17）：2379-2381.

[17]樊淑華，王永立.膠體金免疫層析技術(shù)應(yīng)用研究進展[J].動物醫(yī)學(xué)進展，2014，35（10）： 99-103.

[18]胡紀(jì)文，張大準(zhǔn)，熊建輝，等.肺炎支原體抗原量子點免疫層析法的建立及初步應(yīng)用[J].國際檢驗醫(yī)學(xué)雜志，2018，39（2）：220-223.

[19]尹梅.豬瘟病毒抗體膠體金免疫層析快速檢測試紙條的研制及初步應(yīng)用[D].南京：南京農(nóng)業(yè)大學(xué)，2013.

（責(zé)任編輯：陳海霞）