單環(huán)刺螠Urechisunicinctus幼體腸道消化酶活性的測(cè)定方法

楊成林 林淦旻 常林瑞 劉學(xué)遷 劉峰 趙彥翠

摘 要：探究了單環(huán)刺螠（Urechis unicinctus）幼體（平均體重（1.468 ± 0.222）g）腸道蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的測(cè)定方法、操作步驟、注意事項(xiàng)。蛋白酶測(cè)定采用Folin-酚法，其中建立的酪氨酸回歸方程為y=15.487x-0.092 3（決定系數(shù)R2=0.999 2）;淀粉酶測(cè)定采用淀粉-碘比色法，以0.08%的淀粉溶液為底物。脂肪酶測(cè)定采用聚乙烯醇橄欖油乳化液水解法（NaOH滴定法）。結(jié)果表明，單環(huán)刺螠幼體腸道蛋白酶活力、淀粉酶、脂肪酶活力分別為29.350±2.592、10.600±0.844、（5.266±0.224）U/mg prot。

關(guān)鍵詞：?jiǎn)苇h(huán)刺螠（Urechis unicinctus）;腸道;蛋白酶;淀粉酶;脂肪酶;測(cè)定方法

中圖分類號(hào)：S917.4

單環(huán)刺螠（Urechis unicinctus）俗稱海腸、海腸子，屬于螠蟲動(dòng)物門（Echiurioidea），螠綱（Echiurida），無管螠目（Xenopneusta），刺螠科（Urchidae）、刺螠屬（Urechis），適應(yīng)能力強(qiáng)，挖“U”型洞穴，棲息于泥沙岸潮間帶下區(qū)和潮下帶淺水區(qū)泥沙底質(zhì)，棲息地廣泛分布于俄羅斯、朝鮮半島、日本和中國(guó)的黃渤海沿岸[1]。作為名貴的海鮮產(chǎn)品，單環(huán)刺螠具有極高的開發(fā)養(yǎng)殖前景。單環(huán)刺螠味道鮮美，營(yíng)養(yǎng)豐富，體壁肌含有豐富的蛋白質(zhì)以及人體需要的氨基酸，具有極高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，被譽(yù)為“裸體海參”。單環(huán)刺螠體內(nèi)存在速激肽[2]、抗凝血肽[3]等多種生物活性肽，這些生物活性肽具有抗菌、抗腫瘤及提高小鼠免疫力等功能[4]，因此單環(huán)刺螠還是一種具有潛在藥用價(jià)值的海洋無脊椎動(dòng)物。隨著單環(huán)刺螠育苗技術(shù)的突破，單環(huán)刺螠的規(guī)模化育苗和養(yǎng)殖在遼寧大連、山東煙臺(tái)等地也日漸展開。單環(huán)刺螠的消化道結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單，主要包括食道、嗉囊、砂囊、胃、腸道等，其中腸約占消化道長(zhǎng)度的60%，并且細(xì)胞內(nèi)有大量的泡狀結(jié)構(gòu)和線粒體，可以認(rèn)為中腸是單環(huán)刺螠物質(zhì)吸收的主要場(chǎng)所[5-6]。目前關(guān)于單環(huán)刺螠消化酶的研究較少。許星鴻等[7]通過Folin-酚法、淀粉-碘比色法、NaOH滴定法，采用正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，研究了不同鹽度、pH及溫度對(duì)單環(huán)刺螠成體（平均體重為（71.2±8.5）g）腸道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活力的影響。但是許星鴻等[7]的研究并沒有具體詳細(xì)的測(cè)定方法，同時(shí)目前關(guān)于單環(huán)刺螠幼苗腸道消化酶的研究也未見報(bào)道。單環(huán)刺螠的規(guī)模化育苗和養(yǎng)殖的發(fā)展，離不開餌料/飼料的開發(fā)，而消化酶活力研究有助于了解單環(huán)刺螠對(duì)餌料/飼料中基本營(yíng)養(yǎng)成分的消化能力，為其篩選餌料/飼料原料提供依據(jù)。本研究探索單環(huán)刺螠幼體腸道蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活性的測(cè)定方法、操作步驟及注意事項(xiàng)，研究單環(huán)刺螠幼體腸道蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶活性，以期為單環(huán)刺螠人工餌料/飼料的開發(fā)提供基礎(chǔ)研究方法。

1 材料與方法

1.1 粗酶液的制備

取實(shí)驗(yàn)室養(yǎng)殖單環(huán)刺螠30頭，平均體重為（1.468±0.222）g（平均值±標(biāo)準(zhǔn)差）。10頭一組，隨機(jī)分成3組。每一組用解剖工具在冰盤上將單環(huán)刺螠的腸道完整取出，用濾紙吸干腸表面的水分，稱重，10頭混成一個(gè)樣品（分別為樣品1、樣品2、樣品3），按樣品重量與體積比為1∶9加入0.85%的生理鹽水在冰浴條件下進(jìn)行研磨，研磨后將勻漿液進(jìn)行離心（4 ℃，4 000 r/min），所得上清液就是粗酶液，將粗酶液在液氮中速凍后，轉(zhuǎn)移到-80 ℃冰箱保存，備用。

1.2 粗酶液蛋白濃度的測(cè)定

樣品粗酶液的蛋白濃度采用考馬斯亮藍(lán)試劑盒（南京建成生物工程研究所）測(cè)定。根據(jù)試劑盒說明書的步驟進(jìn)行實(shí)驗(yàn)操作，每個(gè)樣品設(shè)置兩個(gè)平行樣進(jìn)行測(cè)定，每個(gè)樣品的結(jié)果取兩次平行的平均值。樣品粗酶液中蛋白濃度的單位換算為mg prot/mL。

1.3 蛋白酶活性的測(cè)定——福林-酚法

本實(shí)驗(yàn)采用福林-酚法[8]測(cè)定單環(huán)刺螠腸道蛋白酶活力，F(xiàn)olin-酚試劑是磷鎢酸（H3O40PW12）與磷鉬酸（H3PO4·12MoO3）混合試劑，在pH值大于7的情況下極其不穩(wěn)定，被酚類化合物還原而成藍(lán)色（鎢蘭與鎢蘭的混合價(jià)態(tài)的藍(lán)色化合物）。蛋白質(zhì)中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸），因此可用蛋白酶水解酪素生成酚基氨基酸的呈色反應(yīng)來間接測(cè)定蛋白酶活力。本實(shí)驗(yàn)使用的福林試劑購(gòu)于北京索萊寶科技有限公司。

1.3.1 實(shí)驗(yàn)主要試劑

0.02 M pH值7.5磷酸緩沖液、0.5 M NaOH溶液、0.5%酪素。

0.5%酪素的配制：稱取酪蛋白0.5 g以0.5 M NaOH 1 mL潤(rùn)濕，加入60 mL 0.02 M pH 7.5磷酸緩沖液稀釋后在熱水浴中不斷攪拌至完全溶解。待完全冷卻后，轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶，再用0.02 M pH7.5的磷酸緩沖液定容（冰箱可保存一周）[9]。

1.3.2 酶活力的測(cè)定

1.3.2.1 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線制作

1.3.2.1.1 主要試劑及配制

1 mol/L鹽酸、0.55 M Na2CO3 溶液、10%三氯乙酸、100.0 μg/mL 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

100.0 μg/mL 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液：精確稱取L-酪氨酸0.050 0 g（105 ℃干燥至質(zhì)量恒定），用1 mol/L鹽酸溶液30 mL溶解后用50 mL容量瓶定容，即為1.00 mg/mL 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。吸取1.00 mg/mL 酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液10.00 mL，用0.1 mol/L鹽酸溶液（將1 mol/L鹽酸溶液稀釋10倍即得0.1 mol/L鹽酸溶液）定容至100 mL容量瓶，即可得到100.0 μg/mL L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。

1.3.2.1.2 L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用100.0 μg/mL L-酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制系列濃度的L-酪氨酸溶液（0、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100 μg/mL），配制方法見表1。取10 mL離心管，分別取上述系列濃度的L-酪氨酸溶液1.00 mL，各加5.00 mL 0.55 M Na2CO3 溶液，再各加入1.00 mL福林試劑，放入37 ℃恒溫水浴鍋中水浴顯色15 min，用分光光度計(jì)于波長(zhǎng)680 nm[10]，以A管為空白管調(diào)零（表1），分別測(cè)定吸光值，每個(gè)系列濃度做兩個(gè)平行，OD值取兩個(gè)平行的平均值。

以反應(yīng)液吸光度OD680為橫坐標(biāo)（表1），以各管反應(yīng)液中酪氨酸的實(shí)際濃度為縱坐標(biāo)（表1），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線并計(jì)算回歸方程（圖1）。

1.3.2.2 實(shí)驗(yàn)樣品的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)設(shè)置1個(gè)對(duì)照組與3個(gè)樣品測(cè)定組，對(duì)照組和每個(gè)測(cè)定組分別設(shè)兩個(gè)平行，吸光值取兩個(gè)平行的平均值。反應(yīng)用具蓋的離心管以便混勻與離心，粗酶液稀釋40倍后用于測(cè)定，測(cè)定步驟如表2。完全混勻后，置于37 ℃恒溫水浴鍋中水浴顯色15 min后，于680 nm波長(zhǎng)處以對(duì)照組校零，讀取樣品測(cè)定組吸光值。利用繪制的酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算出酪氨酸濃度后，進(jìn)行蛋白酶活力的計(jì)算。

1.3.2.3 注意事項(xiàng) 酶液與底物的作用溫度、作用時(shí)間要嚴(yán)格控制，否則將對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果有較大的影響。在正式實(shí)驗(yàn)之前，對(duì)于同一樣品，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)確定粗酶液需要稀釋的倍數(shù)，以保證實(shí)驗(yàn)樣品的吸光值在酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)。

1.4 淀粉酶活性的測(cè)定——淀粉-碘比色法

淀粉-碘比色法的原理在于淀粉經(jīng)淀粉酶水解后的產(chǎn)物與碘液可形成藍(lán)色包合物[10]。分析淀粉酶活力有助于研究與分析其腸道對(duì)不同食物來源的淀粉的消化能力[11]。

1.4.1 主要試劑的配制

0.08%可溶性淀粉：精確稱取可溶性淀粉0.20 g，用蒸餾水約10 mL溶解，充分?jǐn)嚢枋蛊涑傻矸蹜乙海耆D(zhuǎn)移至250 mL容量瓶中，再用蒸餾水定容。淀粉懸液可在0～4 ℃冰箱內(nèi)保留一周（最好現(xiàn)配現(xiàn)用）。

0.1 M碘貯存液：準(zhǔn)確稱取碘化鉀（KI）11.25 g及碘酸鉀（KIO3）0.891 7 g置于500 mL燒杯中，加入200 mL蒸餾水，待完全溶解后緩慢地加入2.25 mL濃鹽酸，混勻后轉(zhuǎn)入250 mL容量瓶中，再用蒸餾水定容。置于冰箱中備用。

0.01 M碘應(yīng)用液：量取0.1 M碘貯存液20 mL，用蒸餾水稀釋至200 mL（200 mL容量瓶定容），貯存于棕色瓶中?？稍?～4 ℃冰箱內(nèi)保存約一個(gè)月。

1.4.2 實(shí)驗(yàn)樣品的測(cè)定 實(shí)驗(yàn)設(shè)置1個(gè)對(duì)照組和3個(gè)樣品測(cè)定組，每組分別設(shè)置兩個(gè)平行，吸光值取兩個(gè)平行的平均值。取10 mL離心管，標(biāo)注對(duì)照組與測(cè)定組，粗酶液稀釋10倍后用于測(cè)定，具體操作步驟見表3[12]。立刻混勻。用蒸餾水校零，于660 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光值。

1.4.3 注意事項(xiàng) 當(dāng)?shù)矸勖负枯^多或活性較高時(shí)，因淀粉被淀粉酶全部水解而不顯色，故可根據(jù)反應(yīng)顯色程度，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)，調(diào)整淀粉濃度、粗酶液稀釋倍數(shù)及使用量。此外，淀粉溶液較為穩(wěn)定，故對(duì)照組的吸光值不會(huì)改變，因此在測(cè)定中不用每次都設(shè)置對(duì)照組。反應(yīng)后出現(xiàn)藍(lán)色沉淀，因而測(cè)定時(shí)須將溶液混勻后再進(jìn)行測(cè)定，否則將影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。

1.5 脂肪酶活性測(cè)定方法——聚乙烯醇橄欖油乳化液水解法（NaOH滴定法）

聚乙烯醇橄欖油乳化液水解法測(cè)定單環(huán)刺螠脂肪酶活性的原理為天然油脂被水解后而生成的游離脂肪酸可以被NaOH中和，反應(yīng)式為RCOOH+NaOH→RCOONa+H2O，故可根據(jù)消耗的NaOH溶液的量間接測(cè)定脂肪酶的活性[13-14]。測(cè)定單環(huán)刺螠腸道脂肪酶活力有助于研究與分析其腸道對(duì)不同食物來源中的脂肪的消化能力。

1.5.1 主要試劑的配制

0.025 M pH值7.5磷酸緩沖液、0.05 M 標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液、4%聚乙烯醇橄欖油乳化液、1% 酚酞。

4%聚乙烯醇橄欖油乳化液：稱取10 g聚乙烯醇顆粒（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，平均聚合度為1 750±50）放入500 mL燒杯中，加入250 mL蒸餾水，過夜溶脹，一邊加熱（80～90 ℃）一邊不停攪拌至完全溶解，最后用三層紗布過濾，濾液備用。量筒量取4%聚乙烯醇溶液150 mL，加入50 mL分析純橄欖油，用磁力攪拌器攪拌至呈乳白色，即為聚乙烯醇橄欖油乳化液，存于4 ℃冰箱內(nèi)待用（3天內(nèi)使用）。

1% 酚酞：稱取1 g酚酞粉末溶于60 mL無水乙醇中，完全轉(zhuǎn)移至100 mL容量瓶中并用無水乙醇定容至100 mL。

1.5.2 實(shí)驗(yàn)樣品的測(cè)定 取50 mL燒杯若干，分別為樣品對(duì)照組與樣品測(cè)定組，每組設(shè)兩個(gè)平行，結(jié)果用兩個(gè)平行的平均值表示，測(cè)定使用原始粗酶液，具體操作方法見表4。用0.05 M標(biāo)準(zhǔn)NaOH溶液滴定至微紅，并記錄使用的NaOH溶液的體積。

1.5.3 注意事項(xiàng) 在加入95%乙醇時(shí)要不停攪拌，否則會(huì)產(chǎn)生絮狀物影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果。加入95%乙醇是為了終止反應(yīng)停止酶作用和溶解脂肪酸，故在樣品測(cè)定組加入95%乙醇時(shí)要快速，以保證反應(yīng)時(shí)間相同。

2 結(jié)果與分析

2.1 蛋白酶活力

蛋白酶比活力單位定義：每毫克組織蛋白在37 ℃下每分鐘水解酪素而產(chǎn)生的1 μg酪氨酸為一個(gè)蛋白酶活力單位，單位為U/mg prot。

蛋白酶比活力（U/mg prot）=A20÷（取樣量×待測(cè)樣本蛋白濃度稀釋倍數(shù)）

式中：A表示根據(jù)樣品的吸光值通過回歸方程計(jì)算，得出的相應(yīng)酪氨酸的微克數(shù);20表示反應(yīng)時(shí)間為20 min;取樣量為酶反應(yīng)時(shí)所取的酶液的體積，本實(shí)驗(yàn)中酶液的使用量為1 mL;稀釋倍數(shù)是指反應(yīng)酶液相對(duì)于原始粗酶液的稀釋倍數(shù)，本實(shí)驗(yàn)中稀釋倍數(shù)為40倍[15]。

測(cè)定結(jié)果見表5，單環(huán)刺螠腸道蛋白酶活力為（29.350±2.592）U/mg prot。

2.2 淀粉酶活力

淀粉酶比活力單位定義：每毫克組織蛋白在37 ℃與底物作用30 min，水解10 mg淀粉，定義為1個(gè)淀粉酶活力單位，單位為U/mg prot。

淀粉酶比活力（U/mg prot）=（對(duì)照組OD值-測(cè)定組OD值對(duì)照組OD值×0.8×0.510×30 min7.5 min÷（取樣量×待測(cè)樣本蛋白濃度（mg prot/mL）稀釋倍數(shù)）

式中：0.8為1 mL 淀粉溶液中含有淀粉0.8 mg;0.5為反應(yīng)體系中加入淀粉溶液的體積0.5 mL;10表示是10 mg 淀粉;稀釋倍數(shù)是指反應(yīng)酶液相對(duì)于原始粗酶液的稀釋倍數(shù)，本實(shí)驗(yàn)中稀釋倍數(shù)為10倍。

測(cè)定結(jié)果見表6，單環(huán)刺螠幼體腸道淀粉酶活力為（10.600±0.844）U/mg prot。

2.3 脂肪酶活力

脂肪酶比活力單位定義：在pH值7.5與40 ℃條件下，每毫克組織蛋白每分鐘水解脂肪所產(chǎn)生1 μmol脂肪酸定義為一個(gè)脂肪酶活力單位，單位為U/mg prot[15]。

脂肪酶比活力（U/mg prot）=（樣品測(cè)定組NaOH溶液用量-樣品對(duì)照組NaOH溶液用量）×50t÷（取樣量×待測(cè)樣本蛋白濃度（mg prot/mL）稀釋倍數(shù)）

式中：（測(cè)定組NaOH溶液用量-對(duì)照組NaOH溶液用量）單位是 mL;50表示消耗0.05 mol/L 的NaOH 1 mL 相當(dāng)于反應(yīng)體系產(chǎn)生脂肪酸50 μmol（GB/T 23535-2009脂肪酶制劑）;t表示反應(yīng)時(shí)間，本實(shí)驗(yàn)中反應(yīng)時(shí)間為20 min;稀釋倍數(shù)是指反應(yīng)酶液相對(duì)于原始粗酶液的稀釋倍數(shù)，本實(shí)驗(yàn)中使用的是原始粗酶液，故稀釋倍數(shù)為1倍。

測(cè)定結(jié)果見表7，單環(huán)刺螠腸道脂肪酶活力為（5.266±0.224）U/mg prot。

3 分析與討論

消化酶是維持機(jī)體正常代謝的生命活性物質(zhì)，可以催化生物體內(nèi)各種生化反應(yīng)，從消化酶活性的大小可以得出機(jī)體對(duì)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收能力，根據(jù)其消化對(duì)象的不同，可以分為蛋白酶、脂肪酶和淀粉酶等幾種。消化酶活性的測(cè)定方法多種多樣，不同的研究人員，不同的實(shí)驗(yàn)條件往往所采用的標(biāo)準(zhǔn)及定義不同，而且不同的動(dòng)物都有其特異性。因此對(duì)于消化酶研究相對(duì)匱乏的單環(huán)刺螠，針對(duì)消化酶活性測(cè)定方法的詳細(xì)操作方法、注意事項(xiàng)的研究尤為重要。本實(shí)驗(yàn)所測(cè)定的單環(huán)刺螠幼體腸道蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活力，在反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、反應(yīng)pH值等反應(yīng)條件下都需要準(zhǔn)確把控，否則會(huì)對(duì)實(shí)驗(yàn)產(chǎn)生較大的影響[7，16]，同時(shí)需要仔細(xì)開展預(yù)實(shí)驗(yàn)摸索合適的取樣量，密切關(guān)注酶活測(cè)定過程中的注意事項(xiàng)，才能保證數(shù)據(jù)的可信性。

水產(chǎn)動(dòng)物消化酶活力受不同養(yǎng)殖環(huán)境條件如養(yǎng)殖溫度、鹽度、pH值的影響[7，17-19]，尤其是養(yǎng)殖環(huán)境溫度對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物消化酶活性影響最為明顯[17-19]。本實(shí)驗(yàn)中所用的單環(huán)刺螠幼體（平均體重（1.468±0.222）g）養(yǎng)殖條件為溫度15～18 ℃，鹽度28‰～30‰，pH為7.8～8.0，投喂飼料為配合飼料（粗蛋白質(zhì)含量為46.80%，粗脂肪含量為7.66%）。本實(shí)驗(yàn)測(cè)得單環(huán)刺螠幼體腸道蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活力分別為29.350±2.592、10.600±0.844、（5.266±0.224）U/mg prot。目前，對(duì)單環(huán)刺螠消化酶活性的研究很少。許星鴻等[7]研究了不同養(yǎng)殖條件（pH、溫度和鹽度）對(duì)單環(huán)刺螠成體（平均體重（71.2±8.5）g，投喂飼料為小球藻和中肋骨條藻）腸道蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活力的影響。許星鴻等[7]研究表明在養(yǎng)殖條件為溫度15 ℃，鹽度30 ‰，pH為8的情況下，單環(huán)刺螠成體腸道蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活力分別為4.42±0.31、16.10±1.08、（3.87±0.47）U/mg prot;養(yǎng)殖條件為溫度20 ℃，鹽度35 ‰，pH為8的情況下，單環(huán)刺螠成體腸道蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活力分別為17.34±1.25、13.38±0.39、（7.46±0.63）U/mg prot。雖然許星鴻等[7]研究中的養(yǎng)殖條件與本實(shí)驗(yàn)的養(yǎng)殖條件接近，酶活的測(cè)定方法也一致，但是由于飼料的成分對(duì)水產(chǎn)動(dòng)物消化酶活性有較大影響[20-22]，所以很難進(jìn)行單環(huán)刺螠幼體和成體腸道蛋白酶、消化酶、脂肪酶活性的比較。

隨著對(duì)單環(huán)刺螠腸道各類消化酶測(cè)定的相關(guān)研究不斷深入，對(duì)其消化酶活力的了解會(huì)越來越清晰，可以進(jìn)一步掌握單環(huán)刺螠對(duì)食物不同成分的消化吸收能力，為其天然飼料的選擇、人工飼料各類成分的配比和適宜養(yǎng)殖條件的確定提供理論基礎(chǔ)，使其不僅可以提高蛋白質(zhì)和淀粉的利用率，又可以減少糞便中的氮、磷排放量，這樣不僅充分利用飼料、節(jié)約資源，又能減輕水體污染，因此單環(huán)刺螠消化酶研究將有助于單環(huán)刺螠的規(guī)模化養(yǎng)殖。

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)詳細(xì)探究了單環(huán)刺螠幼體腸道蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶的測(cè)定方法、操作步驟、注意事項(xiàng)，為單環(huán)刺螠生物學(xué)及飼料開發(fā)研究中消化酶的測(cè)定提供基礎(chǔ)參考。在此實(shí)驗(yàn)方法的指導(dǎo)下測(cè)得投喂配合飼料的單環(huán)刺螠幼體（平均體重（1.468±0.222） g）腸道蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶活力分別為29.350±2.592、10.600±0.844、（5.266±0.224）U/mg prot。

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Abstract：The determination methods， operation steps and precautions for operation methods of intestinal protease， amylase and lipase activity in juvenile Urechis unicinctus （average weight （1.468 ± 0.222）g） were explored in detail. The intestinal protease， amylase and lipase activity in juvenile Urechis unicinctus was respectively determined by method of Folin-phenol， starch-iodine colorimetry and hydrolysis of polyvinyl alcohol emulsion of olive oil （titration of NaOH）. In order to determine the intestinal protease activity assay in juvenile Urechis unicinctus， the established regression equation of tyrosine was y = 15.487 x - 0.0923 （R2 = 0.999 2）. The intestinal protease activity in juvenile Urechis unicinctus was （29.350 ± 2.592）U/mg prot. The intestinal amylase activity was （10.600±0.844）U/mg prot with 0.08% starch solution as substrate. The intestinal lipase activity was （5.266±0.224）U/mg prot.

Key words：Urechis unicinctus; intestinal tract; protease; amylase; lipase; determination method