HPLC 指紋圖譜評價何首烏和制何首烏不同提取部位肝毒性

許曉麗任 晶翟文澤羅 蘭王淑美梁生旺陳 超

（1.廣東藥科大學，廣東 廣州510006； 2.國家中醫(yī)藥管理局中藥數(shù)字化質(zhì)量評價技術(shù)重點研究室，廣東廣州510006； 3.廣東高校中藥質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州510006； 4.廣東省中藥質(zhì)量工程技術(shù)研究中心，廣東 廣州510006）

毒理學研究表明，何首烏在正常動物水平需要在超大劑量（40～60 g／kg）、長期給藥（4～12 周）情況下才能引起大鼠肝損傷，與一般意義上的肝毒物明顯不同［1-5］；Chang 等［6］根據(jù)國家不良反應(yīng)中心的數(shù)據(jù)，以及302 醫(yī)院藥物性肝損傷臨床數(shù)據(jù)庫的統(tǒng)計，推測何首烏肝損傷的總體發(fā)病率較低，可能存在高危人群，并且其在正常動物安全性評價表現(xiàn)出了肝毒性不強的特點［7-8］，因此考慮何首烏肝損傷可能類似于特異質(zhì)肝損傷。微量的脂多糖（LPS）可以引起溫和無損傷的炎癥反應(yīng)，而不會發(fā)展為明顯的肝細胞毒性；但是伴隨著炎癥因子的釋放，破壞組織內(nèi)環(huán)境平衡，導致肝臟對藥物的敏感性大大增強，表現(xiàn)出藥物特異質(zhì)肝損傷。基于LPS 模型評價藥物的特異質(zhì)肝損傷已有較多文獻報道［9-10］。

2015 年版《中國藥典》 一部中共有乙肝寧顆粒、乙肝寧顆粒乙肝養(yǎng)陰活血顆粒、七寶美髯顆粒等59 例成方制劑和單味制劑配方中含有何首烏或制何首烏［5］。這59 例成方制劑和單味制劑在制備過程中，制首烏主要用到的提取溶劑有水及30%、50%、60%、65%、70%、75%、80% 乙醇；何首烏主要的提取溶劑有水、70% 乙醇、50% 乙醇。文獻研究［11］表明，在內(nèi)毒素特異質(zhì)模型上，生首烏1.08 g／kg劑量（相當于生首烏6 g／d 臨床劑量的2 倍等效劑量）可造成實驗大鼠肝功能損傷，制首烏8.64 g／kg 劑量（相當于制首烏12 g／kg 臨床劑量的8 倍等效劑量）對實驗大鼠肝功能造成損傷。本研究選用給藥量為生首烏3.24 g／kg（相當于生首烏6 g／d 臨床劑量的6 倍等效劑量），制何首烏12.96 g／kg（相當于制首烏12 g／d 臨床劑量的12 倍等效劑量），采用基于內(nèi)毒素（脂多糖）的特異質(zhì)肝損傷動物模型，以大鼠ALT、AST 水平為評價指標，對生首烏和制何首烏水、50% 乙醇、75% 乙醇3 個提取部位特異質(zhì)肝損傷進行評價研究。

1 材料

1.1 動物 雄性SD 大鼠，SPF 級，鼠齡6～7 周，體質(zhì)量（180±20）g，購于廣東省實驗動物中心［合格證號SYXK（粵）2012-0125］，分籠飼養(yǎng)，置于室溫（25±2）℃、相對濕度50%～60%的SPF 級屏蔽環(huán)境中，通風良好，環(huán)境安靜，給予滅菌動物維持飼料及飲用水，自由飲食，并定期用紫外燈光消毒。

1.2 試劑與藥物 何首烏飲片（采集于廣東省肇慶市德欽縣，加工于廣州健澤藥業(yè)有限公司）；制何首烏飲片（批號160627，廣州健澤藥業(yè)有限公司）。水合氯醛（批號20160606，天津市大茂化學試劑廠）；L2880 脂多糖（德國Sigma 公司）；0.9%氯化鈉液注射液（批號B16040503，山東華魯制藥有限公司）。肝素鈉一次性真空采血管（瀏陽市三力醫(yī)用科技發(fā)展有限公司）；一次性真空采血針（產(chǎn)品標準號YZB／國0411-2015，瀏陽市三力醫(yī)用科技發(fā)展有限公司）；一次性無菌注射器（浙江歐健醫(yī)用器材有限公司）。流動相（甲醇）為歐普森色譜純；乙醇為分析純；H3PO4為色譜純；水為超純水。

1.3 儀器 SIGMA2-16KL 低溫離心機（德國Sigma 公司）；7180 型全自動生化分析儀（日本日立株式會社）；E2695高效液相色譜儀（美國Waters 公司）；BP211D 型Sartorius AG 電子天平（十萬分之一，德國賽多利斯公司）；KQ-500E 超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；WP-UPWF-10 超純水機（四川沃特爾水設(shè)備處理有限公司）；YP502N 電子天平（上海精密科學儀器有限公司）。

2 方法

2.1 樣品制備 取飲片適量，粉碎，取適量粉末，加10倍量的提取溶劑，加熱回流1 h，共提取2 次，趁熱過濾，合并濾液，減壓濃縮回收盡乙醇，臨用前用蒸餾水配制成相應(yīng)濃度（按可比生藥量計算），給藥量為生首烏3.24 g／kg（相當于生首烏6 g／d 臨床劑量的6 倍等效劑量）、制何首烏12.96 g／kg（相當于生首烏12 g／d 臨床劑量的12 倍等效劑量）。

2.2 HPLC 指紋峰總面積測定

2.2.1 色譜條件 AQ-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇（A）-0.1% 磷酸（B），梯度洗脫（0～20 min，15%～30%A；20～35 min，30%～40%A；35～55 min，40%～75% A；55～75 min，75%～100% A）；體積流量0.8 mL／min；柱溫30 ℃；進樣量10 μL；檢測波長270 nm，記錄75 min。理論塔板數(shù)按2，3，5，4′-四羥基反式二苯乙烯-2-O-β-D-吡喃葡萄糖苷峰計算應(yīng)不低于2 000。

2.2.2 供試品溶液制備 取2.1”項下生首烏3 個提取部位（50%乙醇、75%乙醇、水）藥液，加入適量甲醇稀釋至20 mg／mL；另取制何首烏3 個提取部位（50% 乙醇、75%乙醇、水）藥液，加入適量甲醇稀釋至40 mg／mL，即得。

2.2.3 方法學考察

2.2.3.1 精密度試驗 取同一供試品溶液（50% 乙醇-生首烏），在“2.2.1”項色譜條件下進樣6 次。測得信噪比（S／N）大于10 的指紋峰總面積RSD＜3.0%，表明該儀器精密度良好。

2.2.3.2 穩(wěn)定性試驗 取同一供試品溶液（50% 乙醇-生首烏），分別于0、4、8、12、16、24 h 在“2.2.1”項色譜條件下進樣，測得信噪比（S／N）大于10 的指紋峰總面積RSD＜3.0%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.3.3 重復性試驗 平行制備生首烏飲片50%乙醇提取部位溶液5 份，在“2.2.1”項色譜條件下進樣，測得信噪比（S／N）大于10 的指紋峰總面積RSD＜3.0%，表明該方法重復性良好。

2.2.4 樣品測定 精密吸取供試品溶液10 μL，在“2.2.1”項色譜條件下進樣，得到不同提取部位的指紋峰峰面積，指紋圖譜見圖1，生首烏和制首烏3 個提取部位信噪比（S／N）大于10 的指紋峰總面積見表1。

表1 不同溶劑提取部位信噪比大于10 的指紋峰總面積（n＝2）

圖1 生、制何首烏不同提取溶劑部位HPLC 指紋圖譜

2.3 特異質(zhì)肝損傷評價

2.3.1 動物分組 將140 只SD 大鼠隨機分為14 組（n＝10）：空白組（組1）；模型組（組2）；單獨給藥組，包括50%乙醇-生首烏（組3），75%乙醇-生首烏（組4），水-生首烏（組5），50%乙醇-制首烏（組6），75%乙醇-制首烏（組7），水-制首烏（組8）；LPS 聯(lián)合給藥組，包括50%乙醇-生首烏（組9），75%乙醇-生首烏（組10），水-生首烏（組11），50% 乙醇-制首烏（組12），75% 乙醇-制首烏（組13），水-制首烏（組14）。

2.3.2 給藥方式 大鼠禁食不禁水12 h 后，稱定體質(zhì)量，單獨給藥組及LPS 聯(lián)合給藥組均灌胃給予不同提取部位藥液，空白組和LPS 模型組均灌胃給予等量蒸餾水，給藥1次，3 h 后LPS 模型組及LPS 聯(lián)合給藥組大鼠尾靜脈注射給予無毒劑量（2.8 mg／kg）LPS［12-13］。

2.3.3 標本采集 大鼠尾靜脈注射給予LPS 7 h 后，采用10% 水合氯醛麻醉，腹主動脈取血，3 500 r／min 離心10 min，取血漿。

2.3.4 血漿指標檢測 采用7180 型全自動生化分析儀檢測肝功能指標，包括谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST），谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）。

3 結(jié)果

3.1 一般情況觀察 單獨給藥組（組3～8）大鼠0.5～2 h內(nèi)均出現(xiàn)輕微腹瀉現(xiàn)象，尿液顏色加深；水提物組（組5、8）輕于醇提物組（組3、4、6、7）；尾靜脈注射脂多糖（LPS）后，LPS 模型組和LPS 聯(lián)合組（組9～14）在0.5～2 h 均出現(xiàn)排便量增多的現(xiàn)象，LPS 聯(lián)合生首烏和制首烏醇提物組（組9、10、12、13）重于LPS 聯(lián)合生首烏和制首烏水提物組（組11、14）。LPS 聯(lián)合給藥組中，生首烏和制首烏醇提物組（組9、10、12、13）大鼠大便稀溏、臭味重，精神呆滯，出現(xiàn)怠動、無力等癥狀；生首烏和制首烏水提物組（組11、14）也出現(xiàn)精神萎靡、便溏等癥狀，但相比醇提物組癥狀較輕。

3.2 對大鼠血漿ALT、AST 水平的影響

分別以空白組和模型組為參照，將各單獨給藥組及LPS 聯(lián)合各給藥組的ALT、AST 水平進行兩獨立樣本的非參數(shù)檢驗。各組測得值見表2，方差分析見表3。

表2 各組ALT、AST 水平（）

表2 各組ALT、AST 水平（）

表3 方差分析

與空白組比較，模型組大鼠的AST、ALT 水平差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），表明造模成功，可用于特異質(zhì)肝損傷評價。與空白組或模型組比較，單獨灌胃給藥生首烏和制何首烏組均對兩者差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；與空白組或模型組比較，LPS 聯(lián)合生首烏不同提取部位組及制何首烏不同提取部位組均對兩者差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

P1值為LPS 聯(lián)合給藥組各組ALT 水平，P2值為LPS聯(lián)合給藥組各組AST 水平，以P1、P2值為參考指標，兩者權(quán)重均為0.5，進行加權(quán)綜合評分，評價LPS 聯(lián)合給藥組不同組別間肝毒性大小，得分越高表明肝損傷越嚴重。P值隸屬度＝（指標值-指標最小值）／（指標最大值-指標最小值）。LPS 聯(lián)合生首烏不同部位，組9～11，結(jié)果見表4；LPS 聯(lián)合制首烏不同部位，組12～14，結(jié)果見表5。

表4 LPS 聯(lián)合生首烏不同部位的各組綜合評分

表5 LPS 聯(lián)合制首烏不同部位的各組綜合評分

4 討論

表1 表明，生首烏和制首烏3 個提取部位信噪比（S／N）大于10 指紋峰總面積由大到小依次為50% 乙醇、75%乙醇、水。表4～5 表明，LPS 聯(lián)合生首烏不同部位給藥組中各組肝損傷嚴重程度由重到輕依次為LPS＋50%乙醇-生首烏、LPS＋75% 乙醇-生首烏、LPS＋水-生首烏；LPS 聯(lián)合制首烏不同部位給藥組中各組肝損傷嚴重程度由重到輕依次為LPS＋50%乙醇-制首烏、LPS＋75%乙醇-制首烏、LPS＋水-制首烏。

相關(guān)研究推測，大黃素、大黃素甲醚、大黃素結(jié)合蒽醌、大黃素甲醚結(jié)合蒽醌為毒性關(guān)聯(lián)成分［14-15］；也有研究認為，何首烏肝損傷是二苯乙烯苷和大黃素協(xié)同作用的結(jié)果，并有課題組提出“中藥（何首烏）免疫應(yīng)激肝損害假說”［16］。中藥飲片成分復雜，其發(fā)揮功效具有多成分、多靶點協(xié)同作用的特點，HPLC 指紋圖譜能夠反應(yīng)多成分信息，可以更科學、更全面的反映樣品化學成分特征。有研究比較了不同溶劑提取何首烏對肝細胞毒性的差異［17］，發(fā)現(xiàn)50%乙醇提取物毒性最強，與前期所得50%提取部位毒性最大、HPLC 總峰面積也最大的結(jié)論相符，因此該部位能更好的體現(xiàn)毒性成分信息，但具體是哪類物質(zhì)尚不明確，還有待進一步研究。