鞣花酸對(duì)糖尿病小鼠胰腺炎的改善作用

古麗海夏哈勒瑪合拜田亞麗巴合提別克托合塔爾拜克毛旭文張 燕張龑之?

（1.新疆醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理教研室，新疆 烏魯木齊830011； 2.新疆醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院省部共建中亞高發(fā)病成因與防治國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，新疆 烏魯木齊830011； 3.烏魯木齊軍區(qū)總醫(yī)院，新疆 烏魯木齊830011）

2 型糖尿?。╰ype 2 diabetes mellitus，T2DM）是以糖脂代謝紊亂為特征的慢性炎癥性疾病，胰腺的炎癥在糖尿病的發(fā)生發(fā)展中扮有重要角色［1］。研究［2-4］顯示，硫氧還蛋白相互作用蛋白（TXNIP）介導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，引起NOD-樣受體蛋白3（NLRP3）炎癥小體激活，白細(xì)胞介素-1β（IL-1β）釋放和β 細(xì)胞凋亡。因此，胰腺TXNIP 蛋白可能是抗胰島β 細(xì)胞凋亡、保護(hù)胰腺的重要靶點(diǎn)。目前臨床常用治療藥物主要通過控制血糖延緩糖尿病并發(fā)癥的發(fā)生與發(fā)展，部分磺酰脲類降糖藥物長期應(yīng)用甚至引起胰島素分泌耗竭，因此胰腺保護(hù)作用的天然藥物發(fā)現(xiàn)成為研究熱點(diǎn)。

鞣花酸（Ellagic acid，EA）是一種天然多酚二內(nèi)酯，來源于葡萄、草莓、石榴等水果及堅(jiān)果。研究發(fā)現(xiàn)鞣花酸具有抗氧化、抗炎及抗癌等作用［5-6］，能減輕2 型糖尿病雌性大鼠肝臟氧化應(yīng)激和胰島素抵抗［7］。但EA 是否能通過TXNIP／NLRP3 信號(hào)通路抑制胰腺炎癥從而發(fā)揮胰腺保護(hù)作用不清楚。本研究以高脂飼料（HFD）聯(lián)合鏈脲佐菌素（STZ）誘導(dǎo)的2 型糖尿病模型小鼠為研究對(duì)象，在明確EA 具有減輕胰腺損傷作用的基礎(chǔ)上，探討EA 對(duì)胰腺炎癥的影響及機(jī)制，從而為EA 的臨床應(yīng)用開發(fā)提供藥理學(xué)依據(jù)。

1 材料

1.1 動(dòng)物 SPF 級(jí)純種C57BL／6 小鼠，雄性，體質(zhì)量23～25 g，購于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心［使用許可證號(hào)SYXK（新）2016-0002］。

1.2 藥物與試劑 鞣花酸購于上海麥克林生化科技有限公司（純度≥98%，批號(hào)C10393321）；STZ 購于美國Sigma公司（批號(hào)WXBC1125）；糖化血清蛋白（GSP）試劑盒（批號(hào)A037-2-1）、IL-10 試劑盒（批號(hào)H009）、IL-1β 試劑盒（批號(hào)H002）均購自上海貝博生物科技有限公司；NLRP3（貨號(hào)WL02635）、裂解的半胱氨酸天門冬酸蛋白酶3（cleaved-caspase3）（貨號(hào)WL02117）、IL-1β（貨號(hào)WL00891）抗體、羊抗兔IgG-HRP（貨號(hào)WLA023）購自沈陽萬類生物有限公司；TXNIP（貨號(hào)K0502-3）購自北京博爾邁生物技術(shù)有限公司；羊抗小鼠IgG-HRP（貨號(hào)HA1006）購自杭州華安生物技術(shù)有限公司。普通飼料購于新疆醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心；高脂飼料購于南通特羅菲飼料有限公司。

1.3 儀器 YP202 N 型電子天平（上海菁海儀器有限公司）；XS205DU 型分析天平、離心機(jī)（MULTIFUGE X3R）、酶標(biāo)儀（Multiskan GO 1.01.12）、LK20180069 型制冰機(jī)（常熟市菱科電器有限公司）、血糖儀（羅氏血糖儀活力型）。

2 方法

2.1 造模、分組 C57BL／6 小鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后用于實(shí)驗(yàn)，隨機(jī)分為正常組、模型組、鞣花酸組，每組10 只。正常組給予普通飼料喂養(yǎng)，造模小鼠給予高脂飼料喂養(yǎng)，6周后禁食不禁水12 h 后高脂飼養(yǎng)的動(dòng)物連續(xù)2 d 腹腔注射STZ（85 mg／kg）誘導(dǎo)糖尿病，正常組腹腔注射檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖液。2 d 后剪尾取血測(cè)血糖，以空腹血糖＞11.1 mmol／L為造模成功。

2.2 給藥 高脂飼喂6 周后連續(xù)2 d 腹腔注射STZ，造模成功后進(jìn)行鞣花酸干預(yù)8 周。正常組和模型組均灌胃給予蒸餾水（0.1 mL／10 g），鞣花酸組灌胃給藥，給藥劑量為50 mg ／kg，連續(xù)給藥8 周。

2.3 血糖檢測(cè) 第1、3、5、7 周末小鼠禁食不禁水6 h，稱定體質(zhì)量，測(cè)空腹血糖（FBG）。

2.4 血漿生化指標(biāo)檢測(cè) 鞣花酸干預(yù)8 周后，小鼠禁食不禁水 6 h，10% 水合氯醛麻醉小鼠，眼靜脈取血，3 000 r／min離心10 min 分離血漿，分裝，-80 ℃凍存?zhèn)溆?。按試劑盒說明書分別檢測(cè)血漿糖化血清蛋白（GSP）、IL-1β、IL-10 水平。

2.5 胰組織蛋白表達(dá)檢測(cè) 取血結(jié)束后，處死小鼠，立即取出胰組織，提取蛋白。將各組樣品加入12% 聚丙烯酰胺凝膠中電泳，80 V 恒壓電泳約125 min，待溴酚藍(lán)到達(dá)玻璃板底時(shí)，終止電泳，然后取出凝膠切下目的條帶區(qū)，轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上，加入5% 脫脂奶粉于37 ℃搖床下封閉2 h，加入一抗［TXNIP（1∶1 000），cleaved-caspase3（1∶400），NLRP3（1∶500），IL-1β（1∶500）β-actin（1∶1 000）］于4 ℃孵育過夜。次日TBST 洗膜3 次，5 min／次，加入二抗（1∶5 000）于37 ℃孵育2 h。于Image lab軟件分析蛋白條帶圖像。

2.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用SPSS 22.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以（）表示，符合正態(tài)分布和方差齊性采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD 檢驗(yàn)；不符合正態(tài)分布和方差齊性采用秩和檢驗(yàn)。以P≤0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

3 結(jié)果

3.1 鞣花酸對(duì)C57BL／6 糖尿病模型小鼠FBG 和GSP 的影響 與正常組比較，模型組小鼠FBG、血漿GSP 水平升高（P＜0.01）；鞣花酸干預(yù)后，小鼠FBG、，血漿GSP 水平較模型組降低（P＜0.05，P＜0.01）。見表1、圖1。

表1 鞣花酸對(duì)C57BL／6 糖尿病模型小鼠FBG 的影響（，mmol／L）

表1 鞣花酸對(duì)C57BL／6 糖尿病模型小鼠FBG 的影響（，mmol／L）

注：與正常組比較，?P＜0.05，??P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

3.2 鞣花酸對(duì)C57BL／6 糖尿病模型小鼠血漿炎癥因子的影響 與正常組比較，模型組小鼠血漿中IL-1β 水平升高（P＜0.01），IL-10 水平降低（P＜0.01）；與模型組比較，鞣花酸組小鼠血漿中IL-1β 水平降低（P＜0.05），IL-10 水平升高（P＜0.01）。見表2。

3.3 鞣花酸對(duì)C57BL／6 糖尿病模型小鼠胰組織凋亡蛋白表達(dá)的影響 與正常小鼠比較，模型組小鼠胰組織中cleaved-caspase 3 蛋白表達(dá)增加（P＜0.01）；與模型組比較，鞣花酸組小鼠胰組織中cleaved-caspase3 蛋白表達(dá)減少（P＜0.01）。見圖2。

圖1 EA 對(duì)C57BL／6 糖尿病模型小鼠糖化血清蛋白（GSP）的影響

表2 鞣花酸對(duì)C57BL／6 糖尿病模型小鼠血漿炎癥因子的影響（，pg／mL）

表2 鞣花酸對(duì)C57BL／6 糖尿病模型小鼠血漿炎癥因子的影響（，pg／mL）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

3.4 鞣花酸對(duì)C57BL／6 糖尿病模型小鼠胰組織TXNIP／NLRP3／IL-1β 蛋白表達(dá)的影響 與正常組比較，模型組小鼠胰組織中TXNIP、NLRP3、IL-1β 蛋白表達(dá)增加（P＜0.01）；與模型組比較，鞣花酸組小鼠胰腺組織中TXNIP、IL-1β 蛋白表達(dá)減少（P＜0.01），NLRP3 蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3。

圖2 鞣花酸對(duì)C57BL／6 糖尿病模型小鼠胰組織調(diào)亡蛋白表達(dá)的影響

圖3 鞣花酸對(duì)C57BL／6 糖尿病模型小鼠胰組織TXNIP、NLRP3 和IL-1β 蛋白表達(dá)的影響

4 討論

高糖誘導(dǎo)TXNIP 轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)上調(diào)，進(jìn)而激活NLRP3 炎癥小體，介導(dǎo)成熟的L-1β 的釋放，2 型糖尿病中TXNIP 蛋白的顯著上調(diào)介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激誘導(dǎo)胰島β 細(xì)胞凋亡［8］和胰島的功能下降［9］，使無活性的caspase3 變成裂解的caspase3。G.Leibowi 等［10］稱促凋亡因子TXNIP 為胰腺β 細(xì)胞糖毒的效應(yīng)器和2 型糖尿病發(fā)生的驅(qū)動(dòng)劑，下調(diào)TXNIP 不僅還能改善高血糖癥，而且還能阻止氧化應(yīng)激引起的胰腺損傷［11-12］。因此，TXNIP 可能成為治療糖尿病及其并發(fā)癥的重要靶點(diǎn)之一。

本研究結(jié)果表明，高脂聯(lián)合STZ 誘導(dǎo)的2 型糖尿病小鼠模型，血糖及血漿GSP 水平升高，炎癥因子水平紊亂，胰腺的促凋亡蛋白cleaved-cas3 表達(dá)顯著增加，TXNIP／NLRP3／IL-1β 信號(hào)通路激活，提示糖尿病的發(fā)生可能與TXNIP 介導(dǎo)的胰腺炎癥信號(hào)通路異常密切相關(guān)。EA 能降低糖尿病小鼠空腹血糖和血漿糖化血清蛋白水平，還能降低血漿促炎細(xì)胞因子IL-1β 水平，升高血漿抗炎細(xì)胞因子IL-10 水平，抑制胰腺細(xì)胞凋亡蛋白的表達(dá)，下調(diào)TXNIP 和IL-1β 蛋白表達(dá)。提示EA 對(duì)糖尿病小鼠胰腺的保護(hù)作用可能通過抑制TXNIP、IL-1β 介導(dǎo)的炎癥和凋亡，從而改善高糖脂及STZ 誘發(fā)的胰腺組織損傷。

綜上所述，鞣花酸可起到保護(hù)糖尿病小鼠胰腺的作用，其機(jī)制可能與抑制胰腺TXNIP／IL-1β 炎癥信號(hào)有關(guān)，本研究對(duì)富含鞣花多酚果蔬攝入的益處有新的啟示，為開發(fā)抗糖尿病胰腺損傷的天然藥物提供了新的理論基礎(chǔ)。