超聲輔助雙水相提取山藥皮總多酚工藝的優(yōu)化

邵圣娟胡學(xué)豪郭佳儀常西亮

（太原工業(yè)學(xué)院化學(xué)與化工系，山西 太原030008）

山藥又名薯蕷、懷山藥，作為藥食兩用的中藥材具有助消化、健脾胃、止泄痢、補(bǔ)中益氣之功效，其肉質(zhì)含有豐富的淀粉、多糖、蛋白質(zhì)、黃酮、尿囊素、皂苷等多種營(yíng)養(yǎng)成分［1］，而作為天然抗氧化劑的多酚類物質(zhì)大多分布于山藥皮中，表現(xiàn)為帶皮山藥抗氧化性優(yōu)于去皮山藥［2］。每年都會(huì)產(chǎn)生大量的山藥皮廢棄物，導(dǎo)致巨大資源浪費(fèi)，故對(duì)其合理利用需引起重視。

目前，植物多酚類物質(zhì)提取方法有水浴提?。?］、閃式提?。?］、超聲輔助提取［5］、超高壓提取等［6］，常用分離方法包括膜分離［7］、離子沉淀［8］、層析法［9］、雙水相萃?。?0］等，其中超聲輔助提取存在超聲物理效應(yīng)，具有提取時(shí)間短、能耗低、提取率高等優(yōu)點(diǎn)［11］；雙水相萃取是由水溶性聚合物-鹽、離子液體-鹽、低級(jí)醇-鹽等組成的互不相容的兩水相體系，依靠溶質(zhì)組分在兩相間的分配系數(shù)差異實(shí)現(xiàn)分離的萃取技術(shù)［12］，其中低級(jí)醇-鹽體系采用水溶性低級(jí)醇，與傳統(tǒng)聚合物-鹽體系相比溶劑沸點(diǎn)低，體系黏度、界面張力小，相際間傳質(zhì)速率快，同時(shí)避免了反萃取過(guò)程，具有提取率高、溶劑易回收、成本低、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用于中藥活性成分（如黃酮、多酚、色素、生物堿等）分離［13-17］，常用親水性小分子醇有乙醇、正丙醇、異丙醇，無(wú)機(jī)鹽有 K2HPO4、Na2HPO4、K2CO3等［18］。

張艷霞等［19］采用超聲輔助雙水相法提取石榴皮多酚，并通過(guò)響應(yīng)面分析研究各因素及其交互作用對(duì)該成分得率的影響，經(jīng)驗(yàn)證最佳條件下其值為10.63%，表明提取方法可行。因此，本實(shí)驗(yàn)采用超聲波輔助雙水相法提取山藥皮總多酚，并通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化提取工藝，以期為該資源開(kāi)發(fā)利用提供依據(jù)。

1 材料

1.1 試劑與藥物 山藥皮由太原工業(yè)學(xué)院餐廳提供，烘干粉碎后過(guò)60 目篩，干燥保存?zhèn)溆谩Ａ蛩徜@、無(wú)水碳酸鈉、無(wú)水乙醇、福林酚試劑均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；沒(méi)食子酸對(duì)照品購(gòu)自成都曼思特生物科技有限公司。

1.2 儀器 XH-2008DE 超聲波萃取儀（北京祥鵠科技發(fā)展有限公司）；RE-52B 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHZ-DⅢ循環(huán)水式真空泵（鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司）；TY-800 中藥多功能粉碎機(jī)（永康市敏業(yè)工貿(mào)有限公司）；DHG-9101 干燥箱（金壇市榮華儀器制造有限公司）；723N 可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海精密科學(xué)儀器有限公司）。

2 方法

2.1 總多酚含有量測(cè)定

2.1.1 線性關(guān)系考察［19］采用福林酚法測(cè)定總多酚含有量。吸取1.50 g／L 沒(méi)食子酸對(duì)照品溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL，蒸餾水分別稀釋成0、75、150、225、300、375 mg／L，分別移取1 mL 至10 mL 量瓶中，加入0.1 mol／mL福林酚試劑1 mL，搖勻，靜置5 min，再加入7.5% Na2CO3溶液5 mL，蒸餾水定容至刻度，室溫下避光放置2 h，以空白試劑為對(duì)照，在765 nm 波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度。以吸光度（A）對(duì)沒(méi)食子酸質(zhì)量濃度（X）進(jìn)行回歸，得方程為A＝0.017 2X＋0.019 8（R2＝0.998），在0～45.000 μg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.2 測(cè)定步驟 稱取2.0 g 山藥皮干粉于三口燒瓶中，加入一定比例乙醇-硫酸銨雙水相體系，在適宜條件下進(jìn)行超聲輔助提取，粗提液真空抽濾，濾液靜置分層后取上清液，按“2.1.1”項(xiàng)下方法測(cè)定吸光度，計(jì)算總多酚含有量，進(jìn)而求出得率Y，公式為Y＝，其中c為總多酚含有量，V為上層提取液總體積，n為稀釋倍數(shù)（10 倍），m為山藥皮干粉質(zhì)量。

2.2 超聲輔助雙水相提取工藝

2.2.1 乙醇-硫酸銨雙水相體系建立 常溫下配制一定質(zhì)量濃度硫酸銨溶液，采用濁點(diǎn)滴定法［20］逐滴加入無(wú)水乙醇，使體系呈現(xiàn)渾濁，記錄此時(shí)乙醇體積及體系總體積，再滴加去離子水使其轉(zhuǎn)澄清，記錄此時(shí)體系總體積，然后繼續(xù)滴加無(wú)水乙醇至再次發(fā)生渾濁，反復(fù)上述操作，計(jì)算各個(gè)濁點(diǎn)下乙醇體積分?jǐn)?shù)和硫酸銨質(zhì)量濃度。以溶液質(zhì)量濃度為縱坐標(biāo)，乙醇體積分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)繪制雙水相體系相圖，以此確定其穩(wěn)定的范圍。

2.2.2 單因素試驗(yàn) 稱取2 g 山藥皮干粉于三口燒瓶中，加入雙水相體系（乙醇體積分?jǐn)?shù)20%～60%，硫酸銨質(zhì)量濃度0.1～0.3 g／mL），液料比20∶1～40∶1，設(shè)定儲(chǔ)液槽溫度40 ℃，超聲功率400～800 W，超聲時(shí)間10～50 min，進(jìn)行超聲輔助提取。將所得粗提液按“2.1”項(xiàng)下方法操作，考察乙醇體積分?jǐn)?shù)、硫酸銨質(zhì)量濃度、液料比、超聲功率、超聲時(shí)間對(duì)總多酚得率的影響。

2.2.3 響應(yīng)面分析 收集上清液，蒸發(fā)濃縮，由于硫酸銨不溶于甲醇，故將其濃縮結(jié)晶物溶于甲醇中抽濾，濾液蒸發(fā)濃縮干燥，即得總多酚提取物?；趩我蛩卦囼?yàn)結(jié)果，選擇硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)（A）、液料比（B）、超聲功率（C）作為影響因素，設(shè)計(jì)三因素三水平試驗(yàn)，結(jié)合響應(yīng)面分析確定最優(yōu)提取工藝，因素水平見(jiàn)表1。

表1 因素水平

3 結(jié)果

3.1 乙醇-硫酸銨雙水相相圖 見(jiàn)圖1。其中，ABC 曲線為雙水相體系的雙節(jié)線，曲線下方為單相區(qū)，曲線為成相臨界點(diǎn)，上方為兩相區(qū)；AC 為系線，線上各點(diǎn)成相相比服從杠桿規(guī)則，由此可認(rèn)為當(dāng)硫酸銨質(zhì)量濃度為0.3 g／mL 時(shí)，乙醇體積分?jǐn)?shù)為25%～50%，可與其形成穩(wěn)定的雙水相體系，與文獻(xiàn)［21］報(bào)道基本一致。

圖1 乙醇-硫酸銨雙水相相圖

3.2 單因素試驗(yàn)

3.2.1 雙水相體系組成 固定硫酸銨質(zhì)量濃度為0.3 g／mL，考察與其成穩(wěn)定雙水相的乙醇體積分?jǐn)?shù)30%、40%、50%對(duì)總多酚得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2A。由此可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為30% 時(shí)，總多酚得率較低，僅為1.5 mg／g；隨著其體積分?jǐn)?shù)升高，可與硫酸銨形成良好的雙水相體系，而且上相體積加大時(shí)得率升高，在40%、50%時(shí)接近3.8 mg／g，同時(shí)后者略有下降。考慮到溶劑消耗量和提取率，確定乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%。

固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為40% 時(shí)，考察硫酸銨質(zhì)量濃度0.15～0.35 g／mL 對(duì)總多酚得率的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2B。由此可知，當(dāng)硫酸銨質(zhì)量濃度為0.15 g／mL 時(shí)，雙水相分相不明顯，體系不穩(wěn)定；隨著其質(zhì)量濃度升高，可逐漸形成穩(wěn)定的雙水相體系，從而增加總多酚得率，在0.25 g／mL時(shí)最高；但其質(zhì)量濃度繼續(xù)升高時(shí)得率反而下降，其原因是隨著硫酸銨用量增加，下相水合能力加強(qiáng)而體積加大，同時(shí)上相體積減小，所含乙醇相對(duì)體積分?jǐn)?shù)、對(duì)總多酚的分配系數(shù)增大，提取率升高［22］，但當(dāng)其用量繼續(xù)升高時(shí)，雙水相體系極性增大，使多酚及水溶性雜質(zhì)主要存在于下相，導(dǎo)致得率降低，而且靜置分層時(shí)易出現(xiàn)冷卻結(jié)晶現(xiàn)象。因此，確定硫酸銨質(zhì)量濃度為0.20～0.30 g／mL。

圖2 硫酸銨質(zhì)量濃度（A）、乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）對(duì)總多酚得率的影響

3.2.2 提取條件 圖3A 顯示，總多酚得率隨著液料比增加而升高，其原因是隨著溶劑用量增大，溶劑對(duì)有效組分的溶解能力加強(qiáng)，且液固間濃度差越大，傳質(zhì)速率越快，有利于多酚向溶劑中擴(kuò)散；當(dāng)液料比大于25∶1 時(shí)，得率增速變緩，在4 mg／g 左右，并且此時(shí)山藥皮中大量雜質(zhì)也會(huì)相繼溶出，不利于多酚純化?？紤]到經(jīng)濟(jì)性，確定液料比范圍為20∶1～30∶1。

圖3 液料比（A）、超聲功率（B）、超聲時(shí)間（C）對(duì)總多酚得率的影響

圖3B 顯示，總多酚得率隨超聲功率升高呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢(shì)，在600 W 時(shí)最高，主要是因?yàn)槌暪β瘦^低時(shí)超聲波對(duì)于細(xì)胞壁的破壞作用較小，溶劑穿透力差，并且溶質(zhì)分子熱運(yùn)動(dòng)慢，從而降低了多酚浸出率；隨著其逐漸增大，分子熱運(yùn)動(dòng)逐漸加劇，從而提高了提取率；超過(guò)600 W 時(shí)，可能會(huì)引起多酚分解［23］，導(dǎo)致提取率降低。因此，確定超聲功率范圍為500～700 W。

圖3C 顯示，在一定范圍內(nèi)總多酚得率隨著超聲時(shí)間延長(zhǎng)基本變化不大；超過(guò)40 min 后得率略有下降，但基本維持在3.8 mg／g，可能與控溫條件下存在超聲波衰減形成超聲空白有關(guān)［24］。在不同超聲時(shí)間作用下，各粗提液上相體積無(wú)明顯變化，質(zhì)量濃度相近，總多酚得率穩(wěn)定，可見(jiàn)超聲時(shí)間對(duì)其影響較小，故確定超聲時(shí)間為20 min。

3.3 響應(yīng)面分析 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)40%、超聲時(shí)間20 min，以硫酸銨質(zhì)量濃度（A）、液料比（B）、超聲功率（C）為影響因素，總多酚得率（Y）為評(píng)價(jià)指標(biāo)進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

通過(guò)Design-Expert 8.0.5b 軟件對(duì)表2 數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸分析，得方程為Y＝3.98＋0.17A＋0.39B＋0.037C＋0.037AC-0.042BC-0.21A2-0.33B2-0.25C2，方差見(jiàn)表3。由此可知，模型P＜0.000 1，而失擬項(xiàng)P＞0.05，表明模型合理；相關(guān)系數(shù)R2＝0.997＞0.9，＝0.993，表明模型擬合度良好；＝0.98，表明模型預(yù)測(cè)性良好；因素A、B、C、A2、B2、C2、BC、AC影響明顯（P＜0.05），各因素影響程度依次為液料比（B）＞硫酸銨質(zhì)量濃度（A）＞超聲功率（C）。

根據(jù)方差分析結(jié)果進(jìn)行響應(yīng)面分析［25］，結(jié)果見(jiàn)圖4。最優(yōu)工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，硫酸銨質(zhì)量濃度0.27 g／mL，液料比28.01∶1，超聲功率605.68 W，超聲時(shí)間20 min，總多酚得率為4.136 mg／g，根據(jù)實(shí)際情況將其修正為乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，硫酸銨質(zhì)量濃度0.27 g／mL，液料比28∶1，超聲功率605 W，超聲時(shí)間20 min。在此條件下進(jìn)行3 批驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得總多酚得率分別為4.14、4.12、4.18 mg／g，平均4.147 mg／g（RSD＝0.74%），與預(yù)測(cè)值4.136 mg／g 偏差率為0.26%，表明模型預(yù)測(cè)性良好。將粗提液濃縮，結(jié)晶物溶于甲醇后抽濾，蒸發(fā)濃縮干燥，測(cè)得總多酚提取物質(zhì)量分?jǐn)?shù)可達(dá)57%。

表3 方差分析

圖4 各因素響應(yīng)面圖

4 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)采用超聲波輔助乙醇-硫酸銨雙水相體系提取山藥皮總多酚，再采用單因素試驗(yàn)考察各因素對(duì)其得率的影響趨勢(shì)，確定雙水相體系乙醇體積分?jǐn)?shù)為40%，超聲時(shí)間為20 min。在此基礎(chǔ)上，通過(guò)響應(yīng)面法發(fā)現(xiàn)各因素影響程度依次為液料比＞硫酸銨質(zhì)量濃度＞超聲功率，最優(yōu)工藝為乙醇體積分?jǐn)?shù)40%，硫酸銨質(zhì)量濃度0.27 g／mL，液料比28∶1，超聲功率605 W，超聲時(shí)間20 min，總多酚得率為4.147 mg／g，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為57%，與超高壓輔助提取所得結(jié)果相當(dāng)［24］。綜上所述，該方法采用低級(jí)醇-鹽雙水相體系提取，有機(jī)溶劑用量少，提取時(shí)間短，能耗低，產(chǎn)品質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，可有效用于山藥皮總多酚的提取純化。