參芩凝膠提取工藝的優(yōu)化

張建軍李潔環(huán)黃雪君李智勇

（廣東省第二中醫(yī)院，廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室，廣東 廣州510095）

濕疹是一種由多種復雜內、外因素引起的表皮及真皮淺層的炎癥性皮膚病，臨床上大多表現為皮損多形性、對稱分布、劇烈瘙癢、有滲出傾向、反復發(fā)作、易成慢性等［1-2］。中醫(yī)將濕疹歸屬于“濕瘡”“浸淫瘡”范疇，認為其基本病機為稟賦不足，加之濕熱內蘊，外感風、濕、熱邪，內外合邪，浸淫肌膚而成，臨床上常采用清熱、涼血、祛風、利濕等方法治療［3-4］。

參芩方為廣東省第二中醫(yī)院臨床有效驗方，由苦參、黃柏、黃芩、徐長卿等藥材組成，具有清熱燥濕、解毒止癢的功效，主要用于濕疹的亞急性期和慢性期反復發(fā)作，現將其開發(fā)成凝膠劑。為了保證該制劑質量和臨床療效，本實驗考察3 種提取路線對小鼠接觸性濕疹模型的影響，然后對其進行優(yōu)化以得到最佳工藝。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1200 高效液相色譜儀（美國Agilent 公司）；JJ500 型電子天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；TLE204 電子分析天平、S210 PH 計（瑞士梅特勒-托利多公司）；旋轉蒸發(fā)儀（德國Heidolph 公司）；DC-NSG-30 多功能提取罐（上海達程實驗設備有限公司）；KQ-300DE 數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；JP-300A 高速多功能粉碎機（永康市久品工貿有限公司）；LXJ-11B 低速大容量多管離心機（上海安亭科學儀器廠）。

1.2 試劑與藥物 糠酸莫米松凝膠（批號120702，江西三九藥業(yè)有限公司）。鹽酸小檗堿（批號110713-201212，純度 86.7%）、丹皮酚（批號 110708-201407，純度99.9%）對照品均購自中國食品藥品檢定研究院?？鄥⒌戎兴庯嬈徸詮V州市中芝源中藥有限公司，經廣東省中醫(yī)藥工程技術研究院王洛臨主任中藥師鑒定為正品，均符合2015 年版《中國藥典》一部相關要求。乙腈、甲醇、磷酸為色譜純；乙醇、鹽酸等為分析純；水為屈臣氏蒸餾水。

1.3 動物 SPF 級NIH 小鼠，雌雄各半，體質量18～22 g，由廣東省醫(yī)學實驗動物中心提供，實驗動物生產許可證號SCXK（粵）2013-0002，實驗動物質量合格證號4407206675，飼養(yǎng)于廣東省中醫(yī)藥工程技術研究院SPF 級動物實驗室，設施使用許可證號SYXK（粵）2015-0059。

2 方法

2.1 提取工藝確定

2.1.1 樣品制備

工藝一：徐長卿水蒸餾提取丹皮酚，藥渣與其余飲片水煎煮提取，提取液備用。

工藝二：徐長卿水蒸餾提取丹皮酚，藥渣與其余飲片水煎煮提取，提取液濃縮至適量，70% 乙醇醇沉，取上清液，備用。

工藝三：全方以50%乙醇滲漉提取，滲漉液備用。

3 種工藝所得提取液濃縮至適量濃度，以卡波姆為基質，分別制備成每1 g 相當于0.22、0.11 g 飲片的凝膠，作為高、低劑量樣品。另外，往450 mL 純化水中加入5 g卡波姆，再加入純化水至500 g，混勻，作為空白樣品。

2.1.2 樣品對小鼠接觸性濕疹模型的影響 參芩凝膠涂藥量基本在0.05～0.1 g／cm2范圍內，預試驗發(fā)現每1 cm2動物皮膚涂敷0.025、0.05、0.1 g 凝膠4 h 后無殘留，而0.2、0.4 g 有殘留。結合臨床實際，選取0.05 g／cm2作為用藥量。

取90 只小鼠，雌雄各半，隨機分為正常組，模型組，糠酸莫米松凝膠組，參芩凝膠工藝1 高、低劑量組，工藝2 高、低劑量組，工藝3 高、低劑量組。實驗前一天小鼠背部去毛，面積約2 cm×2 cm，各組（除正常組外）于去毛區(qū)涂以7%DNCB 液（丙酮-花生油比為4∶1）100 μL 致敏1 次，小鼠對應皮膚用藥面積為1 cm×1 cm，劑量為0.05 g／cm2。正常組、模型組小鼠在脫毛區(qū)涂抹等量凝膠基質（不含藥物），涂藥部位敷上無刺激性紗布，醫(yī)用膠布上下各繞一圈固定，再用3.5 cm×12 cm 背靠背粘膠帶繞圈固定整個涂藥區(qū)以使藥物與皮膚接觸良好，每天涂敷固定藥物4 h 后去除藥物，溫水洗凈去毛區(qū)皮膚，每天1 次，連續(xù)用藥11 d。第6 天后各組（除正常組外）小鼠涂以1% DNCB 丙酮溶液10 μL 于右耳內側激發(fā)，每隔2 d 激發(fā)1 次，于第3 次激發(fā)后24 h 處死小鼠，耳廓打耳器取下直徑8 mm 的左右耳片，在分析天平上稱量，以兩耳質量差為接觸性濕疹反應值，計算抑制率，公式為抑制率＝。

2.1.3 統(tǒng)計學分析 通過SPSS 15.0 軟件進行處理，計量資料以（）表示；多組間均數比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）；組間均數兩兩比較方差齊時采用SNK法，不齊時采用Dunnett’s T3 法。P＜0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

2.1.4 工藝篩選 表1 顯示，與正常組比較，模型組小鼠接觸性濕疹反應值升高（P＜0.01）；與模型組比較，不同提取工藝組反應值降低（P＜0.05，P＜0.01），程度依次為工藝3 組＞工藝2 組＞工藝1 組，故選擇工藝3 作為提取路線，即以乙醇為溶劑，采用滲漉法進行提取。

表1 提取工藝對小鼠接觸性濕疹模型的影響（， n＝10）

表1 提取工藝對小鼠接觸性濕疹模型的影響（， n＝10）

注：與正常組比較，??P＜0.01；與模型組比較，＃P＜0.05，＃＃P＜0.01。

2.2 提取工藝優(yōu)化 采用單因素試驗，以小檗堿、丹皮酚含有量及固形物質量為評價指標，對飲片粒度、滲漉溶劑、浸漬時間、滲漉速度、滲漉液收集量進行考察。

2.2.1 小檗堿、丹皮酚含有量測定

2.2.1.1 色譜條件 小檗堿：Eclipse-XDB-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相乙腈-0.05 moL／L 磷酸二氫鉀溶液（50∶50）（每100 mL 中加入0.4 g 十二烷基硫酸鈉，磷酸調節(jié)pH 至4.0）；檢測波長345 nm；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃。

丹皮酚：Kromasil-C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動相甲醇-水（45∶55）；檢測波長274 nm；體積流量1.0 mL／min；柱溫30 ℃。

2.2.1.2 對照品溶液制備 精密稱取對照品適量，加甲醇分別制成含95.6 μg／mL 鹽酸小檗堿、68.3 μg／mL 丹皮酚的溶液，即得。

2.2.1.3 供試品溶液制備 按照2015 年版《中國藥典》方法進行滲漉，精密稱取適量滲漉液置于25 mL 量瓶中，無水乙醇定容至刻度，搖勻，過0.45 μm 微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得小檗堿供試品溶液。同法制備丹皮酚供試品溶液。

2.2.1.4 陰性樣品溶液制備 分別稱取缺黃柏、徐長卿陰性樣品，按照2015 年版《中國藥典》 方法進行滲漉，收集滲漉液，按“2.2.1.3”項下方法制備，即得。見圖1～2。

2.2.1.5 線性關系考察 分別精密吸取鹽酸小檗堿、丹皮酚對照品溶液1、2、4、6、8、10 μL，在“2.2.1.1”項色譜條件下進樣測定，以進樣量為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）進行回歸，得方程分別為Y＝3.738 0X-5.658 2（r＝0.999 9）、Y＝5.480 5X-7.642 4（r＝0.999 9），表明鹽酸小檗堿、丹皮酚分別在95.6～956、68.3～683 ng 范圍內線性關系良好。

2.2.1.6 專屬性考察 吸取對照品、供試品、陰性樣品溶液適量，在“2.2.1.1”項色譜條件下進樣測定，結果見圖1～2，可知陰性無干擾，方法專屬性良好。

2.2.2 固形物質量測定 精密吸取各樣品上清液25 mL，置于已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干后于105 ℃烘箱中干燥至恒重，置于干燥器中放冷，精密稱定，計算固形物質量。

2.2.3 層次分析法確定權重系數［5-6］根據參芩凝膠處方中君臣佐使配伍及各成分藥理作用強弱，確定各權重指標次序為小檗堿含有量＞丹皮酚含有量＞固形物質量，構建成對比較的判斷優(yōu)先矩陣，賦予各項指標間相對評分，計算初始權重系數、歸一化權重系數，并進行一致性檢驗以判斷權重系數有效性。優(yōu)先矩陣見表2。

表2 判斷優(yōu)先矩陣

圖1 鹽酸小檗堿HPLC 色譜圖

圖2 丹皮酚HPLC 色譜圖

2.2.4 飲片粉碎粒度考察 取苦參、黃柏、徐長卿等飲片，粉碎機粉碎后按2015 年版《中國藥典》 要求用不同孔徑篩網篩取粉末，得到實驗用最粗、粗、中粉，按處方比例混合均勻，各取324 g，加入適量50%乙醇濕潤后進行滲漉，收集2 590 mL 滲漉液，回收乙醇至1 000 mL，按“2.2.1”和“2.2.2”項下方法分別平行處理3 份供試品溶液和固形物，測定小檗堿、丹皮酚含有量和固形物質量，計算綜合評分，公式如下，結果見表3。由此可知，3 個規(guī)格飲片滲漉后綜合評分無明顯差異，綜合考慮后選擇最粗粉作為飲片粉碎粒度。

表3 飲片粒度考察結果

2.2.5 滲漉溶劑考察 按處方比例稱取最粗粉4 份，每份108 g，置于1 000 mL 量瓶中，加入30%、50%、70%、90%乙醇定容，置于搖床中低速振搖24 h，靜置，取上清液，按“2.2.1”和“2.2.2”項下方法分別平行處理3 份供試品溶液和固形物，測定小檗堿、丹皮酚含有量及固形物質量，計算綜合評分，結果見表4。由此可知，以50%乙醇為提取溶劑時綜合評分達97.66，與70% 乙醇無明顯差異，綜合考慮后選擇50%乙醇作為滲漉溶劑。

表4 滲漉溶劑考察結果

2.2.6 浸漬時間考察 按處方比例稱取最粗粉3 份，每份108 g，置于1 000 mL 量瓶中，加入50%乙醇定容，置于搖床中低速振搖12、18、24 h，靜置，取上清液，按“2.2.1”和“2.2.2”項下方法分別平行處理3 份供試品溶液和固形物，測定小檗堿、丹皮酚含有量及固形物質量，計算綜合評分，結果見表5。由此可知，振搖18、24 h時綜合評分無明顯差異，但考慮到實際生產中飲片量大，而且是靜態(tài)浸漬，綜合考慮后選擇24 h 作為浸漬時間。

表5 浸漬時間考察結果

2.2.7 滲漉體積流量考察 按處方比例稱取最粗粉5 份，每份 324 g，溶劑 50% 乙醇，以 1、2、3、4、5 mL／（min·kg）體積流量進行滲漉，收集2 590 mL 滲漉液，按“2.2.1”和“2.2.2”項下方法分別平行處理3 份供試品溶液和固形物，測定小檗堿、丹皮酚含有量及固形物質量，計算綜合評分，結果見表6。由此可知，1～3 mL／（min·kg）滲漉時綜合評分大于93，綜合考慮后選擇其作為滲漉體積流量。

表6 滲漉體積流量考察結果

2.2.8 滲漉液收集量考察 按處方比例稱取最粗粉共324 g，以50%乙醇為溶劑進行滲漉，每收集648 mL（2 倍飲片量體積）滲漉液，按“2.2.1”和“2.2.2”項下方法分別平行處理3 份供試品溶液和固形物，測定小檗堿、丹皮酚含有量及固形物質量，計算綜合評分，結果見表7。由此可知，隨著滲漉液收集量增加，丹皮酚、小檗堿提取率逐漸升高，其中8 倍量時綜合評分已接近最大值100，綜合考慮后選擇其作為滲漉液收集量。

表7 滲漉液收集倍量考察結果

2.2.9 驗證試驗 按處方比例稱取最粗粉共3 份，每份324 g，加入50% 乙醇486 mL 濕潤后浸漬24 h，以1～3 mL／（min·kg）體積流量進行滲漉，收集2 592 mL 滲漉液，按“2.2.1”和“2.2.2”項下方法分別平行處理3 份供試品溶液和固形物，測定小檗堿、丹皮酚含有量及固形物質量，計算綜合評分，結果見表8。由此可知，小檗堿、丹皮酚平均提取率分別為83.44%、84.29%，滲漉工藝穩(wěn)定可行。

表8 驗證試驗結果（n＝3）

3 討論

近年來，通過藥效學來指導提取工藝篩選已成為中藥制劑工藝研究的一個方向［7-9］。參芩凝膠主要有效物質為揮發(fā)性成分（丹皮酚）、生物堿（小檗堿、苦參堿、氧化苦參堿）、苷類等，前期報道［10-12］，黃柏中小檗堿可用水或50%～70%乙醇提取，氧化苦參堿最佳提取方法為滲漉法，丹皮酚可用70%～80%乙醇滲漉提取，故可采用水蒸氣蒸餾法或醇滲漉法提取揮發(fā)性成分，水提醇沉法或水醇滲漉法提取其他成分。綜合考慮，本實驗擬定了3 種參芩凝膠提取路線，并建立小鼠接觸性濕疹模型考察其對小鼠接觸性濕疹的抑制程度，在藥效學指導下進行篩選，為該制劑后續(xù)質量控制、臨床療效研究提供了保障和實驗依據。

層次分析法是一種解決在多指標評價過程中，將評價指標進行定性與定量相結合的層次權重分析方法，該方法通過數理運算來使主觀判斷轉化為量化分析，將其應用于提取工藝篩選時能更加客觀、科學、合理地反映指標層對實驗結果的影響?；谥兴幎嘀笜?、多靶點的作用特點，本實驗以小檗堿、丹皮酚含有量及固形物質量為評價指標，采用層次分析法中的定量計算以賦予各指標成分相應權重系數，避免了經驗賦值帶來的盲目性和隨意性，使結果更科學可靠。