加熱時(shí)間對余甘子水煎液中沒食子酸的影響

吳佳欣 周 波鄧萌萌陳 敏 潘曉鵑?

（1.西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川 瀘州646000； 2.四川省中醫(yī)藥科學(xué)院，四川成都610041； 3.重慶市中藥研究院，重慶404100）

余甘子收載于2015 年版《中國藥典》一部，性甘、酸、澀，涼，具有清熱涼血，消食健胃、生津止咳的功效［1］。其為大戟科葉下珠屬植物余甘子Phyllanthus emblicaL.的干燥成熟果實(shí)［2］，廣泛分布于熱帶、亞熱帶地區(qū)，在我國主要分布于云南、四川、福建、廣西等地。余甘子主要活性成分為鞣質(zhì)、黃酮、維生素C 和多糖等［2］，藥理研究表明，其具有抗氧化［3-5］、抗菌［6-8］、抗炎［9-11］、抗誘變［12］、抗腫瘤［12-16］、增強(qiáng)免疫力［16-18］、降血糖［19-22］等作用，已成為聯(lián)合國衛(wèi)生組織在全世界推廣種植的保健植物［23］，在我國將其作為藥食兩用植物。

實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)余甘子水提物中沒食子酸轉(zhuǎn)移率超過100%，可高達(dá)300%，若干次實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了這個(gè)結(jié)果并非實(shí)驗(yàn)誤差造成。為保障藥物有效性、安全性，對余甘子水煎工藝過程進(jìn)行探索性研究具有重要意義。本研究以余甘子藥材為原料，設(shè)定不同時(shí)間進(jìn)行水煎實(shí)驗(yàn)，采用HPLC 法測定各水煎液的沒食子酸含有量并對其成分進(jìn)行對比分析，以期弄清成分變化的原因及規(guī)律。

1 材料

1260 系列高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；3K15 型高速冷凍離心機(jī)（美國Sigma 公司）；MS 205 DU 型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；Milli-Q Integral-3 型純水／超純水一體化系統(tǒng)（成都寶賽思科技有限公司）。沒食子酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)110831-201605，純度90.8%）；單寧酸、柯里拉京、鞣花酸對照品（成都德思特生物技術(shù)有限公司，批號(hào)分別為1401-55-4，23094-69-1，476-66-4，純度≥98%）。

余甘子藥材（云南，批號(hào)20171121）購于成都荷花池中藥材市場，按2015 年版《中國藥典》（一部）余甘子項(xiàng)下含有量測定得沒食子酸含有量1.62%，經(jīng)四川省中醫(yī)藥科學(xué)院中藥資源與種植研究所方清茂研究員鑒定為大戟科植物余甘子Phyllanthus emblicaL.的干燥成熟果實(shí)；實(shí)驗(yàn)用水為超純水，HPLC 用甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 水煎樣品制備 取余甘子藥材粗粉11 份，每份40 g，分別置于圓底燒瓶內(nèi)，加水400 mL，稱定質(zhì)量，分別于100 ℃水浴回流1、2、3、4、8、12、24、36、48、72、96 h，回流結(jié)束后于冰浴中迅速冷卻，補(bǔ)足減失質(zhì)量，于5 000 r／min 離心10 min，取上清液即可，獲得不同煎煮時(shí)間樣品，備用。

2.2 色譜條件 Ultimate AQ -C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇-0.1% 甲酸水溶液，梯度洗脫（0～3 min，0%A；3～10 min，0%～3%A；10～15 min，3%～5%A；15～25 min，5%～15%A；25～30 min，15%～16%A；30～55 min，15%～60% A；55～70 min，60%～90% A）；體積流量1.2 mL／min；柱溫15 ℃；檢測波長273 nm；進(jìn)樣量10 μL。理論塔板數(shù)以沒食子酸計(jì)算不低于4 500，沒食子酸色譜峰與相鄰峰的分離度大于1.5，峰形對稱，色譜圖見圖1。

2.3 對照品溶液制備 取沒食子酸對照品適量，精密稱定，于25 mL 量瓶中，加50% 甲醇溶解并定容，得到?jīng)]食子酸質(zhì)量濃度為0.361 5 g／L 的對照品溶液，作為貯備液。

2.4 供試品溶液制備 精密量取“2.1”項(xiàng)下樣品液各0.5 mL，分別置于蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，加50%甲醇溶解并轉(zhuǎn)移至100 mL 量瓶中，定容，搖勻，經(jīng)0.22 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液即得。

2.5 線性關(guān)系考察 精密吸取“2.3”項(xiàng)下對照品溶液0.5、1.0、2.0、3.0、5.0、7.0、9.0 mL，分別置于10 mL 量瓶中，加50% 甲醇稀釋定容，搖勻，得系列沒食子酸對照品溶液，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣。以對照品質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，得沒食子酸的回歸方程為Y＝4 232.8X-7.817 7（r＝0.999 9），表明沒食子酸在0.015 8～0.284 9 g／L 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 沒食子酸HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of gallic acid

2.6 精密度試驗(yàn) 取同一供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣6 次，沒食子酸峰面積RSD 為0.97%，表明儀器精密度良好。

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取余甘子藥材粗粉6 份，按“2.1”項(xiàng)下方法制備6 份水煎1 h 的樣品，分別按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄峰面積并計(jì)算沒食子酸含有量。得水煎1 h 樣品中沒食子酸的平均含有量為1.41 g／L，RSD 為1.68%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下，分別于制備后0、2、4、8、12、24 h（于5 ℃放置）進(jìn)樣，記錄峰面積。結(jié)果沒食子酸RSD 為1.31%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.9 加樣回收率試驗(yàn) 精密量取“2.1”項(xiàng)下水煎1 h 樣品液0.1 mL，共9 份，隨機(jī)等分成3 組，按低、中、高質(zhì)量濃度對照品加入量與所取供試品中待測定成分量之比為0.5∶1、1∶1、1.5∶1，分別精密加入沒食子酸對照品溶液，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄峰面積并計(jì)算回收率。結(jié)果沒食子酸的平均回收率為100.18%，RSD 為1.54%。

2.10 沒食子酸含有量及增量百分比 取“2.4”項(xiàng)下各供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，記錄峰面積并計(jì)算沒食子酸含有量（g／L），分別以水煎2～96 h 樣品的沒食子酸的含有量增量與水煎1 h 樣品的沒食子酸含有量比較，得出各樣品沒食子酸含有量的增量百分比。計(jì)算公式為沒食子酸含有量的增量百分比＝（A-水煎1 h 水煎液中沒食子酸含有量）／水煎1 h 水煎液中沒食子酸含有量×100%，A為非水煎1 h 樣品的任一樣品中沒食子酸含有量，結(jié)果見表1。

表1 不同水煎時(shí)間樣品中沒食子酸含有量及增量百分比Tab.1 Gallic acid content and percentage increase of aqueous decoction at different water-decoction time

結(jié)果表明，與水煎1 h 相比，水煎2、4、8、12、96 h 沒食子酸含有量增量百分比分別達(dá)到60.6%、117.2%、131.0%、334.0%、489.1%。可見，水煎提取至2 h，沒食子酸含有量成倍增加，且含有量隨煎煮時(shí)間的延長呈遞增趨勢。

2.11 成分分析

2.11.1 對照品溶液制備

2.11.1.1 沒食子酸對照品溶液制備 精密吸取“2.3”項(xiàng)下對照品溶液3.0 mL，于10 mL 量瓶中，加50% 甲醇定容，得到?jīng)]食子酸質(zhì)量濃度為0.108 4 g／L 的對照品溶液。

2.11.1.2 單寧酸、柯里拉京、鞣花酸對照品溶液制備 分別取單寧酸、柯里拉京、鞣花酸對照品適量，精密稱定，各自加50%甲醇溶解并定容至10 mL 量瓶中，得到單寧酸質(zhì)量濃度為0.103 1 g／L、柯里拉京質(zhì)量濃度為0.0 927 g／L 和鞣花酸質(zhì)量濃度為0.1 015 g／L 的對照品溶液。

2.11.2 供試品溶液制備 取“2.1”項(xiàng)下樣品，按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，得水煎1、2、3、4、8、12、24、36、48、72、96 h 的供試品溶液。

2.11.3 已知成分定性 在“2.2”項(xiàng)色譜條件下，每個(gè)對照品溶液單獨(dú)進(jìn)樣，分別獲得沒食子酸、單寧酸、柯里拉京、鞣花酸的保留時(shí)間。

取水煎1 h 樣品制備的供試品進(jìn)樣，色譜峰編號(hào)以出峰先后順序依次編為1～19。采用對照品保留時(shí)間對組分進(jìn)行定性，確定色譜峰6 為沒食子酸，色譜峰14 為單寧酸，色譜峰17 為柯里拉京，色譜峰18 為鞣花酸，其他為未知成分。

2.11.4 不同水煎時(shí)間樣品色譜圖 在“2.2”項(xiàng)色譜條件下，取“2.11.2”項(xiàng)下供試品溶液進(jìn)樣，色譜峰的編號(hào)以1 h 水煎樣品的供試品出峰先后順序1～19 為基礎(chǔ)，新檢測出的色譜峰編號(hào)為20，不同水煎樣品色譜圖見圖2。

圖2 不同水煎時(shí)間各成分HPLC 色譜圖Fig.2 HPLC chromatogram of various constituents at different frying time

煎煮1～96 h，色譜峰6 及未知色譜峰8、11的峰面積隨時(shí)間延長逐漸增加，水煎至3 h 時(shí)首次檢出未知色譜峰20 且峰面積隨時(shí)間延長而逐漸增加。水煎1～96 h，色譜峰14、17、18 和未知色譜峰1、2、3、4、7、9、10、12、13、15、16 的峰面積呈減少趨勢，其中，色譜峰14、18 和未知色譜峰1、2、3、4、7、10、12、13 的峰面積在水煎至4、12 h 時(shí)略有增加，隨后逐漸減少，至48 h 時(shí)色譜峰14、18 和未知色譜峰12、13 未檢出，未知色譜峰9、15 的峰面積在4 h 時(shí)有增加隨后逐漸減少，至8 h 時(shí)未知色譜峰9 未檢出，色譜峰17 的峰面積在2、4、24 h 有增加隨后減少，至36 h 時(shí)未檢出，未知色譜峰16 的峰面積在4、12、36 h有增加隨后減少。水煎過程中，色譜峰5 的峰面積逐漸減少至12 h 時(shí)未檢出。未知色譜峰19 的峰面積幾乎無變化?？傊?，余甘子水煎96 h 內(nèi)，3 種成分的量增加，1 種成分新檢出，15 種成分的量減少，其中7 種成分減少至未檢出，1 種成分的量幾乎無變化。

2.12 酶水解實(shí)驗(yàn) 酶水解樣品制備，取余甘子藥材粗粉3 份，每份40 g，分別置于圓底燒瓶內(nèi)，加水400 mL，加入單寧酶，調(diào)節(jié)溶液pH 為5.0，稱定質(zhì)量，分別于35 ℃水浴回流1、4、8 h，酶解結(jié)束后先高溫滅酶后于冰浴中迅速冷卻，補(bǔ)足減失質(zhì)量，于5 000 r／min 離心10 min，取上清液即可，獲得不同酶水解時(shí)間樣品。

按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，色譜峰的編號(hào)以1 h 水煎樣品的供試品出峰先后順序1～19 為基礎(chǔ)，新檢測出的色譜峰編號(hào)為20，記錄峰面積并計(jì)算沒食子酸含有量，不同酶水解時(shí)間樣品色譜圖見圖3。

圖3 不同酶水解時(shí)間各成分HPLC 色譜Fig.3 HPLC chromatogram of various constituents at different enzyme hydrolysis time

與水煎1 h 樣品相比，酶水解1、4、8 h 樣品中沒食子酸含有量分別為3.82、5.25、6.70 g／L，增量百分比分別為173.0%、275.0%、378.0%。酶水解過程中，色譜峰6 的峰面積急劇增加，未知色譜峰8、11 的峰面積逐漸增加。酶水解至8 h 時(shí)新檢出未知色譜峰20。色譜峰14、17 和未知色譜峰1、2、3、4、5、7、9、10、12、13、15、16 的峰面積逐漸減少，其中，色譜峰14 和未知色譜峰4、7、9 在酶水解至1 h 時(shí)未檢出，未知色譜峰13、15 在酶水解至4 h 時(shí)未檢出，色譜峰17 在酶水解至8 h 時(shí)未檢出。色譜峰18 和未知色譜峰19的峰面積幾乎沒變化?？梢?，酶水解可以加快沒食子酸的生成速率，加快多個(gè)色譜峰峰面積的減少速率，且快速使單寧酸、未知色譜峰4、7、9 在酶解1 h 時(shí)處于未檢出狀態(tài)。

2.13 酸水解 酸水解樣品制備，取余甘子藥材粗粉4 份，每份40 g，分別置于圓底燒瓶內(nèi)，加2 mol／L HCl 400 mL，稱定質(zhì)量，分別于100 ℃水浴回流1、2、4、8 h，回流結(jié)束后于冰浴中迅速冷卻，補(bǔ)足減失質(zhì)重，于5 000 r／min 離心10 min，取上清液即可，獲得不同酸水解時(shí)間樣品。

按“2.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，色譜峰的編號(hào)以1 h 水煎樣品供試品出峰先后順序1～19 為基礎(chǔ)，新檢測出的色譜峰按其先后出峰順序編號(hào)為20、21，記錄峰面積并計(jì)算沒食子酸含有量，不同酸水解時(shí)間樣品色譜圖見圖4。

圖4 不同酸水解時(shí)間各成分HPLC 色譜圖Fig.4 HPLC chromatogram of various constituents at different acid hydrolysis time

與水煎1 h 時(shí)樣品相比，酸水解1、2、4、8 h樣品中沒食子酸含有量依次為7.12、8.65、10.27、11.08 g／L，增量百分比分別為408.0%、518.0%、633.0%、691.0%。酸水解1～8 h，色譜峰6 和未知色譜峰8 的峰面積急劇增加，酸水解1 h樣品中新檢出未知色譜峰20 和21，且隨時(shí)間延長峰面積緩慢增加，色譜峰14、17 和未知色譜峰1、2、3、4、5、7、9、10、11、12、13、15、16的峰面積逐漸減少，其中，色譜峰14、17 和未知色譜峰5、9、11、12、13、16 在酸水解至1 h 時(shí)未檢出，未知色譜峰3、15 在酸水解至2 h 時(shí)未檢出，未知色譜峰4、7 在酸水解至4 h 時(shí)未檢出。色譜峰18 和未知色譜峰19 的峰面積幾乎無變化?？梢姡崴饪杉涌鞗]食子酸的生成速率，新增未知色譜峰20、21，快速增加未知色譜峰8 的峰面積，加快多個(gè)色譜峰面積的減少速率，快速使單寧酸、柯里拉京、未知色譜峰5、9、11、12、13、16 在酸水解1 h 時(shí)處于未檢出狀態(tài)。

2.14 水煎驗(yàn)證試驗(yàn) 為排除藥材產(chǎn)地、批次誤差問題，采用云南普洱（沒食子酸含有量1.31%）、四川（沒食子酸含有量1.43%）、江西（沒食子酸含有量2.45%）產(chǎn)地的余甘子進(jìn)行水煎及成分分析重復(fù)試驗(yàn)。按“2.1”項(xiàng)下方法制備各產(chǎn)地水煎液，在“2.2”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，3 個(gè)產(chǎn)地水煎液沒食子酸含有量變化結(jié)果見表2，色譜圖見圖5～7。

表2 不同產(chǎn)地樣品水煎液中沒食子酸含有量及增量百分比Tab.2 Gallic acid content and percentage increase in aqueous decoction samples from different growing areas

圖5 云南產(chǎn)地水煎樣品中各成分HPLC 色譜圖Fig.5 HPLC chromatogram of various constituents of aqueous decoction from Yunnan growing areas

水煎1～96 h，3 個(gè)產(chǎn)地的余甘子水煎液中，隨著煎煮時(shí)間延長，沒食子酸含有量均顯著增加且呈遞增趨勢，未知色譜峰8、11 的峰面積均逐漸增加，煎煮至4 h 后均檢出未知色譜峰20 且隨煎煮時(shí)間延長峰面積逐漸增加，色譜峰14、17、18 和未知色譜峰1、2、3、4、5、7、9、10、12、13、15、16的峰面積呈減少趨勢，其中，色譜峰14、17、18和未知色譜峰5、9、12、13、16 最后均未檢出。3個(gè)產(chǎn)地的余甘子水煎實(shí)驗(yàn)結(jié)果與“2.1”項(xiàng)下云南產(chǎn)地余甘子的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。可見，不同產(chǎn)地余甘子水煎過程中均發(fā)生相同的成分變化趨勢，

圖6 四川產(chǎn)地水煎樣品中各成分HPLC 色譜圖Fig.6 HPLC chromatogram of various constituents of aqueous decoction from Sichuan growing areas

3 討論

3.1 色譜條件選擇 考察了Sepax Bio-C18、Agilent ZORAX SB-Phenyl、Pheomenex Desi C18、Ultimate Phenyl-Ether、Ultimate AQ-C18等色譜柱，最終選擇Ultimate AQ -C18柱，其分離出的色譜峰多、分離效果好；考察了甲醇-水、甲醇-0.1% 磷酸水、甲醇-0.1% 甲酸水、乙腈∶甲醇（4∶1）-0.1%甲酸水、乙腈-水、乙腈-0.1% 磷酸水、乙腈-0.1%甲酸水等流動(dòng)相系統(tǒng)，結(jié)果以甲醇-0.1% 甲酸水體系分離效果好。

圖7 江西產(chǎn)地水煎樣品中各成分HPLC 色譜圖Fig.7 HPLC chromatogram of various constituents of aqueous decoction from Jiangxi growing areas

3.2 水煎與酶水解、酸水解實(shí)驗(yàn) 在水煎、酶水解、酸水解過程中，沒食子酸含有量均隨時(shí)間延長而顯著增加，水煎8、96 h 時(shí)沒食子酸增量百分比高達(dá)131.0%、489.1%，酶水解8 h 時(shí)沒食子酸增量百分比高達(dá)378.0%，酸水解8 h 時(shí)沒食子酸的增量百分比高達(dá)691.0%，酶水解、酸水解均加快沒食子酸含有量增加速率。

由于水煎、酶水解、酸水解會(huì)快速使某些成分發(fā)生變化，因此，在進(jìn)行水煎、酶水解與酸水解樣品的色譜分析過程中，均采用水煎1 h 樣品作為對照樣品，以反映成分變化情況。水煎、酶水解、酸水解過程中一致的變化規(guī)律有沒食子酸和未知色譜峰8 的峰面積逐漸增加，新檢出未知色譜峰20，單寧酸、柯里拉京以及未知色譜峰1、2、3、4、5、7、9、10、12、13、15、16 的峰面積呈減少趨勢，未知色譜峰19 的峰面積幾乎無變化?？梢?，余甘子在水煎、酶水解、酸水解過程中，沒食子酸含有量及其他成分變化趨勢基本一致，但變化速率不同，按從快到慢順序依次為酸水解快于酶水解快于水煎。

3.3 原因分析 余甘子主要含多酚酸類成分（包括糅質(zhì)等），其中可水解鞣質(zhì)能夠受酸、堿、鞣酶的催化而水解［24-25］。水煎過程中，因多酚酸類成分使水煎液處于酸性狀態(tài)，加上持續(xù)加熱，發(fā)生了水解反應(yīng)而生成沒食子酸。從水煎、酶水解、酸水解實(shí)驗(yàn)看出，隨著時(shí)間增加，沒食子酸含有量顯著增加，柯里拉京、單寧酸和12 種未知成分逐漸減少乃至最終未檢測?？吕锢螌幩岬拿黠@減少可推測其發(fā)生了水解反應(yīng)并釋放出沒食子酸。從沒食子酸量增加較多推測可能另有其他未知成分水解產(chǎn)生了沒食子酸，從而導(dǎo)致沒食子酸含有量顯著增加。此外，水煎、酶水解、酸水解具有較為一致的成分變化趨勢，故推斷余甘子水煎過程發(fā)生了水解反應(yīng)，沒食子酸含有量的增加源于水解反應(yīng)新產(chǎn)生了沒食子酸，同時(shí)伴隨其他成分的改變。

余甘子屬于藥食兩用植物，廣泛應(yīng)用于藥物、保健品中，水煎是常規(guī)提取方法，因此，加熱時(shí)間長短會(huì)影響余甘子提取物中成分組成及成分含有量，沒食子酸增加及其他成分的增加與減少甚至消失，對其安全性、有效性有什么影響是一個(gè)有待解決的問題，因此，應(yīng)進(jìn)一步對余甘子的水煎工藝與提取物的成分組成、安全性、有效性進(jìn)行研究。