一測多評法同時測定不同采收期杜仲葉中4 種黃酮

唐 鵬何 兵劉 盼田 吉

（西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，四川 瀘州646000）

杜仲Eucommia ulmoidesOliver.為杜仲科杜仲屬植物，是我國著名藥材。傳統(tǒng)上杜仲主要以樹皮入藥，有補益肝腎、強筋壯骨、調(diào)理沖任、固經(jīng)安胎的功效［1］。杜仲葉和杜仲皮相近，也具有補肝腎、強筋骨的功能，已被收入2015 年版《中國藥典》［1］。現(xiàn)代研究表明，杜仲葉與杜仲皮所含化學(xué)成分及藥理作用相近［2-4］。杜仲葉中主要成分包括綠原酸、環(huán)烯醚萜類、黃酮類、多糖類、苯丙素類、木脂素類等。其中，杜仲葉黃酮具有降血糖、降血壓、抗氧化等多種藥理作用［5-9］，是重要的活性成分。檢測杜仲葉黃酮的含有量，對杜仲葉的質(zhì)量評價和確定采收時間具有重要意義?，F(xiàn)代中藥質(zhì)量評價提倡多指標質(zhì)量控制模式，對照品的種類和數(shù)量需求均較大。王智民等［10］提出一測多評法質(zhì)控模式，可實現(xiàn)僅用一個對照品，進行多個成分的同步檢測。該方法已運用于丹參、三黃片、雙青咽喉片等多種中藥的質(zhì)量控制［11-13］。2010 年版《中國藥典》 首次在中藥材黃連項下收載了一測多評方法，2015 年版《中國藥典》 增加至9 個品種，是其重點推廣的技術(shù)之一［14］。杜仲葉含有多種黃酮類成分，本實驗以不同采收期、不同產(chǎn)地的杜仲葉為研究對象，應(yīng)用一測多評法，采用HPLC 法同時測定槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖-（1→2）-β-D-葡萄糖苷、蘆丁、異槲皮苷及紫云英苷4 種主要黃酮類成分的含有量。并采用紫外分光光度法，測定不同采收期杜仲葉總黃酮的含有量，以期為其質(zhì)量評價以及合理采收時間提供依據(jù)。

1 材料

島津Prominence-i LC-2030 高效液相色譜儀（日本島津公司，紫外檢測器，自動進樣器）；戴安P680 A 高效液相色譜儀（美國戴安公司，含四元泵，PDA-100 二極管陣列檢測器，TCC-100 柱溫箱，Chromeleon 色譜工作站）；島津UV2600 型紫外分光光度計（日本島津公司）；AS7240A 超聲清潔機（天津奧特賽恩斯儀器有限公司）；XR 205SM-DR 電子天平（瑞士Precisa 公司，萬分之一，最多稱取92 g；千分之一，最多稱取205 g）。

槲皮素-3-O-α-L-阿拉伯糖-（1→2）-β-D-葡萄糖苷（DZHT-1），為實驗室自制；蘆?。ㄅ?00080-201610）、異槲皮苷（批號111809-201403）均購自中國食品藥品檢定研究院；紫云英苷（批號MUST-17031820）購自成都曼思特生物科技有限公司，質(zhì)量分數(shù)均大于98%。大孔樹脂AB-8（批號100108）由天津市海光化工有限公司提供。乙腈為色譜純；其余試劑為分析純；水為重蒸水。

杜仲葉樣品S1～S9 分別于不同的月份采收自四川省瀘州市納溪區(qū)，信息見表1，晾干備用。S10～S13 購自河北安國中藥材市場，S14～S15 購自安徽亳州中藥材市場，其中S10～S12 產(chǎn)地為四川，S13～S15 產(chǎn)地為湖北。經(jīng)西南醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院田吉研究員鑒定為杜仲科植物杜仲Eucommia ulmoidesOliv.的干燥葉。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 4 種黃酮含有量測定

2.1.1 色譜條件 Thermo BDS HYPERSIL C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B），梯度洗脫（0～10 min，92%～86%B；10～50 min，86%～84%B）；體積流量1.0 mL／min；進樣量10 μL；檢測波長360 nm；柱溫30 ℃。在選定的色譜條件下，4 種黃酮與其前后色譜峰的分離度均大于1.5，理論板數(shù)大于4 000。色譜圖見圖1。

2.1.2 混合對照品溶液制備 分別精密稱取DZHT-1 134.17 mg、蘆丁10.70 mg、異槲皮苷39.44 mg、紫云英苷10.54 mg，置100 mL 量瓶中，加入50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得混合對照品貯備液。分別精密吸取對照品貯備液3.0、2.0、1.0、0.5、0.2、0.1 ml，置25 ml 量瓶中，50%甲醇定容至刻度，搖勻，過0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.1.3 供試品溶液制備 取杜仲葉樣品，粉碎過4 號篩，精密稱取約1.0 g，置100 mL 具塞錐形瓶中，加入50%甲醇，超聲提取2 次，每次25 mL，提取30 min，濾過，合并濾液，水浴蒸干，加入5 mL 水溶解，過AB-8 大孔樹脂柱，水洗去雜質(zhì)，再用50%乙醇50 mL 洗脫，洗脫液水浴蒸干，加入50%甲醇溶解并定容至10 mL。過0.22 μm 微孔濾膜，即得。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.1.4 線性關(guān)系考察 取“2.1.2”項下混合對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣。以各組分的質(zhì)量濃度為橫坐標（X），相應(yīng)峰面積為縱坐標（Y）進行線性回歸，得回歸方程。結(jié)果見表2，表明各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.1.5 精密度試驗 取同一混合對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下連續(xù)進樣6 次，測得DZHT-1、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷峰面積RSD分別為0.10%、0.52%、0.22%、1.30%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 穩(wěn)定性試驗 取同一批次樣品（S5），按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下，分別于0、2、4、6、8、10、12、24 h 進樣，測得DZHT-1、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷峰面積RSD 分別為1.37%、1.77%、1.60%、1.44%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.7 重復(fù)性試驗 取同一批次樣品（S5）6 份，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下測得DZHT-1、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷峰面積RSD 分別為1.43%、1.88%、1.90%、1.57%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.8 加樣回收率試驗 精密稱定已知含有量的同一樣品粉末（S5）約0.5 g，共9 份，每3 份為1 組，分別按1∶0.8、1∶1、1∶1.2 的比例精密加入各對照品溶液，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下測定并記錄各成分的峰面積，計算回收率，結(jié)果見表3。

表3 各成分加樣回收率試驗結(jié)果（n＝9）Tab.3 Results of recovery tests for various constituents（n＝9）

2.2 相對校正因子測定

2.2.1 計算方法 取“2.1.2”項下混合對照品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣10 μL，以DZHT-1 為內(nèi)標，計算其他3 種成分的相對校正因子。校正因子計算公式為fk／s＝（Cs?Ak）／（Ck?As），Cs為參照物質(zhì)量濃度，As為參照物色譜峰峰面積，Ck為其他對照組分質(zhì)量濃度，Ak為其他對照組分色譜峰峰面積。結(jié)果見表4。

表4 各成分相對校正因子Tab.4 Relative correction factors of various constituents

2.2.2 不同儀器、不同色譜柱的考察 取“2.1.2”項下混合對照品溶液，考察島津Prominence-i LC-2030、戴安（P680 A）2 種不同色譜儀，以及Thermo BDS HYPERSIL C18、LUBEXMTKromasil C18、Diamonsil Plus C183 種不同色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）對相對校正因子的影響，結(jié)果見表5。由表可知，不同儀器、不同色譜柱對相對校正因子的影響不明顯，RSD 為1.13%～2.05%。

2.2.3 柱溫考察 取“2.1.2”項下混合對照品溶液，考察柱溫25、30、35 ℃對相對校正因子的影響，結(jié)果見表6。由表可知，不同的柱溫對相對校正因子的影響不明顯，其RSD 0.27%～0.64%。

表5 不同儀器和色譜柱上的相對校正因子Tab.5 Relative correction factors on different instruments and columns

表6 不同柱溫對相對校正因子影響Tab.6 Effects of different columns temperatures on relative correction factors

2.2.4 體積流量考察 取“2.1.2”項下混合對照品溶液，考察流動相不同體積流量0.8、1.0、1.2 mL／min 對相對校正因子的影響，結(jié)果見表7。由表可知，不同體積流量對相對校正因子的影響不明顯，其RSD 0.70%～0.96%。

2.2.5 色譜峰定位

2.2.5.1 相對保留時間 取“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，分別采用2 種色譜儀和3 種色譜柱在“2.1.1”項色譜條件下進樣，計算相對保留時間，結(jié)果見表8。由表可知，不同儀器、色譜柱對相對保留時間的影響不明顯，其RSD 1.04%～1.53%。結(jié)果表明可以通過相對保留時間來定位待測成分的色譜峰。

表7 不同體積流量對相對校正因子的影響Tab.7 Effects of different volumetric flow on relative correction factors

2.2.5.2 紫外吸收光譜輔助定位 出現(xiàn)與待測成分色譜峰保留時間非常接近的相鄰峰，采用相對保留時間定位就可能會有困難。配備二極管陣列檢測器的高效液相色譜儀，可以實時查看各色譜峰的紫外吸收光譜，這時可以根據(jù)吸收光譜的形狀和最大吸收波長的位置來輔助定位待測成分的色譜峰。4種黃酮對照品的紫外吸收光譜見圖2。

表8 不同儀器和色譜柱上相對保留時間Tab.8 Relative retention time on different instruments and columns

圖2 各對照品紫外吸收光譜圖Fig.2 UV absorption spectrogram of various reference substances

2.2.6 一測多評法與外標法比較 采用一測多評法和外標法，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項色譜條件下進樣，對4 種黃酮進行含有量測定，結(jié)果見表9。

為了驗證一測多評的準確性，將一測多評法與外標法含有量測定的結(jié)果經(jīng)Pearson 相關(guān)系數(shù)分析，結(jié)果2 種方法之間r大于0.999 9，說明2種方法的相關(guān)性很高。再采用t檢驗，對一測多評法和外標法得到的含有量測定結(jié)果進行比較，以P＞0.05 無統(tǒng)計學(xué)差異。

表9 各成分含有量測定結(jié)果（mg／g， n＝2）Tab.9 Results of content determination of various constituents（mg／g， n＝2）

2.3 紫外分光光度法測定總黃酮含有量

2.3.1 對照品溶液制備 精密稱定DZHT-1 對照品6.25 mg 置于25 mL 量瓶中，加入50%乙醇適量溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得質(zhì)量濃度為0.25 mg／mL 對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液制備 杜仲葉樣品粉碎過4 號篩，精密稱取約0.2 g，按“2.1.3”項下方法，用50%乙醇50 mL 洗脫，收集洗脫液并加入50%乙醇定容至100 mL。過0.22 μm 微孔濾膜，即得。

2.3.3 測定波長選擇 將對照品溶液和供試品溶液在200～800 nm 掃描，發(fā)現(xiàn)兩者均在360 nm 附近有最大吸收，所以選擇測定波長為360 nm。

2.3.4 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對照品溶液1.50、1.25、1.00、0.75、0.50、0.25、0.10 mL，置10 mL 量瓶中，用50% 乙醇稀釋至刻度。以50%乙醇作為空白對照，用紫外分光光度計在360 nm處測定吸光度，以DZHT-1 質(zhì)量濃度為橫坐標（X），吸光度為縱坐標（Y），進行回歸，得回歸方程為Y＝2.818 4X＋0.025 6，r＝0.999 5。表明DZHT-1 在0.025～0.375 mg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.5 精密度試驗 取對照品溶液，在360 nm 處測定吸光度，連續(xù)測定6 次，其RSD 為0.13%。表明儀器精密度良好。

2.3.6 穩(wěn)定性試驗 取對照品及供試品溶液，于室溫下分別放置0、2、4、6、8、10、12、24 h 后測定吸光度，計算得出對照品及供試品的吸光度RSD 分別為1.15%、1.62%。表明對照品溶液和供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.7 重復(fù)性試驗 取同一批杜仲葉（S5），按“2.3.2”項下方法制備6 份供試品溶液，測定吸光度，計算得出總黃酮的平均含有量為6.78%，RSD 為1.47%。表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.8 加樣回收率試驗 精密稱取已知總黃酮含有量的杜仲葉粉末（S5）9 份，每份約0.1 g，分成3 組，每組3 份，分別按1∶0.8、1∶1、1∶1.2的比例加入適量DZHT-1 對照品，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，用紫外分光光度計在360 nm 處精密測定吸光度，分別計算含有量和加樣回收率，結(jié)果總黃酮平均加樣回收率為95.36%，RSD 為1.58%。

2.3.9 樣品總黃酮含有量測定 按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，采用標準曲線法計算總黃酮含有量，結(jié)果見表10。

表10 總黃酮含有量測定結(jié)果（n＝3）Tab.10 Determination results of total falvonoids（n＝3）

2.4 綜合評分 以4 種黃酮的含有量之和以及紫外分光光度法所測得的總黃酮含有量為考察指標，權(quán)重系數(shù)分別為0.5、0.5，對不同采收期杜仲葉進行綜合評分，結(jié)果見表11。

表11 9 批樣品權(quán)重得分Tab.11 Weight scores of nine batches of samples

3 討論

現(xiàn)有文獻報道對杜仲葉成分分析、含有量測定和指紋圖譜均有涉及［15-16］，但是對川南的杜仲葉研究相對較少。

本研究考察了甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液等體系，用乙腈-0.1% 磷酸溶液作為流動相經(jīng)反復(fù)優(yōu)化調(diào)整后，采用梯度洗脫條件，色譜圖分離效果最佳?？疾炝瞬煌瑵舛燃状迹?0%、50%、70%、100%）的提取效果，在提取方式方面比較了超聲、回流提取及乙酸乙酯萃取等，最終發(fā)現(xiàn)以50% 甲醇超聲提取2 次，每次30 min 得到的樣品溶液，峰面積較高且峰形較好。杜仲葉中含有多種黃酮類成分，其中DZHT-1、蘆丁、異槲皮苷、紫云英苷含有量較高，故以其為檢測指標。結(jié)果表明，在不同色譜柱、儀器、實驗室條件下，4 種黃酮間的相對校正因子有較好的重現(xiàn)性，方法耐用性好。并且一測多評法所測得4 種黃酮含有量與外標法所測基本相同，方法準確穩(wěn)定，重復(fù)性好，可用于杜仲葉的質(zhì)量控制。與文獻報道不同［16-17］，各批杜仲葉中，均未檢出槲皮素和山柰酚，可能是地域原因，本研究收集的各批杜仲葉中二者含有量低微，未能檢測到。

測定杜仲葉中總黃酮含有量，文獻報道均以蘆丁作為對照品［18-20］。但實際杜仲葉中含有量最高的黃酮類成分是DZHT-1，蘆丁含有量相對較低，因此選擇蘆丁為對照品并不合適，所以本研究以含有量最高的DZHT-1 為對照品計算總黃酮含有量，更具有代表性，更為合理。

杜仲屬于落葉喬木，葉大量生長的時期在4 至12 月，所以只考察了上述9 個月的杜仲葉樣品。結(jié)果表明，就單個成分而言，DZHT-1 和異槲皮苷在12 月含有量最高；而4 種黃酮含有量之和與總黃酮含有量，都以12 月為最高，其次是9、11 月；綜合評分結(jié)果表明，12 月杜仲葉的得分最高，9 至11 月居中，4 至8 月相對較低。如果僅考慮黃酮提取，瀘州地區(qū)杜仲葉采收期以9 至12 月為宜。之前有文獻報道杜仲葉中總黃酮含有量在每年4 月達到最高，其后逐步降低［21］，與本研究結(jié)果有所不同，可能與地域、氣候差異有關(guān)。

本研究共檢測了4 批四川產(chǎn)杜仲葉和3 批湖北產(chǎn)杜仲葉，各批樣品HPLC 法和UV 法測定結(jié)果基本吻合。不同批次樣品的黃酮含有量波動度較大，但兩地藥材之間無明顯差異，有待增大樣品量，進一步研究考察。