蜥蜴及其偽品石龍子鑒別方法比較

景大山申 鴿陳 婕楊 飛羅晉萍楊官娥?

（1.山西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，山西 太原030001； 2.山西省食品藥品檢驗所，山西 太原030001）

蜥蜴始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，別名馬蛇子、麻蛇子、麻蜥等，現(xiàn)收錄于《中藥大辭典》《全國中草藥匯編》《北京市中藥材標(biāo)準(zhǔn)》《吉林中草藥》和《山西省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》等，為蜥蜴科動物麗斑麻蜥Eremias argusPeters 或華北麻蜥Eremias brenchleyiGuenther 的干燥全體［1］。味咸，性寒，有小毒，歸肺、肝經(jīng)。具有破結(jié)利水、消癭散結(jié)的功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，蜥蜴可用于慢性萎縮性胃炎、乙型肝炎、結(jié)核病等疾病的治療，對胃癌、肝癌、食管癌等多種惡性腫瘤有明顯療效［2-4］。

蜥蜴屬于動物類冷背藥材，資源有限、價格昂貴，本課題組在前期蜥蜴對照藥材研究工作中發(fā)現(xiàn)，市場上出現(xiàn)大量蜥蜴?zhèn)纹肥堊?，石龍子價格只有蜥蜴價格的十分之一，《全國中草藥匯編》等中藥材專著未記載石龍子作為蜥蜴藥材的另一來源?！渡轿魇≈兴幉臉?biāo)準(zhǔn)》雖詳細(xì)規(guī)定了蜥蜴的性狀、顯微、水分、浸出物等定性鑒別項目，但是蜥蜴常以粉末形式入藥，藥材的外部形態(tài)被破壞，常規(guī)方法難以鑒定，急需找到快速有效的方法用于鑒別蜥蜴和石龍子藥材。國內(nèi)外相關(guān)文獻(xiàn)對中藥蜥蜴的研究較少，只有利用薄層色譜［5］和十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳法（Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）技術(shù)［6］對蜥蜴藥材進行質(zhì)量控制的報道，無中藥蜥蜴與其偽品石龍子鑒別方法的研究報道。

隨著現(xiàn)代技術(shù)的發(fā)展，電泳技術(shù)廣泛應(yīng)用于動物類藥材鑒別及其質(zhì)量評價研究，如地龍［7-8］、全蝎［9］、水蛭［10］等，為動物藥的鑒別研究提供了新方法。本研究通過TLC、SDS-PAGE 和非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳法（Native-polyacrylamide gel electrophoresis，Native-PAGE）對不同來源蜥蜴和石龍子藥材進行對比，以期尋找有效可行的鑒別方法。

1 材料

AR1140 電子天平（奧豪斯國際貿(mào)易有限公司）；SB-360DT 超聲波清洗機（寧波新芝生物科技有限公司）；高速冷凍離心機（安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司）；DYY-7C 電泳儀電源和DYCZ-24DN 電泳槽（北京市六一儀器廠）；PHS-320 液晶型臺式酸度計（成都世紀(jì)方舟科技有限公司）；ChampGel 5000 全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（北京賽智創(chuàng)業(yè)科技有限公司）。

丙烯酰胺、雙丙烯酰胺（上海生工生物工程有限公司）；Tris、PAGE 膠促凝劑（TEMED）、PAGE 膠凝固劑（過硫酸銨）、溴酚藍(lán)、甘氨酸、考馬斯亮藍(lán)R-250、SDS-PAGE 凝膠制備試劑盒、低分子量蛋白質(zhì)Marker（索萊寶生物科技有限公司）；SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液（5×）（上海碧云天生物技術(shù)有限公司），蔗糖、甲醇、冰醋酸等為分析純。

藥材經(jīng)山西醫(yī)科大學(xué)中藥教研室白云娥副教授鑒定為蜥蜴科動物麗斑麻蜥E.argusPeters 的干燥全體和石龍子科動物中華石龍子Eumeces chinensis（Gray）除去內(nèi)臟的干燥全體，信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法

2.1 TLC 鑒別

2.1.1 供試品溶液制備 取各批次樣品粉末0.5 g，加乙醇20 mL，超聲處理30 min，濾過，回收溶劑，殘渣加甲醇1 mL 溶解，作為供試品溶液。

2.1.2 TLC 條件 按照2015 年版《中國藥典》第四部通則0502 薄層色譜法實驗，分別吸取上述溶液各10 μL，點于同一硅膠G 薄層板上，以甲苯-乙酸乙酯（1∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，噴10%硫酸乙醇溶液，于105 ℃加熱至斑點顯色清晰。

2.2 SDS-PAGE 鑒別

2.2.1 Tris-HCl 緩沖液制備 精密稱取Tris 5.98 g和1 mol／L HCl 48.0 mL，調(diào)節(jié)pH 至6.7，定容至100 mL。濾過，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 供試品溶液制備 精密稱取每批蜥蜴及石龍子干燥藥材粉末（過40 目篩）0.5 g，分別加入稀釋4 倍的Tris-HCl 緩沖液4 mL，置預(yù)冷的研砵中研磨成勻漿狀，冰浴超聲30 min，0.8×104r／min冷凍離心10 min 收集上清液后，再1.2×104r／min冷凍離心10 min，收集上清液與SDS-PAGE 蛋白上樣緩沖液按比例混合，于100 ℃水浴5 min，取出，放至室溫，1×104r／min 離心5 min，上清液即為供試品溶液。

2.2.3 SDS-PAGE 條件 凝膠配制參見SDS-PAGE凝膠制備試劑盒的操作說明，其他溶液配制、電泳槽安裝詳見文獻(xiàn)［11］。分離膠體積分?jǐn)?shù)10%，濃縮膠體積分?jǐn)?shù)5%，膠厚1.5 mm，每條泳道上樣15 μL，電極緩沖液為Tris-甘氨酸緩沖液（含0.1%SDS）。電泳開始時穩(wěn)流15 mA，待樣品完全進入分離膠后，穩(wěn)流25 mA，待指示劑行至膠板下沿1 cm 左右停止電泳。用0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250溶液進行染色，放入脫色液中脫色直到背景清晰。

2.3 Native-PAGE 鑒別

2.3.1 供試品溶液制備 按“2.2.2”項下方法制備水溶性蛋白上清液后，與等體積40% 蔗糖溶液混合，作為供試品溶液，4 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3.2 Native-PAGE 條件 其他溶液配制、電泳槽安裝詳見文獻(xiàn)［12］。分離膠體積分?jǐn)?shù)7%，濃縮膠體積分?jǐn)?shù)3%，膠厚1.5 mm，每條泳道上樣30 μL，電極緩沖液為Tris-甘氨酸緩沖液（不含SDS），在負(fù)極槽電泳緩沖液中滴加一滴溴酚藍(lán)指示劑。電泳開始時穩(wěn)流15 mA，待溴酚藍(lán)指示劑到達(dá)兩膠交界處后，穩(wěn)流20 mA。待指示劑行至膠板下沿1 cm 左右停止電泳，整個過程在冰浴中低溫進行以防止溫度過高。用0.1%考馬斯亮藍(lán)R-250溶液進行染色，放入脫色液中脫色直到背景清晰。

3 結(jié)果

3.1 TLC 不同來源蜥蜴和石龍子樣品薄層色譜圖見圖1，10 批不同來源的蜥蜴藥材和3 批石龍子藥材均顯現(xiàn)相同斑點，分別是Rf值為0.14 和0.18的藍(lán)色斑點，以及Rf值為0.45 的紅色斑點。2 種藥材薄層行為基本一致，即薄層色譜技術(shù)不能將蜥蜴和石龍子區(qū)分。

圖1 各樣品TLC 色譜圖Fig.1 TLC chromatogram of various samples

3.2 SDS-PAGE 不同來源蜥蜴和石龍子樣品SDS-PAGE 電泳結(jié)果見圖2，經(jīng)Lane 1D 軟件分析，得出各譜帶相對分子質(zhì)量，并按公式相對遷移率（Rf）＝蛋白質(zhì)遷移距離／指示劑遷移距離，計算出各譜帶的Rf值，將所有譜帶按Rf值由小到大依次編號為1、2、3 等并以共遷移譜帶出現(xiàn)與否作為鑒別依據(jù)［13］，見表2。根據(jù)蛋白質(zhì)電泳譜帶的原始二態(tài)數(shù)據(jù)矩陣（在一位點形成譜帶記為1，無譜帶記為0）［14］，利用NTSYSpc-2.10e 統(tǒng)計分析軟件進行聚類分析，獲得聚類分析圖，見圖3。

圖2 水溶性蛋白SDS-PAGE 電泳圖Fig.2 SDS-PAGE pattern of water-soluble proteins

圖3 水溶性蛋白SDS-PAGE 電泳圖譜聚類圖Fig.3 Clustering map of SDS-PAGE pattern of watersoluble proteins

表2 水溶性蛋白SDS-PAGE 電泳譜帶相對遷移率和相對分子質(zhì)量Tab.2 Relative mobility and relative molecular mass of SDS-PAGE patterns of water-soluble proteins

圖2 表明，10 批蜥蜴樣品有3 條共有譜帶，分別是譜帶11（37.0 kDa）、15（16.5 kDa）和16（14.6 kDa）；3 批石龍子樣品有3 條共有譜帶，分別是譜帶11（37.0 kDa）、13（23.3 kDa）和16（14.6 kDa）。由圖2、表2 可知，譜帶15 是藥材蜥蜴的特征譜帶，可與石龍子進行區(qū)別；2 種藥材譜帶16 染色程度不同，蜥蜴譜帶染色較淺且細(xì)，石龍子譜帶染色深且粗，此譜帶也可作為二者的區(qū)別點。譜帶13 雖然是石龍子的共有譜帶，但并不是其特有譜帶，除了產(chǎn)自河北滄州的蜥蜴樣品1 和2，其他蜥蜴樣品也均有此譜帶。不同來源的蜥蜴樣品譜帶之間也有差異，產(chǎn)自河南開封的樣品譜帶清晰度低于其他產(chǎn)地樣品，可能與樣品蛋白含有量低有關(guān)；產(chǎn)自河南信陽樣品3 和4 的譜帶明顯多于其他產(chǎn)地，可能是由于不同產(chǎn)地樣品所含的蛋白質(zhì)種類和組成不完全相同，或是與不同炮制方法、保存條件等因素有關(guān)。

由圖3 可知，在相似系數(shù)0.54 時，13 批樣品聚為2 類，其中來自河北滄州的樣品1 和2 單獨聚為一類，2 批樣品在31.6 kDa 處有一特征譜帶，且18.3 kDa 處的譜帶與其他批次樣品明顯不同，表明河北滄州的蜥蜴樣品蛋白組成具有一定的產(chǎn)地差異；其他批次樣品與3 批石龍子樣品聚為一類，不同來源的蜥蜴樣品有按產(chǎn)地聚類的趨勢，但是蜥蜴和石龍子樣品沒有按物種聚為兩類，因此聚類分析并不能明顯區(qū)分2 種藥材。

3.3 Native-PAGE 不同來源蜥蜴和石龍子樣品的Native-PAGE 電泳結(jié)果見圖4，經(jīng)Lane 1D 軟件分析，根據(jù)電泳結(jié)果按“3.2”項下方法計算出Rf值，得到聚類圖，結(jié)果見表3、圖5。

圖4 水溶性蛋白Native-PAGE 電泳譜圖Fig.4 Native-PAGE pattern of water-soluble proteins

圖5 水溶性蛋白Native-PAGE 電泳圖譜聚類圖Fig.5 Clustering map of Native-PAGE pattern of water-soluble proteins

表3 水溶性蛋白Native-PAGE 電泳譜帶相對遷移率Tab.3 Relative mobility of Native-PAGE patterns of water-soluble proteins

圖4、表3 表明，不同來源蜥蜴樣品有3 條共有譜帶，分別為譜帶6（0.37）、14（0.71）、17（1.00），其中譜帶6 是蜥蜴的特征譜帶，石龍子沒有此譜帶。不同來源蜥蜴樣品的共有譜帶表明其所含水溶性蛋白質(zhì)種類的一致性，而蜥蜴樣品蛋白譜帶在分布、數(shù)量、染色程度方面存在差異，顯示蜥蜴蛋白具有一定的多態(tài)性。3 批石龍子樣品有7條共有譜帶，分別為譜帶4（0.30）、8（0.44）、10（0.56）、13（0.64）、14（0.71）、15（0.77）、17（1.00），其中譜帶4、13 和15 是石龍子的特征譜帶。2 種藥材Native-PAGE 電泳結(jié)果差別很大，出現(xiàn)完全不同的帶型，表明通過此方法可以明確直觀區(qū)別。

由圖5 可知，在相似系數(shù)為0.54 時，13 批樣品聚為2 類，即10 批蜥蜴樣品和3 批石龍子樣品，Native-PAGE 電泳圖譜聚類圖能將其明顯區(qū)分。在相似系數(shù)0.83 時，除來自河北邢臺的蜥蜴樣品9和10 以外，其他蜥蜴樣品分別按其各自的產(chǎn)地聚為一類。綜合以上分析可以看出，Native-PAGE 電泳結(jié)果和聚類分析結(jié)果具有一致性，該方法可將蜥蜴及其偽品石龍子進行有效鑒別。

4 討論

薄層色譜法是《中國藥典》 收載的中藥鑒別常用方法，具有設(shè)備簡單、操作簡便、分離速度快、靈敏度和分辨率較高等優(yōu)點，在質(zhì)量評價和控制方面發(fā)揮著重要作用［15］。余世春［5］對蜥蜴藥材進行質(zhì)量控制時，認(rèn)為蜥蜴藥材的主流品種為蜥蜴科動物麗斑麻蜥E.argus和石龍子科動物中華石龍子E.chinensis，二者分別與麗斑麻蜥對照藥材的薄層行為一致?！度珖胁菟巺R編》 《中藥大辭典》和《北京市中藥材標(biāo)準(zhǔn)》等專著僅記載蜥蜴科動物麗斑麻蜥或華北麻蜥的干燥全體為蜥蜴藥材，并沒有將石龍子收載為蜥蜴藥材。本研究采用不同的提取溶劑和展開劑直接將不同來源的蜥蜴和石龍子樣品進行薄層對比，發(fā)現(xiàn)其薄層行為基本一致，表明薄層色譜不能起到鑒別作用。

本研究采用SDS-PAGE 和Native-PAGE 方法比較不同來源的蜥蜴藥材及其偽品石龍子水溶性蛋白的電泳行為，并用凝膠成像系統(tǒng)對結(jié)果進行記錄，發(fā)現(xiàn)不同來源蜥蜴樣品的SDS-PAGE 圖譜中有1 條特征譜帶（16.5 kDa）可用于區(qū)別石龍子，但此譜帶與相鄰譜帶的分離度不高，顯著性不強；而Native-PAGE 圖中，蜥蜴和石龍子的特征譜帶辨識度高，蜥蜴有1 條特征譜帶，石龍子有3 條特征譜帶，可直觀地將蜥蜴和石龍子進行鑒別。聚類結(jié)果也表明Native-PAGE 法可將2 種藥材聚為兩類而SDS-PAGE 法不能，故Native-PAGE 法可作為蜥蜴和偽品石龍子有效可行的鑒別方法，以期為其質(zhì)量評價和動物類藥材的鑒別提供參考。

對不同產(chǎn)地的蜥蜴藥材的Native-PAGE 和SDSPAGE 圖譜進行分析，發(fā)現(xiàn)不同產(chǎn)地的蜥蜴樣品的蛋白譜帶在分布、數(shù)量、染色程度方面各不相同，表明各產(chǎn)地的蛋白質(zhì)表達(dá)存在差異，推測蛋白差異導(dǎo)致藥材生物活性成分種類與含有量的差異，可能與中藥材的道地性有一定關(guān)聯(lián)。

不同物種中存在穩(wěn)定表達(dá)的標(biāo)志蛋白質(zhì)［16-17］，基于本研究中找到的蜥蜴的特征性條帶，在后續(xù)研究中可以對特征蛋白進行回收，采用高靈敏、高通量的基質(zhì)輔助激光解吸附串聯(lián)飛行時間質(zhì)譜聯(lián)合技術(shù)分析［18-20］并通過數(shù)據(jù)庫檢索進行蛋白質(zhì)鑒定和功能分析，從而在分子水平上研究蜥蜴發(fā)揮藥理活性的物質(zhì)基礎(chǔ)。同時本課題組將對蜥蜴和石龍子藥材以斑馬魚為模型進行抗癲癇活性初步對比研究，以期為完善蜥蜴藥材標(biāo)準(zhǔn)及安全合理用藥奠定基礎(chǔ)。

本研究通過比較TLC 法、SDS-PAGE 法和Native-PAGE 法3 種鑒別方法，優(yōu)選出Native-PAGE法作為中藥蜥蜴與其偽品石龍子的定性鑒別方法，該方法準(zhǔn)確性高，重現(xiàn)性好，尤其適用于粉碎性藥材。