HPLC 法同時(shí)測定不同產(chǎn)地山茱萸果核中4 種成分

唐 凱南美娟張化為姜 祎宋小妹黃文麗鄧 翀

（陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西省秦嶺中草藥應(yīng)用開發(fā)工程技術(shù)研究中心，陜西省中藥基礎(chǔ)與新藥研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽712046）

山茱萸藥材為山茱萸科山茱萸屬植物山茱萸Cornus officinalis Sieb.et Zucc.的干燥成熟果肉，味酸澀，具有補(bǔ)益肝腎、澀精固脫的功效，藥理活性廣泛，其資源廣泛分布于全國。對于山茱萸的藥用部位，歷史沿革有“合核為用”“棄核為用”2種，今人多棄核不用或做引火之物，但山茱萸果核占山茱萸干果質(zhì)量的50%，造成資源極大浪費(fèi)。研究表明山茱萸藥材凈制去核后不飽和脂肪酸含有量提取率明顯降低，此外，從山茱萸果核中鑒定出不飽和脂肪酸成分的種類較其他炮制品高［1］，藥理研究證明山茱萸果核提取液具有舒張血管、抗炎、改善記憶、降壓降糖等作用［2-7］。目前針對山茱萸果核的諸多藥理活性評價(jià)實(shí)驗(yàn)中多以提取液或果核中不同提取部位為主，而化學(xué)成分及其定量分析研究較少。對此，本實(shí)驗(yàn)收集了包括河北、山西和陜西在內(nèi)共14 個(gè)產(chǎn)地的山茱萸果核，以沒食子酸、莫諾苷、5-羥甲基糠醛和原兒茶酸為評價(jià)指標(biāo)，對各產(chǎn)地山茱萸果核有效成分含有量進(jìn)行初步評價(jià)，以期為山茱萸果核的綜合利用和進(jìn)一步研究提供依據(jù)。

1 材料

Thermo U-3000 高效液相色譜儀（美國賽默飛世爾科技公司）；BT 25S 型電子天平（十萬分之一，北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）；GM-B 型電子天平（百分之一，余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司）；中興高速萬能粉碎機(jī)（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；SG3200HD 型超聲波清洗器（上海冠特超聲儀器有限公司）；HH-2 型恒溫水浴鍋（北京科偉永興儀器有限公司）。

沒食子酸對照品（批號110831-200302，中國食品藥品檢定研究院，純度≥99%）；5-羥甲基糠醛對照品（批號B21832，上海源葉生物科技有限公司，純度≥98%）；原兒茶酸對照品（批號110809-200604，中國食品藥品檢定研究院，純度≥98%）；莫諾苷對照品（批號16081703，陜西樂博生化科技有限公司，純度≥98%）；乙腈為色譜純，其他試劑為國產(chǎn)分析純，水為蒸餾水。

14 批樣品為2016 年采自陜西、河北和山西，經(jīng)陜西中醫(yī)藥大學(xué)中藥化學(xué)教研室王薇教授鑒定均為正品。信息見表1。

表1 樣品信息Tab.1 Information of samples

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Thermo Hypersil GOLD AQ C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.2% 甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～15 min，98%～95% B；15～22 min，95%～91% B；22～32 min，91% B；32～38 min，91%～88% B；38～61 min，88%～80%B；61～72 min，80%～77%B；72～80 min，77%～70%B）；柱溫30 ℃；體積流量1.0 mL／min；檢測波長270 nm；進(jìn)樣量10 μL。色譜圖見圖1。

2.2 混合對照品溶液制備 精密稱取沒食子酸、5-羥甲基糠醛、原兒茶酸、莫諾苷對照品適量，加甲醇制成每1 mL 含沒食子酸38.34 μg、5-羥甲基糠醛3.9 μg、原兒茶酸8.93 μg、莫諾苷25.32 μg的混合對照品溶液。

圖1 各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents

2.3 供試品溶液制備 精密稱取山茱萸果核粉末（過60 目篩）約1.0 g，置50 mL 錐形瓶中，按1∶12 的料液比精密加入60% 乙醇，回流提取90 min，提取2 次，過濾，合并2 次濾液，揮干，定容于10 mL 量瓶，加入7%明膠溶液4 mL，除去鞣質(zhì)，濾過，吸取1 mL 濾液稀釋5 倍，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液即得。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 線性關(guān)系考察 取混合對照品溶液1 mL 用甲醇稀釋，以混合對照品溶液為母液，精密吸取貯備液0.014、0.03、0.09、0.2、0.4、1.4 mL 分別置于10 mL 量瓶中，加甲醇溶液至刻度，搖勻，連同母液各進(jìn)樣10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），進(jìn)行回歸，結(jié)果見表2，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

表2 各成分線性關(guān)系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.4.2 精密度試驗(yàn) 取“2.2”項(xiàng)下混合對照品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下連續(xù)進(jìn)樣6次，得峰面積，測得沒食子酸、莫諾苷、5-羥甲基糠醛、原兒茶酸峰面積RSD 均小于2.0%，表明儀器精密度良好。

2.4.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3”項(xiàng)下供試品溶液（S9）適量，分別于室溫放置0、2、4、6、8、12、24 h，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，測得沒食子酸、莫諾苷、5-羥甲基糠醛、原兒茶酸峰面積RSD分別為0.38%、1.48%、2.28%、3.06%，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.4.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取山茱萸核樣品粉末0.5 g，共6 份，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件下進(jìn)樣，測得沒食子酸、5-羥甲基糠醛、原兒茶酸和莫諾苷的峰面積RSD 分別為1.24%、2.09%、2.68%、1.23%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4.5 加樣回收率試驗(yàn) 取已知含有量樣品粉末0.5 g，共5 份，分別加入一定量的沒食子酸、5-羥甲基糠醛、原兒茶酸和莫諾苷，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣，計(jì)算各成分回收率，結(jié)果見表3。

2.5 樣品含有量測定 取不同產(chǎn)地山茱萸果核樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別精密吸取供試液10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣。測定沒食子酸、5-羥甲基糠醛、原兒茶酸和莫諾苷含有量。結(jié)果表明沒食子酸和莫諾苷含有量相對較高，原兒茶酸和5-羥甲基糠醛含有量相對較低，見表4。

2.6 聚類分析 對14 批山茱萸果核中4 種成分的測定結(jié)果使用SPSS24.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行層次聚類分析，采用組間連接處理及Euclidean 距離的計(jì)算方法，當(dāng)閾值取5 時(shí)，結(jié)果將14 批樣品聚為4 類，樣品編號2、10、1、12、9、11、4 聚為第一類；7、13、6、14、3 聚為第二類；5 和8 各聚為一類，結(jié)果見圖2。

圖2 14 批樣品聚類樹狀圖Fig.2 Dendrogram of fourteen batches of samples

表3 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果Tab.3 Results of recovery tests for various constituents

表4 各成分含有量測定結(jié)果（mg／g）Tab.4 Results of content determination of various constituents（mg／g）

2.7 主成分分析 在對14 批樣品中相關(guān)成分進(jìn)行含有量測定的基礎(chǔ)上，運(yùn)用SPSS 24.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行主成分分析得到各個(gè)主成分的特征值、方差貢獻(xiàn)率、累計(jì)方差貢獻(xiàn)率及對應(yīng)的特征向量，見表5，特征值表示對應(yīng)主成分描述原有信息的多少，表明主成分1 特征值大于1，方差貢獻(xiàn)率74.124%，為全面考察各指標(biāo)成分對山茱萸果核總體化學(xué)成分含有量的影響，提取3 種主成分對不同產(chǎn)地樣品進(jìn)行三維圖譜的建立，見圖3，方差累計(jì)貢獻(xiàn)率為95.7%，具有較強(qiáng)代表性，故以3 種主成分代表其整體品質(zhì)，從而達(dá)到降維的目的。各變量對3 種主成分的貢獻(xiàn)可通過初始因子載荷矩陣圖表示，見圖4。

表5 主成分初始特征值和貢獻(xiàn)率Tab.5 Initial eigenvalues and contribution rates of principal components

2.8 質(zhì)量評價(jià) 以F1、F2和F3代表3 種主成分作為14 個(gè)產(chǎn)地山茱萸核所含化學(xué)成分表達(dá)的信息并建立線性關(guān)系表達(dá)式，得：

式中各變量為標(biāo)準(zhǔn)化變量。將該表達(dá)式與所對應(yīng)主成分的方差貢獻(xiàn)率做內(nèi)積再除以累計(jì)貢獻(xiàn)率，山茱萸果核質(zhì)量綜合評價(jià)表達(dá)式Y(jié)綜合得分＝（F1×74.124＋F2×14.802＋F3×6.788）／95.715。

圖3 14 批樣品主成分分析圖Fig.3 Principal component analysis plot for fourteen batches of samples

圖4 14 批樣品4 個(gè)指標(biāo)成分因子載荷圖Fig.4 Loaded map of four indicator component factor of fourteen batches of samples

根據(jù)此表達(dá)式可得不同產(chǎn)地山茱萸果核得分值與排序，見表6。從化學(xué)成分含有量的角度分析，可以得出14 批樣品排名高低。綜合排序名次越靠前，表明該產(chǎn)地樣品化學(xué)成分含有量越高，名次越后，總體成分含有量越低?？傻藐兾魇h中市洋縣（S12）山茱萸核得分最高、化學(xué)成分總體含有量較高；山西省陽城縣（S5）得分最低，山茱萸核化學(xué)成分含有量較低。

表6 主成分得分及排序Tab.6 Principal components scores and sort of the samples

3 討論

目前，山茱萸果核主要因“核能滑精”理論使其“合核為用”入藥存在爭議。所以，“合核為用”的前提是山茱萸果肉與果核具有相似的藥理作用或者山茱萸合核并沒有滑脫作用，這是山茱萸合核為用的關(guān)鍵所在。

研究表明山茱萸果肉與果核化學(xué)成分種類相似，都含有環(huán)烯醚萜和多酚類，但山茱萸果肉中以莫諾苷、馬錢苷和沒食子酸等為代表，而山茱萸果核中除脂肪油、氨基酸和鞣質(zhì)外，也含有沒食子酸、β-谷甾醇和莫諾苷等成分［8-9］。

本課題組前期研究表明山茱萸果核與果肉都具有抗肝損傷活性，且山茱萸果核60%乙醇提取液比果肉具有更顯著的保肝作用［10-11］，另有研究表明山茱萸果實(shí)乙醇提取物可以通過抑制氧化應(yīng)激途徑而具有保肝活性［12］。此外，有研究表明莫諾苷、5-羥甲基糠醛、原兒茶酸和沒食子酸均有明確的抗肝損傷作用［13-17］。鑒于山茱萸果核較好的抗肝損傷作用和莫諾苷等4 種成分明確的保肝活性，本實(shí)驗(yàn)以其作為指標(biāo)并對其進(jìn)行定量分析研究。

本實(shí)驗(yàn)通過含有量測定得出各指標(biāo)成分含有量由高到低分別為沒食子酸、莫諾苷、5-羥甲基糠醛和原兒茶酸。其中沒食子酸含有量最高為漢中鎮(zhèn)巴縣樣品，含有量達(dá)2.671%；莫諾苷含有量最高為漢中寧強(qiáng)縣樣品，含有量高達(dá)1.233%。主成分分析結(jié)果排序前5 名的產(chǎn)地均為漢中和寶雞兩市，與聚類分析結(jié)果較為吻合。單以山茱萸果核中所選4種指標(biāo)成分含有量論，陜西漢中與寶雞所產(chǎn)山茱萸果核化學(xué)成分含有量較高。結(jié)合主成分分析提取了3 個(gè)主成分因子，以期對山茱萸果核的含有量分析及質(zhì)量評價(jià)提供參考。