七十味珍珠丸對小鼠腸道菌群的影響

張斌斌聶 雨胡安玲徐尚福杜玉枝劉 杰?

（1.遵義醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室暨特色民族藥教育部國際合作聯(lián)合實驗室，貴州 遵義563003； 2.中國科學(xué)院 西北高原生物研究所，青海省藏藥藥理學(xué)和安全性評價研究重點實驗室，青海西寧810008）

藏醫(yī)藥是世界傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中的重要組成成分，也是世界四大醫(yī)學(xué)之一。七十味珍珠丸是藏醫(yī)藥中最具代表性的珍寶類藏成藥之一，在藏族地區(qū)應(yīng)用廣泛，其始載于藏醫(yī)古典巨著《四部醫(yī)典》 當(dāng)中，具有調(diào)和氣血、通經(jīng)活絡(luò)等作用，主要用于治療黑白脈病、中風(fēng)、高血壓病及神經(jīng)性障礙等疾病，現(xiàn)已收載于中華人民共和國藥典2015 版中［1］。同樣在瑞士生產(chǎn)的Padma-28（與七十味珍珠丸類似）在歐洲也受歡迎［2］。有研究認(rèn)為，七十味珍珠丸除具有保肝作用［3］外，還具有鎮(zhèn)靜、抗驚厥、提高學(xué)習(xí)記憶能力，改善腦血管及心血管相關(guān)疾病的作用［4-5］。

佐太又稱佐臺、佐塔，是七十味珍珠丸的基本成分之一，主要含β-HgS［6］。而汞是屬于重金屬毒物，但含汞藥物的安全性常與HgCl2來做比較，使其臨床使用大大受限［7］。而佐太（β-HgS）和HgCl2相比，其生物活性作用相差懸殊［8］。一個主要的原因是因為佐太在腸道吸收很少［7］，那么佐太很有可能會因此改變腸道菌而發(fā)揮治療作用。

近年研究已表明腸道菌群具有很重要的生理功能［9］，大腦也可以通過腸道菌群-腸-腦軸影響腸道菌群的物種組成多樣性及其豐度變化，腸道菌群也可以通過這一通路作用于大腦進(jìn)而影響情緒、食欲、生物節(jié)律以及一些中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病發(fā)生發(fā)展［10-12］。七十味珍珠丸對腦相關(guān)疾病具有很好的治療效果［4，13］，但卻未見其對腸道菌群的影響報道。而本實驗采用臨床劑量的藏藥七十味珍珠丸、佐太對小鼠進(jìn)行灌胃給藥，在對小鼠具有保肝的有效劑量基礎(chǔ)上［14］，進(jìn)一步觀察藥物對于小鼠腸道菌群的影響變化，為藏成藥七十味珍珠丸的臨床合理使用及有效性機(jī)制研究等提供一定的科學(xué)依據(jù)，同時研究其藥理作用機(jī)制也是對七十味珍珠丸評價重要的環(huán)節(jié)［15］。

1 材料

1.1 動物 SPF 級雄性昆明種小鼠，生產(chǎn)許可證號SCXK-（軍）2012-0011，體質(zhì)量（25±2）g，購自重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心，飼養(yǎng)于遵義醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)藥理教育部重點實驗室SPF 級動物房，適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后用于實驗。實驗遵照中華人民共和國實驗動物保護(hù)條例進(jìn)行，并獲遵義醫(yī)科大學(xué)動物使用倫理委員會批準(zhǔn)。

1.2 試藥 七十味珍珠丸（西藏甘露藏藥股份有限公司，國藥準(zhǔn)字Z54020062），將藥丸研磨成粉，加蒸餾水配制為混懸液使用［3］；藏藥佐太由中國科學(xué)院西北高原生物研究所提供［6］；氯化汞（HgCl2，美國Sigma-Aldrich 公司，批號49H0441）；糞便基因組DNA 提取試劑盒（TIANamp Stool DNA Kit，天根生化科技北京有限公司，批號DP121221）；iQTMSYBR? Green SuperMix 熒光試劑盒（美國Bio-Rad 公司，批號64148508）；蛋白酶K（Proteinase K，天根生化科技北京有限公司，批號DP121221）；裂解液GSL（天根生化科技北京有限公司，批號DP121221）。

1.3 儀器 RM2245 轉(zhuǎn)輪式切片機(jī)和Tp1020 自動組組脫水機(jī)（德國Leica 公司）；Nanodrop 2 000 分光光度計（美國Thermo Scicentific 公司）；CFX Connect 實時熒光定量PCR 儀（美國Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 分組及給藥 雄性昆明小鼠隨機(jī)分為空白組、藏藥佐太組（30 mg／kg）和HgCl2組（33.6 mg／kg）及七十味珍珠丸低、中、高劑量組（0.15、0.5、1.5 g／kg），每組5 只，灌胃給藥1 周，并記錄體質(zhì)量變化。末次給藥24 h 后，處死動物取材，收集各組小鼠小腸、大腸內(nèi)容物，提取DNA。

2.2 腸道病理學(xué)觀察 取小鼠回腸一段，甲醛（4%）固定，常規(guī)組織脫水，包埋，切片，HE 染色，在光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行觀察，并取影像拍片。

2.3 糞便DNA 提取 采用糞便基因組DNA 提取試劑盒進(jìn)行DNA 提取，將180～220 mg 糞便樣本放置裂解液GSL 中，90 ℃孵育10 min 破碎細(xì)菌，釋放DNA。用抑制劑吸附片InhibitEX 清除雜質(zhì)。上清液200 μL 移至新的離心管，加入蛋白酶K 去殘存蛋白。加入乙醇后上DNA 吸附柱，離心清洗后除雜質(zhì)后，用去酶水洗脫DNA。采用Nanodrop 2000 分光光度計檢測菌DNA 濃度及純度（A260／280 比值在1.8～2.1 視為合格），并用去酶水配置20 ng／μL DNA 備用。

2.4 qRT-PCR 測定 采用實時熒光定量PCR 儀進(jìn)行，配置15 μL PCR 反應(yīng)體系。SYBR ? GREEN PCR Master Mix 7.5 μL；上、下游引物預(yù)混液1 μL；0.1% DEPC 水3.5 μL；DNA 樣品3 μL。探針序列用Primer 3 來設(shè)計，見表1，其中總菌和其它4 個菌的序列來自文獻(xiàn) ［16-17］。反應(yīng)條件，95 ℃10 min，95 ℃15 s，60 ℃1 min，40 個循環(huán)；55～95 ℃，每0.5 ℃1 個循環(huán)，80 個循環(huán)做溶解曲線。取Ct 值用2-△△Ct公式計算，目的基因的表達(dá)量與同一標(biāo)本的內(nèi)參基因的表達(dá)量來校正，并與對照組為100%來計算相對的表達(dá)量。用總菌做為內(nèi)參。

3 結(jié)果

3.1 七十味珍珠丸對小鼠體質(zhì)量的影響 如圖1所示，給藥7 d 后，與空白組比較，七十味珍珠丸低、中、高劑量及藏藥佐太組小鼠體質(zhì)量無變化，HgCl2組大鼠體質(zhì)量下降（P＜0.05）。

圖1 七十味珍珠丸對小鼠體質(zhì)量的影響（， n＝5）Fig.1 Effects of Qishiwei Pearl Pills on body weight of mice（， n＝5）

表1 16S rRNA 引物序列Tab.1 16S rRNA sequence for PCR analysis

圖2 七十味珍珠丸對小鼠回腸組織形態(tài)的影響（HE，× 200）Fig.2 Effects of Qishiwei Pearl Pills on morphology of mice ileum（HE，× 200）

3.2 七十味珍珠丸對小鼠腸道病理的影響 如圖2 所示，與空白組相比，七十味珍珠丸高劑量和藏藥佐太口服給藥7 d 對小鼠腸（回腸）的組織學(xué)形態(tài)無明顯影響；而HgCl2（與藏藥佐太等汞量）口服給藥7 d，腸絨毛炎癥細(xì)胞浸潤。

3.3 七十味珍珠丸對變形菌門（Proteobacteria）腸桿菌科（Enterobacteriaceae）的影響 如圖3 所示，與空白組比較，七十味珍珠丸低、中、高劑量組小鼠小腸和大腸中內(nèi)容物的變形菌門腸桿菌科（Enterobacteriaceae）的表達(dá)（探針 Eco1457，U02514）增加（50～500 倍）（P＜0.05）；藏藥佐太組小鼠小腸內(nèi)容物中腸桿菌的表達(dá)增加（P＜0.05），而對小鼠大腸內(nèi)容物中的腸桿菌的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義。HgCl2組小腸內(nèi)容物中腸桿菌降低50%～70%（P＜0.05）。

3.4 七十味珍珠丸對小腸9 個腸菌科的影響 如表2 所示，與空白組比較，七十味珍珠丸低、中、高劑量組及藏藥佐太對小鼠小腸內(nèi)容物中的放線菌門（放線菌科、雙歧桿菌科、原小單胞菌科）、擬桿菌門-普雷沃氏菌科、厚壁菌門（厚壁菌科、乳桿菌科）的表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義，但HgCl2抑制放線菌門-原小單胞菌科、厚壁菌門-瘤胃球菌科／屬的表達(dá)（P＜0.05），促進(jìn)擬桿菌門-普雷沃氏科、厚壁菌門-乳桿菌科的表達(dá)（P＜0.05）；七十味珍珠丸低劑量組促進(jìn)擬擬桿菌門-紫單胞菌科、梭桿菌門-梭桿菌科的表達(dá)（P＜0.05），七十味珍珠丸高劑量組促進(jìn)厚壁菌門-瘤胃球菌屬科的表達(dá)（P＜0.05）。

3.5 七十味珍珠丸對大腸8 個腸菌科的影響 如表3 所示，與小腸不同，七十味珍珠丸對大腸內(nèi)容物中的放線菌門（放線菌科、雙歧桿菌科）、擬桿菌門-紫單胞菌屬、梭桿菌門-普雷沃氏菌科、梭桿菌科-梭桿菌科、厚壁菌門（瘤胃球菌科／屬、厚壁菌科、乳桿菌科）無影響；藏藥佐太組梭桿菌門-梭桿菌科下降（P＜0.05）；HgCl2組擬桿菌門-紫單胞菌屬下降（P＜0.05）。

4 討論

圖3 七十味珍珠丸對變形菌門和腸桿菌的影響（， n＝5）Fig.3 Effect of Qishiwei Pearl Pills on proteobacteria and enterobacter（， n＝5）

表2 七十味珍珠丸對小腸菌群的影響（%，， n＝5）Tab.2 Effects of Qishiwei Pearl Pills on small intestinal flora（%，， n＝5）

表2 七十味珍珠丸對小腸菌群的影響（%，， n＝5）Tab.2 Effects of Qishiwei Pearl Pills on small intestinal flora（%，， n＝5）

注：與空白組比較，?P＜0.05。

表3 七十味珍珠丸對大腸菌群的影響（%，， n＝5）Tab.3 Effects of Qishiwei Pearl Pills on large intestinal flora（%，， n＝5）

表3 七十味珍珠丸對大腸菌群的影響（%，， n＝5）Tab.3 Effects of Qishiwei Pearl Pills on large intestinal flora（%，， n＝5）

注：與空白組比較，?P＜0.05

本實驗發(fā)現(xiàn)七十味珍珠丸顯著增加小鼠小腸和大腸內(nèi)容物中的變形菌門（Proteobacteria）腸桿菌科（Enterobacteriaceae）的表達(dá)；藏藥佐太次之，但HgCl2反下降。七十味珍珠丸和藏藥佐太對小腸內(nèi)容物菌群的影響比對大腸內(nèi)容物菌群明顯。七十味珍珠丸對小腸和大腸內(nèi)容物的梭形菌門（Fusobacteria）有所增加，對小腸內(nèi)容物的中的普雷沃氏菌（Prevotella）和梭菌（Clostridaceae）有所增加，其作用有別于藏藥佐太。HgCl2對腸菌的影響與藏藥佐太相差很大，說明藏藥佐太（HgS）的作用不同于汞含有量相當(dāng)?shù)腍gCl2。

七十味珍珠丸是由藏醫(yī)南方學(xué)派代表人物蘇喀巴·年尼多杰于15 世紀(jì)中葉研制，18 世紀(jì)被收載于《藥方集萬部》 中，至今已有五百余年歷史，是傳統(tǒng)藏藥大組方藥品中的典型代表，現(xiàn)在已收載于中華人民共和國藥典2015 年版［1］，搞清其藥理作用機(jī)制是對七十味珍珠丸評價重要的一環(huán)［4，17］。七十味珍珠丸主治安神、鎮(zhèn)靜、通經(jīng)活絡(luò)、調(diào)和氣血等，相關(guān)適應(yīng)癥有癲癇、腦出血、腦梗死、中風(fēng)等。七十味珍珠丸對于慢性脂多糖＋MPTP 引起的神經(jīng)疾病具有明顯的改善作用，能減少黑質(zhì)中的多巴胺能神經(jīng)元的丟失，減少小膠質(zhì)細(xì)胞的激活，從而減輕脂多糖＋MPTP 引起的小鼠神經(jīng)炎癥。本課題組前期研究表明，七十味珍珠丸對脂多糖＋MPTP 引起的小鼠腸道菌群的變化也有一定的影響，能顯著防止疣微菌門（Verrucomicrobia）的增加，并能增加腸桿菌科（Enterobacteriaceae）的表達(dá)。所以此實驗進(jìn)一步探討七十味珍珠丸對正常小鼠腸道菌群的作用。本研究顯示七十味珍珠丸對正常小鼠的腸道菌群具有一定的調(diào)節(jié)作用，這對探討其藥理作用打開一個新的視野。

腸道菌群是一個龐大復(fù)雜的生態(tài)系統(tǒng)，與宿主之間保持一定的動態(tài)平衡，如果動態(tài)平衡被破壞，則會導(dǎo)致或者加重相應(yīng)的疾病，如代謝性疾?。?8］、肥胖、糖尿??；免疫性疾病腸道炎癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎；腫瘤結(jié)腸直腸癌、肝癌等等［8-10］。被稱為人體第二大腦的腸道菌群，主要是有厚壁菌門（Firmicutes，占 64%）、擬桿菌門（Bacteroidetes，占23%）、變形菌門（Proteobacteria，占8%）、放線菌門（Actinbacteria，占3%）的細(xì)菌所構(gòu)成［8］。本實驗主要研究了七十味珍珠丸及藏藥佐太對小鼠腸道菌群包括厚壁菌門、擬桿菌門、變形菌門、放線菌門及梭桿菌門（Fusobacteria）中部分細(xì)菌的影響。

七十味珍珠丸低、中、高劑量組及藏藥佐太組顯著升高小鼠小腸內(nèi)容物中變形菌門腸桿菌科（Enterobacteriaceae）的表達(dá)（Eco1457 和U02514），且七十味珍珠丸高劑量組增加最多，藏藥佐太組對兩種細(xì)菌的也有增加，但HgCl2組則下調(diào)其表達(dá)。七十味珍珠丸對小鼠小腸內(nèi)容物中擬桿菌門的普雷沃氏菌屬（Prevotella）細(xì)菌的表達(dá)呈升高趨勢，但隨著七十味珍珠丸劑量的增高，普雷沃氏菌的表達(dá)逐漸下降；與小腸相比，七十味珍珠丸對大腸內(nèi)容物中普雷沃氏菌細(xì)菌的表達(dá)無明顯作用，高劑量組表達(dá)下降，提示小腸菌比大腸菌更為敏感。與空白組相比，七十味珍珠丸對小腸和大腸內(nèi)容物的梭形菌門（Fusobacteria，探針KO235732）有所增加。

在健康腸道中厚壁菌門和擬桿菌門均屬厭氧菌，且數(shù)量較多，腸道在消化食物時，其可產(chǎn)生有益代謝物［19］。本實驗中，與空白組相比，七十味珍珠丸高劑量組對小鼠小腸內(nèi)容物中厚壁菌門的梭菌屬（Clostridium leptum，探針KU321269）有所增加。

在小腸中，放線菌門和厚壁菌門分布較多，屬于腸道中的益生菌，而益生菌是對機(jī)體有益作用的微生物，也是微生態(tài)系統(tǒng)中的重要組成部分［10］。七十味珍珠丸對放線菌門（Actinobacterias，探針Act-920F3，NR 113172，KP076663）無明顯影響。

藏藥佐太是七十味珍珠丸復(fù)方中的重要組成成分（約5.8%）［20-21］，本實驗中的藏藥佐太劑量約相當(dāng)于0.5 g／kg 的七十味珍珠丸，但其對于正常小鼠內(nèi)容物腸道菌群的影響不同于七十味珍珠丸。用約等汞量的HgCl2來比較，HgCl2對腸菌的作用不同于藏藥佐太，更不同于七十味珍珠丸。我們還發(fā)現(xiàn)藏藥佐太與不同汞化合物對小鼠的腸道病理、汞的蓄積以及腸道轉(zhuǎn)運(yùn)體和腸道菌群的作用是不一樣的［22］，而汞化合物的化學(xué)形式、價態(tài)的變化是影響其毒性及生物利用的主要方式。因此不宜以HgCl2或總汞含量來對含Hg 的傳統(tǒng)藥物來進(jìn)行安全性的評價［7，23］。本研究顯示七十味珍珠丸對正常小鼠的腸道菌群具有一定的調(diào)節(jié)作用，這對探討其藥理作用打開一個新的視野。