定振丸對帕金森病大鼠神經(jīng)遞質(zhì)及黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元氧化應(yīng)激的改善作用

霍綺雯譚 峰林東雄金培群

（廣東省佛山市中醫(yī)院，廣東 佛山528000）

帕金森是臨床中常見的錐體外系統(tǒng)疾病，中老年人群是高發(fā)群體。臨床調(diào)查發(fā)現(xiàn)，我國65 歲以上人群帕金森發(fā)病率約1.70%，以肌強直、靜止性震顫等運動異常為典型表現(xiàn)，且伴隨睡眠障礙、抑郁等非運動表現(xiàn)，對患者的生活造成嚴重影響［1］。目前帕金森病仍無根治方法，常采用美多芭干預(yù)治療，短期內(nèi)可獲得較好療效，但長期用藥可出現(xiàn)療效波動或減退、不良反應(yīng)增加的情況［2］。近年來，中醫(yī)藥在多種慢性疾病的治療中表現(xiàn)出療效好的優(yōu)點，在臨床中獲得廣泛認可。帕金森病屬中醫(yī)“顫證”范疇，多由肝腎陰虛引起，治療應(yīng)以補肝益腎、熄風止痙為主［3］。定振丸方出自《證治準繩·類方》，具有養(yǎng)血柔筋、熄風止痙的功效，臨床中已有應(yīng)用定振丸加減方治療帕金森病的報道［4］，但關(guān)于定振丸對帕金森兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)及黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元氧化應(yīng)激的影響及機制研究尚少。為此，本研究觀察定振丸對帕金森大鼠兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)及黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元氧化應(yīng)激的影響。

1 材料

1.1 動物 SPF 級雄性Wistar 大鼠，75 只，8 周齡，體質(zhì)量（200±20）g，購自南京大學模式動物研究所，生產(chǎn)許可證號SCXK（蘇）2018-0001。

1.2 藥物和試劑 中藥藥材（天麻、秦艽、全蝎、生地、熟地、當歸、川穹、白芍、防風、白術(shù)、黃芪、石決明、生牡蠣、鉤藤）均由廣州至信中藥飲片有限公司提供，符合 《中國藥典》2015 年版一部質(zhì)量標準。美多芭片（0.25 mg，上海羅氏制藥有限公司，國藥準字H10930198，批號SH2282）；多巴胺（DA）ELISA 檢測試劑盒（美國R＆D 公司，批號201503）；二羥基苯乙酸（DOPAC）ELISA 檢測試劑盒（美國R＆D 公司，批號201503）；高香草酸（HVA）ELISA 檢測試劑盒（美國R＆D 公司，批號201503）；5-羥色胺（5-HT）ELISA 檢測試劑盒（美國R＆D 公司，批號201503）；二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號123115160511）；酪氨酸羥化酶（TH）免疫組化試劑盒（美國Sigma 公司，批號101M4796）；丙二醛（MDA）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20161120）；超氧化物歧化酶（SOD）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批 號20160614）；谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號20161122）；原位凋亡檢測（TUNEL 法）試劑盒（瑞士羅氏公司，批號11684817910）；Bcl-2（英國Abcam 公司，貨號ab59348）；Bax 單抗（英國Abcam 公司，貨號ab182733）、山羊抗兔Bcl-2（英國Abcam 公司，批號ab97051）、Bax 多抗（二抗，英國Abcam 公司，貨號ab7832）。

1.3 儀器 SM2235R 切片機（徠卡顯微系統(tǒng)貿(mào)易公司），電泳儀、CheniDoc XRS 化學發(fā)光成像分析系統(tǒng)（美國Bio-Rad 公司）。

2 方法

2.1 定振丸制備 定振丸由天麻10 g、秦艽10 g、全蝎9 g、生地12 g、熟地15 g、當歸12 g、川穹10 g、白芍15 g、防風9 g、白術(shù)15 g、黃芪15 g、石決明20 g、生牡蠣20 g（先煎）、鉤藤15 g（后下）組成。加500 mL 蒸餾水浸泡30 min 后慢煎90 min，重復(fù)2 次，合并2 次水煎液，用高壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀將其濃縮至200 mL，使生藥質(zhì)量濃度為9.3 g／mL。

2.2 帕金森大鼠模型建立及分組干預(yù) 取75 只Wistar 大鼠，1% 戊巴比妥鈉腹腔麻醉后，立體儀上固定，顱頂去毛備皮，消毒后沿正中切開顱頂皮膚，暴露前囟，定位紋狀體，標出注藥點1（前囟前0.8 mm、中線右3.0 mm），注藥點2（前囟后0.2 mm、中線右2.7 mm、硬膜下5 mm），牙科鉆在標注帶開直徑2 mm 小孔。其中65 大鼠只用微量注射器在2 個注藥點分別注射2 μg／μL 含0.2%抗壞血酸的6-羥多巴胺（6-OHDA）各5 μL。剩余10 大鼠作為假手術(shù)組，注射等量生理鹽水，術(shù)后常規(guī)給予青霉素抗感染。造模1 周后，腹腔注射0.5 mg／kg 阿撲嗎啡誘發(fā)旋轉(zhuǎn)行為，觀察大鼠向左側(cè)逆時針旋轉(zhuǎn)速度＞210 r／30 min 則造模成功［5］。將造模成功大鼠隨機分為模型組、陽性組、定振丸低、中、高劑量組。根據(jù)體表面積法計算大鼠相當于成人的臨床等效劑量，低、中、高劑量組大鼠分別給予相當于成人1／2、1、2 倍的臨床等效劑量（生藥11.03、22.05、44.10 g／kg）的定振丸混懸液灌胃給藥，模型組和假手術(shù)組分別灌胃等體積生理鹽水，陽性組給予濃度為25 mg／mL 的美多芭混懸液1.67 mg／kg（溶劑為生理鹽水）灌胃，連續(xù)灌胃15 d。

2.3 組織取材 治療15 d 后脫頸法處死所有大鼠，迅速取出大腦，在冰面分離切取包含腦黑質(zhì)的腦組織，放入4%多聚甲醛中固定，取部分大腦黑質(zhì)置于-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4 兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)檢測 取大腦黑質(zhì)，加入磷酸鹽緩沖液（PBS），制備組織勻漿液，超聲破碎后，放于4 ℃、12 000 r／min 離心15 min，取上清液，0.22 μm 濾膜過濾，嚴格按照試劑盒說明書步驟操作，采用ELISA 法檢測腦黑質(zhì)中DA、DOPAC、HVA、5-HT 水平。

2.5 腦黑質(zhì)MDA、SOD、GSH-Px 檢測 取大腦黑質(zhì)勻漿上清液，采用MDA、SOD 及GSH-Px 檢測試劑盒，分別應(yīng)用硫代巴比妥那比色法、鄰苯三酚自氧化法和二硫代二硝基苯甲酸法檢測腦黑質(zhì)勻漿上清液中MDA、SOD 及GSH-Px 的水平。

2.6 腦黑質(zhì)TH 表達檢測 取固定腦組織，經(jīng)酒精梯度脫水，二甲苯透明后，常規(guī)制作石蠟切片（厚度為4 μm 的冠狀位切片），然后進行一步法免疫組化染色。切片常規(guī)脫蠟，然后用3% H2O2孵育10 min，PBS 沖洗3 次，3 min／次，然后滴加50 μL山羊血清工作液，室溫孵育10 min 后立即滴加一抗（1∶500）4 ℃搖床過夜，PBS 沖洗3 次，3 min／次，滴加生物素化二抗（1∶5 000），室溫孵育15 min 后PBS 沖洗3 次，3 min／次，顯色劑顯色后，蒸餾水沖洗，封片。顯微鏡下觀察腦黑質(zhì)，采用圖像分析軟件Image-pro Plus 5.0，每張切片取5 個不同視野，計算TH 陽性細胞率。

2.7 黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元細胞凋亡水平檢測取腦組織石蠟切片，脫蠟至水后，每張切片滴加50 μL 現(xiàn)配蛋白酶K 腸胃孵育15 min，PBS 沖洗后晾干，保鮮膜覆蓋放置于0.3% H2O2甲醇溶液，室溫放置5 min，然后用PBS 沖洗2 次、2 min／次，擦干周圍液體，滴加50 μL 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標記（TUNEL）工作液（含TDT 酶1 μL、熒光素標記dUTP 49 μL），于37 ℃避光60 min，PBS 洗滌3 次、2 min／次，擦干后，滴加50 μL SA-HRP工作液，37 ℃孵育30 min，加入DAB 顯色液顯色，蒸餾水終止，滴加蘇木素復(fù)染，自來水沖洗，常規(guī)脫水、待透明后，用中性樹脂封片。顯微鏡觀察腦黑質(zhì)，細胞染色為棕黃色或棕色判定凋亡細胞，計算細胞凋亡率。

2.8 腦黑質(zhì)中Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白表達檢測 取液氮研磨腦黑質(zhì)組織，加入50 μL 細胞裂解液，置于沸水浴8 min，離心后取上清液，BCA 法測定蛋白總量。取50 μg 樣品加入等體積上揚緩沖液，沸水浴3 min，然后12 000 r／min 離心10 min取上清液，進行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰氨凝膠電泳分離60 min 后，蛋白轉(zhuǎn)至硝酸纖維素膜NC 膜，加入封閉液室溫放置2 h，加入一抗（1∶1 000）4 ℃搖床孵育過夜，洗滌液沖洗后加入二抗（1∶5 000），常溫孵育30 min，暗室中顯影。以凝膠成像系統(tǒng)掃描拍照，并進行灰度值分析，以目的蛋白與內(nèi)參β-actin 的灰度值比值代表目的蛋白的相對表達量。

2.9 統(tǒng)計學分析 采用SPSS21.0 統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以（）表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用SNK 檢驗。以P＜0.05 表示差異具有統(tǒng)計學意義。

3 結(jié)果

3.1 大鼠一般狀態(tài) 75 只大鼠共65 只參與造模（10 只進行假手術(shù)），造模成功率為76.92%，其中7 只大鼠向左側(cè)逆時針旋轉(zhuǎn)速度＜210 r／30 min，5只未蘇醒或蘇醒后死亡，剔除實驗；假手術(shù)組10只均存活參與后續(xù)實驗。假手術(shù)組大鼠飲食、活動狀況均正常；模型組大鼠背毛黯淡無光、精神萎靡、喜臥、采食量下降，均出現(xiàn)肌肉震顫、抖動及四肢僵硬等典型帕金森癥狀，隨著時間的延長，上述狀態(tài)更加嚴重，部分大鼠出現(xiàn)驚厥或瀕死狀態(tài)；定振丸各劑量組隨著干預(yù)時間的延長癥狀緩解，精神及活動狀態(tài)有所改善，但仍較假手術(shù)組差，其中定振丸中劑量組與陽性組大鼠狀態(tài)相似，定振丸高劑量大鼠狀態(tài)最好，無驚厥和瀕死狀態(tài)。

3.2 兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平 與假手術(shù)組比較，模型組兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)DA、DOPAC、HVA、5-HT 水平降低（P＜0.05）；與模型組比較，定振丸低、中、高劑量組和陽性組均能以上指標均升高（P＜0.05）。見表1。

3.3 腦黑質(zhì)SOD、MDA、GSH-Px 水平 與假手術(shù)組比較，模型組SOD、GSH-Px 水平降低，MDA水平升高（P＜0.05）；與模型組比較，定振丸低、中、高劑量組和陽性組SOD、GSH-Px 水平升高，MDA 水平降低（P＜0.05）。見表2。

3.4 腦黑質(zhì)TH 陽性率及多巴胺能神經(jīng)元凋亡率 與假手術(shù)組比較，模型組TH 陽性率降低，DN 凋亡率升高（P＜0.05），與模型組比較，定振丸低、中、高劑量組和陽性組TH 陽性率升高，DN 凋亡率降低（P＜0.05）。見表3，圖1～2。

表1 定振丸對兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響（，μg·L-1）Tab.1 Effects of Dingzhen Pills on the levels of catecholamine neurotransmitters（，μg·L-1）

表1 定振丸對兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平的影響（，μg·L-1）Tab.1 Effects of Dingzhen Pills on the levels of catecholamine neurotransmitters（，μg·L-1）

注：與假手術(shù)組比較，?P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與定振丸低劑量組比較，▲P＜0.05；與定振丸中劑量組比較，※P＜0.05。

表2 定振丸對對腦黑質(zhì)SOD、MDA、GSH-Px 水平的影響（）Tab.2 Effects of Dingzhen Pills on SOD，MDA，GSH-Px levels in brain substantia nigra（）

表2 定振丸對對腦黑質(zhì)SOD、MDA、GSH-Px 水平的影響（）Tab.2 Effects of Dingzhen Pills on SOD，MDA，GSH-Px levels in brain substantia nigra（）

注：與假手術(shù)組比較，?P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與定振丸低劑量組比較，▲P＜0.05；與定振丸中劑量組比較，※P＜0.05。

表3 定振丸對腦黑質(zhì)TH 表達及多巴胺能神經(jīng)元凋亡的影響（）Tab.3 Effects of Dingzhen Pills on TH expression in brain substantia nigra and apoptosis of dopaminergic neurons（）

表3 定振丸對腦黑質(zhì)TH 表達及多巴胺能神經(jīng)元凋亡的影響（）Tab.3 Effects of Dingzhen Pills on TH expression in brain substantia nigra and apoptosis of dopaminergic neurons（）

注：與假手術(shù)組比較，?P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與定振丸低劑量組比較，▲P＜0.05；與定振丸中劑量組比較，※P＜0.05。

圖1 腦黑質(zhì)中TH 陽性表達（SP，×100）Fig.1 TH positive expression in the substantia nigra（SP，×100）

圖2 腦黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元凋亡（TUNEL，×100）Fig.2 Apoptosis of dopaminergic neurons in the substantia nigra（TUNEL，×100）

3.5 腦黑質(zhì)Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白表達 與假手術(shù)組比較，模型組Bcl-2 蛋白表達降低，Bax、caspase-3 蛋白表達升高（P＜0.05），與模型組比，定振丸低、中、高劑量組和陽性組Bcl-2 蛋白表達升高，Bax、caspase-3 蛋白表達降低（P＜0.05）。見表4、圖3。

表4 定振丸對腦黑質(zhì)中Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白表達的影響（）Tab.4 Effects of Dingzhen Pills on Bax，Bcl-2，caspase-3 protein expression in brain substantia nigra（）

表4 定振丸對腦黑質(zhì)中Bax、Bcl-2、caspase-3 蛋白表達的影響（）Tab.4 Effects of Dingzhen Pills on Bax，Bcl-2，caspase-3 protein expression in brain substantia nigra（）

注：與假手術(shù)組比較，?P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與定振丸低劑量組比較，▲P＜0.05；與定振丸中劑量組比較，※P＜0.05。

圖3 蛋白免疫印跡圖Fig.3 Picture of Western blot

4 討論

帕金森屬于慢性進展性神經(jīng)系統(tǒng)退化疾病，帕金森發(fā)病機制復(fù)雜，一旦發(fā)病則需終身干預(yù)治療［6-7］。美多芭由左旋多巴和周圍脫羧酶抑制劑芐絲肼組成，為老年帕金森患者的常用藥［8］，近期療效確切，但無法逆轉(zhuǎn)病情進展，且藥物的不良反應(yīng)明顯，遠期效果多不理想。帕金森屬于中醫(yī)“顫證”范疇，以老年久病者多發(fā)，長期氣血陰液匱乏、肝腎虧虛，導(dǎo)致陰虛陽盛、虛風內(nèi)動，治療關(guān)鍵在于養(yǎng)血柔筋。

本研究發(fā)現(xiàn)，定振丸干預(yù)后帕金森大鼠癥狀均有所緩解，且各劑量組兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平、SOD 水平、GSH-Px 水平、TH 陽性率均升高，MDA 水平、多巴胺能神經(jīng)元凋亡率均降低，提示定振丸對帕金森兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)及黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元氧化應(yīng)激均有改善作用，高劑量組定振丸效果最好。定振丸方中天麻、熟地為君藥，平肝熄風；黃芪為臣藥，健脾益氣；當歸、白芍、白術(shù)、川穹為佐藥，養(yǎng)血補精、榮養(yǎng)筋脈；秦艽、防風、全蝎為佐藥，辛溫發(fā)散、祛風通絡(luò)，諸藥合用，共奏平肝熄風、養(yǎng)血柔筋之效［9］。帕金森患者腦損傷后兒茶酚胺類神經(jīng)遞質(zhì)DA、DOPAC、HVA、5-HT水平會異常升高［10］，其升高后可造成神經(jīng)元細胞損傷。定振丸方中含有當歸，當歸水提取物中含有的有機酸類、多炔類等成分具有營養(yǎng)神經(jīng)和調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)水平的作用［11］。在患者帕金森病情進展中，腦組織中氧自由基大量產(chǎn)生，而氧自由基清除系統(tǒng)的缺陷可導(dǎo)致腦組織持續(xù)受到過氧化物損傷，引起黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元死亡［12-13］。另有研究發(fā)現(xiàn)［14］，黃芪水提物預(yù)處理后可改善大鼠腸系膜缺血再灌注后氧化應(yīng)激損傷，提示黃芪中的有效成分可能參與調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激水平。

此外，本研究中，定振丸各劑量組腦黑質(zhì)Bcl-2蛋白表達升高，Bax、caspase-3 蛋白表達量降低，提示定振丸對帕金森神經(jīng)遞質(zhì)及氧化應(yīng)激的改善作用可能與下調(diào)Bax、caspase-3、上調(diào)Bcl-2 蛋白表達，從而增加TH 免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元數(shù)目、抑制多巴胺能神經(jīng)元凋亡有關(guān)。TH 是酪氨酸羥化作用合成多巴胺的關(guān)鍵限速酶，是多巴胺能神經(jīng)元免疫組化的標記酶［15］。既往研究證實［16］，帕金森發(fā)病過程中伴隨多巴胺能神經(jīng)元持續(xù)凋亡，而線粒體依賴性細胞凋亡途徑是典型凋亡通路。Bcl-2 主要分布在線粒體中，通過調(diào)控膜電位傳遞、減少鈣離子釋放等途徑，發(fā)揮抗凋亡作用，Bax 通過競爭性抑制Bcl-2 活性，激活下游caspase-3，發(fā)揮促凋亡作用［17］。本研究中應(yīng)用定振丸干預(yù)后，大鼠腦黑質(zhì)中TH 陽性表達水平升高，且多巴胺能神經(jīng)元凋亡水平下降，推測定振丸可能通過上調(diào)Bcl-2 蛋白表達，并且下調(diào)Bax 蛋白表達，從而減少線粒體功能障礙，阻斷下游凋亡信號傳導(dǎo)，進而減少腦黑質(zhì)中多巴胺能神經(jīng)元的變性丟失和腦神經(jīng)元氧化應(yīng)激損傷，最終起抑制腦損傷作用。

綜上所述，定振丸具有改善帕金森大鼠神經(jīng)遞質(zhì)及黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元氧化應(yīng)激的作用，其中高劑量定振丸效果最佳，可能與下調(diào) Bax、caspase-3、上調(diào)Bcl-2 蛋白表達水平，從而增加TH免疫反應(yīng)陽性神經(jīng)元數(shù)目、抑制多巴胺能神經(jīng)元凋亡有關(guān)，但是否存在其他調(diào)控通路尚不確定，再進一步的研究中應(yīng)深入探討。