孕康口服液3 種成分測(cè)定及HPLC 指紋圖譜建立

余歡歡黃啟迪顏美秋笈文娜陳建真呂圭源

（浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江 杭州310053）

孕康口服液是由山藥、續(xù)斷、黃芪、當(dāng)歸、黃芩、白芍等藥材組成的中藥復(fù)方制劑，收載于2015 年版《中國(guó)藥典》一部，功效健脾固腎、養(yǎng)血安胎，主要用于腎虛型、氣血虛弱型先兆流產(chǎn)和習(xí)慣性流產(chǎn)?！吨袊?guó)藥典》 報(bào)道通過HPLC 法對(duì)方中芍藥苷、黃芩苷含有量分別進(jìn)行測(cè)定［1］，但兩者采用不同流動(dòng)相體系，而且缺少君藥有效成分的定量分析及整體質(zhì)量控制，顯得不夠全面，而且操作也繁瑣復(fù)雜。

續(xù)斷作為孕康口服液君藥，具有補(bǔ)肝腎、續(xù)筋骨、調(diào)血脈功效，川續(xù)斷皂苷Ⅵ是其主要有效成分，能保護(hù)骨組織［2-4］、肝臟［5-6］、心?。?］、神經(jīng)系統(tǒng)［8-9］等；并可促進(jìn)孕酮受體表達(dá)，從而起到維持懷孕的作用［10］。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇該成分及《中國(guó)藥典》 中黃芩苷、芍藥苷作為指標(biāo)，同時(shí)測(cè)定三者含有量，并建立孕康口服液HPLC 指紋圖譜，以期為提升該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。

1 材料

1.1 儀器 Agilent 1100 型高效液相色譜儀（美國(guó)安捷倫科技公司）；電子天平（十萬分之一，瑞士梅特勒-托利多公司）；純水儀（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 試劑與藥物 川續(xù)斷皂苷Ⅵ、黃芩苷、芍藥苷對(duì)照品（上海源葉生物科技有限公司，批號(hào)分別為Z18M10L83256、P20A9F59353、L07M9Q60533，純度≥98%）。16 批孕康口服液購(gòu)自杭州不同藥店，其中13 批為孕康口服液（回音必集團(tuán)浙江齊齊制藥有限公司，棕色，10 mL／支，編號(hào)S1～S13），3批為孕康口服液（江西濟(jì)民可信制藥有限公司，棕色，20 mL／支，編號(hào)S14～S16）。山藥、黃芪、當(dāng)歸、狗脊（去毛）、菟絲子、桑寄生、杜仲（炒）、補(bǔ)骨脂、黨參、茯苓、白術(shù)（焦）、阿膠、地黃、山茱萸、枸杞子、烏梅、砂仁、益智、苧麻根、艾葉均購(gòu)于浙江天冉中藥飲片有限公司，經(jīng)浙江中醫(yī)藥大學(xué)陳孔榮教授鑒定為正品。乙腈為色譜純；其他試劑均為分析純，均購(gòu)于華東醫(yī)藥股份有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 含有量測(cè)定

2.1.1 色譜條件及系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn) Agilent Eclipse XDB C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-0.1%磷酸（B），梯度洗脫（0～15 min，13% A；15～60 min，13%～40% A）；體積流量1.0 mL／min；檢測(cè)波長(zhǎng)230 nm（0～20 min，芍藥苷）、316 nm（20～45 min，黃芩苷）、212 nm（45～60 min，川續(xù)斷皂苷Ⅵ）；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。在此條件下，各成分色譜峰均能達(dá)到基線分離，理論塔板數(shù)按各成分計(jì)均不低于2 000。

2.1.2 溶液制備

2.1.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取對(duì)照品芍藥苷4.2 mg、黃芩苷4.9 mg、川續(xù)斷皂苷Ⅵ3.2 mg，置于50 mL 量瓶中，50%甲醇稀釋至刻度，即得（質(zhì)量濃度分別為84.0、98.0、64.0 μg／mL）。

2.1.2.2 供試品溶液 精密移取0.5 mL 本品，置于10 mL 量瓶中，50%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，0.22 μm 濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.1.2.3 陰性樣品溶液 按處方比例及工藝分別制備缺白芍、黃芩、續(xù)斷的陰性樣品，按“2.1.2.2”項(xiàng)下方法制備，即得。

2.1.3 方法學(xué)考察

2.1.3.1 線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液0.5、1、2、3、4、5 mL，置于5 mL 量瓶中，50%甲醇定容至刻度，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，見表1，可知各成分在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.1.3.2 專屬性考察 吸取對(duì)照品、供試品、陰性樣品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，結(jié)果見圖1。由此可知，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

2.1.3.3 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得芍藥苷、黃芩苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰面積RSD 分別為0.45%、0.42%、1.25%，表明儀器精密度良好。

2.1.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液（批號(hào)18051211），于0、3、6、9、12、15 h 在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得芍藥苷、黃芩苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰面積RSD 分別為1.07%、0.65%、2.08%，表明溶液在15 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.1.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取同一批本品（批號(hào)18051211）6 份，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得芍藥苷、黃芩苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ含有量RSD 分別為1.18%、1.17%、2.49%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.1.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 精密移取含有量已知的本品（批號(hào)18051211）0.35 mL 于25 mL 量瓶中，精密加入5 mL 對(duì)照品溶液，50%甲醇稀釋至刻度，搖勻，在“2.1.1”色譜條件項(xiàng)下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

2.1.4 樣品含有量測(cè)定 精密吸取不同批次本品適量，置于10 mL 量瓶中，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.1.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算含有量，結(jié)果見表3。

表2 各成分加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests for various constituents（n＝6）

表3 各成分含有量測(cè)定結(jié)果Tab.3 Results of content determination for various constituents

2.2 HPLC 指紋圖譜建立

2.2.1 色譜條件 同“2.1.1”項(xiàng)。

2.2.2 溶液制備 同“2.1.2”項(xiàng)。

2.2.3 方法學(xué)考察

2.2.3.1 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液（批號(hào)18051211），在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得相似度均為1.000，表明儀器精密度良好。

2.2.3.2 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液（批號(hào)18051211），于0、3、6、9、12、15 h 在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得相似度均高于0.999，表明溶液在15 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.2.3.3 重復(fù)性試驗(yàn) 精密吸取同一批本品（批號(hào)18051211），按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備6 份供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得相似度均高于0.999，表明該方法重復(fù)性良好。

2.2.4 指紋圖譜生成 取 16 批樣品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，再將相關(guān)數(shù)據(jù)導(dǎo)入“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A 版）”進(jìn)行分析，結(jié)果見圖2。

圖2 16 批樣品HPLC 指紋圖譜Fig.2 HPLC fingerprints for sixteen batches of samples

2.2.5 相似度分析 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（2004A 版）”進(jìn)行相似度評(píng)價(jià)，結(jié)果見表4。由此可知，A 廠家13 批樣品相似度整體較高，均高于0.981，故對(duì)其作進(jìn)一步考察；B 廠家3 批樣品相對(duì)較低，在0.944～0.954 之間。

2.2.6 共有峰指認(rèn) 各成分色譜峰在60 min 內(nèi)全部出現(xiàn)，本實(shí)驗(yàn)將峰面積較大、分離度較好者進(jìn)行標(biāo)定，共發(fā)現(xiàn)13 個(gè)共有峰，再采用中位數(shù)法，經(jīng)多點(diǎn)校正后生成對(duì)照?qǐng)D譜，見圖3。通過與對(duì)照品比較發(fā)現(xiàn)，5、8、12 號(hào)峰分別為芍藥苷、黃芩苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ，保留時(shí)間分別為14.1、38.0、48.3 min，其中8 號(hào)峰分離度、峰形較好，出峰時(shí)間居中，峰面積較大，故選擇其作為參照峰，標(biāo)號(hào)為8（S），計(jì)算其他共有峰相對(duì)保留時(shí)間、峰面積，結(jié)果分別見表5～6。

表4 16 批樣品相似度Tab.4 Similarities of sixteen batches of samples

3 討論

為了進(jìn)一步提升孕康口服液質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)選擇芍藥苷、黃芩苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ作為檢測(cè)指標(biāo)，參考文獻(xiàn)［1，11-13］，通過梯度洗脫結(jié)合波長(zhǎng)切換建立三者含有量同時(shí)測(cè)定的方法。2015 年版《中國(guó)藥典》 報(bào)道，芍藥苷、黃芩苷、川續(xù)斷皂苷Ⅵ檢測(cè)波長(zhǎng)分別為230、280、212 nm，而本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)在280 nm處黃芩苷峰面積較高，導(dǎo)致川續(xù)斷皂苷Ⅵ峰高在整體譜圖中偏低；由于黃芩苷在316 nm 處也有吸收，而且強(qiáng)度僅次于280 nm［14］，故選擇316 nm 作為其檢測(cè)波長(zhǎng)。

含有量測(cè)定結(jié)果顯示，不同廠家、批次孕康口服液中各成分含有量存在差異，可能是由于原藥材產(chǎn)地、采收季節(jié)等因素所致。2015 年版《中國(guó)藥典》 規(guī)定，孕康口服液中芍藥苷、黃芩苷含有量分別不得低于0.25、0.8 mg／mL，由此可知，本實(shí)驗(yàn)中16 批樣品均達(dá)標(biāo)。

圖3 各成分對(duì)照?qǐng)D譜Fig.3 Reference chromatogram of various constituents

表5 13 批樣品相對(duì)保留時(shí)間Tab.5 Relative retention time for thirteen batches of samples

表6 13 批樣品相對(duì)峰面積Tab.6 Relative peak areas for thirteen batches of samples

建立孕康口服液HPLC 指紋圖譜時(shí)發(fā)現(xiàn)，回音必集團(tuán)浙江亞東制藥有限公司生產(chǎn)的13 批樣品相似度均大于0.981，而江西濟(jì)民可信藥業(yè)有限公司生產(chǎn)的3 批樣品均大于0.944，表明各批次樣品間相似度較高，質(zhì)量穩(wěn)定。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)所采用的多指標(biāo)含有量測(cè)定結(jié)合HPLC 指紋圖譜可用于孕康口服液整體質(zhì)量控制，而且該方法操作簡(jiǎn)便，精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性良好，可為該制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提升提供參考。