一測多評法同時(shí)測定十味香鹿膠囊中5 種人參皂苷

張凱月李志成張 曄汪 濤努力扎黑沙甫張 輝

（長春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林省人參科學(xué)研究院，吉林 長春130117）

十味香鹿膠囊是長春中醫(yī)藥大學(xué)針對乳腺增生病癥自主研發(fā)的上市新藥，由人參、香附、鹿角脫盤等10 味藥材組成，具有疏肝解郁、軟堅(jiān)散結(jié)等功效，主治肝郁兼痰凝證所致乳腺疾病［1］。方中人參的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)是人參皂苷，對垂體-性腺軸的神經(jīng)內(nèi)分泌功能具有調(diào)節(jié)作用，能興奮垂體分泌促性腺激素，促進(jìn)DNA、蛋白質(zhì)合成相關(guān)酶蛋白的生物合成，使性腺活性增加，通過對垂體-性腺軸的雙向調(diào)節(jié)作用，平衡神經(jīng)內(nèi)分泌的正負(fù)反饋功能，從而降低異常增高的雌二醇，并使卵巢激素控制的乳腺細(xì)胞增生得到抑制，故建立與本品藥效相關(guān)的人參皂苷質(zhì)量控制方法具有重要意義。目前，十味香鹿膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)制定了人參、莪術(shù)、蜈蚣、浙貝母TLC 定性鑒別，以及浙貝母中貝母素甲，人參中人參皂苷Rb1、Re、Rg1定量測定，但尚未進(jìn)行一測多評測定。

由于對照品在質(zhì)量控制中的稀缺性與昂貴性，故一測多評廣泛應(yīng)用于中藥質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)的建立［2-4］，它是根據(jù)中藥各成分比例關(guān)系選擇某一內(nèi)在成分作為內(nèi)標(biāo)，通過測定內(nèi)標(biāo)與其他成分之間的相對校正因子計(jì)算含有量，從而減少對照品使用量，降低成本［5-6］。2015 年版《中國藥典》 中人參皂苷Rb1作為人參檢測指標(biāo)，它含有量高，對照品易得［7］，故本實(shí)驗(yàn)選擇其作為內(nèi)標(biāo)，計(jì)算十味香鹿膠囊中人參皂苷Rb3、Re、Rf、Rg1含有量，以期為該制劑質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

Agilent 1260 型高效液相色譜儀（美國Agilent公司）；BP211D 型電子天平（德國Sartorius 公司）；WP-UP-III-40 型超純水系統(tǒng)（四川沃特爾科技發(fā)展有限公司）。人參皂苷Rb1、Rb3、Re、Rf、Rg1對照品（批號分別為110704-201827、111686-201504、110754-201827、111719-201505、110703-201128）購于中國食品藥品檢定研究院。十味香鹿膠囊（每粒重0.5 g，批號分別為181001、181002、190101、190102、190501、190502）購于吉林華康藥業(yè)股份有限公司。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件Agilent EC-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）；流動(dòng)相乙腈（A）-水（B），梯度洗脫（0～60 min，19%～30%A；60～120 min，30%～50%A）；體積流量0.5 mL／min；柱溫25 ℃；檢測波長203 nm；進(jìn)樣量3 μL。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液 精密稱取對照品人參皂苷Rb12.04 mg、Rb32.04 mg、Re 2.02 mg、Rf 2.02 mg、Rg12.01 mg，少量甲醇溶解定容至10 mL 量瓶中，即得。

2.2.2 供試品溶液 取本品粉末（過四號篩），精密稱取1.000 2 g 至50 mL EP 管中，30 mL 甲醇超聲（250 W、50 kHz）處理1 h，過濾，蒸干，蒸干物溶于少量水中，二氯甲烷、乙酸乙酯、水飽和正丁醇各20 mL 依次萃取3 次，合并上層萃取液，蒸干，甲醇溶解定容至5 mL 量瓶中，即得。

2.2.3 陰性樣品（缺人參）溶液 將蜈蚣研磨成細(xì)粉狀，精密稱取1.002 5 g；取香附50.002 8 g、莪術(shù)30.012 4 g、薤白30.011 3 g，加4 倍量水，水蒸氣蒸餾法提取6 h 得到揮發(fā)油，蒸餾后的水溶液另外收集；取鹿角脫盤3.012 2 g、鱉甲3.002 4 g，加6 倍量水煎煮6 h，煎液另外收集；取浙貝母6.024 1 g、天冬6.012 5 g、桔梗3.002 6 g，與上述藥渣合并，4 倍量水煎煮3 次，每次2 h，濾過，濾液與收集的水溶液合并，濃縮至相對密度1.21～1.25（80 ℃），加無水乙醇使其含醇量達(dá)70%，靜置24 h，濾過，濃縮成相對密度1.21～1.25（80 ℃）的稠膏，加入蜈蚣細(xì)粉，置通風(fēng)處干燥，研磨成細(xì)粉，與揮發(fā)油混勻，即得。

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 系統(tǒng)適應(yīng)性試驗(yàn)與專屬性考察 取對照品、供試品、陰性樣品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下各進(jìn)樣3 μL 測定，結(jié)果見圖1。由此可知，陰性無干擾，表明該方法專屬性良好。

2.3.2 線性關(guān)系考察 吸取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液1、2、4、6、8、10 μL，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸，結(jié)果見表1，可知各人參皂苷在各自范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.3.3 精密度試驗(yàn) 取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定6 次，測得人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb3峰面積RSD 分別為1.23%、2.46%、1.42%、1.83%、1.79%，表明儀器精密度良好。

圖1 各人參皂苷HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various ginsenosides

表1 各人參皂苷線性關(guān)系Tab.1 Linear relationships of various ginsenosides

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取同一供試品溶液，于0、3、6、9、12、24 h 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb3峰面積 RSD 分別為 1.49%、1.04%、1.39%、1.36%、1.75%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.5 重復(fù)性試驗(yàn) 取本品（批號190502），按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，測得人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb3含有量 RSD 分別為1.82%、1.43%、1.89%、2.00%、1.92%，表 明該方法重復(fù)性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn) 取含有量已知的本品（批號190502），研成細(xì)粉，平行精密稱取6 份，分別 為0.200 4、0.200 8、0.200 6、0.200 4、0.200 3、0.200 2 g，按1∶1 比例加入對照品溶液，按“2.2.2”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表2。

表2 各人參皂苷加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab.2 Results of recovery tests for various ginsenosides（n＝6）

2.3.7 相對校正因子測得［8-9］吸取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定。以人參皂苷Rb1為內(nèi)標(biāo)，分別采用斜率法、多點(diǎn)校正法［10-11］計(jì)算其他4 種人參皂苷的相對校正因子（f），結(jié)果見表3，可知2 種方法所得結(jié)果接近［相對誤差（RE）＜3.0%］。

表3 各人參皂苷相對校正因子Tab.3 Relative correction factors of various ginsenosides

2.3.8 色譜峰定位［12］以人參皂苷Rb1為內(nèi)標(biāo)，測定其他4 種人參皂苷的相對保留值（RT）以定位色譜峰，結(jié)果見表4，可知定位重復(fù)性良好。

2.4 耐用性試驗(yàn)

2.4.1 相對校正因子 吸取“2.2.1”項(xiàng)下對照品溶液適量，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，多點(diǎn)校正法考察Agilent 1260、Agilent 1100 Series色譜儀，以及Agilent EC-C18、Zorbax SB-C18、Extend-C18色譜柱對相對校正因子的影響，結(jié)果見表5，可知均無明顯影響。

表4 各人參皂苷相對保留值（n＝6）Tab.4 Relative retention values of various ginsenosides（n＝6）

表5 不同儀器、色譜柱對相對校正因子的影響Tab.5 Effects of different instruments and columns on relative correction factors

2.4.2 色譜峰定位 按“2.3.8”項(xiàng)下方法考察“2.4.1”項(xiàng)下儀器、色譜柱對相對保留值的影響，結(jié)果見表6，可知均無明顯影響。

表6 不同儀器、色譜柱對相對保留值的影響Tab.6 Effects of different instruments and columns on relative retention values

2.5 樣品含有量測定 取6 批本品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法各平行制備6 份供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測定，分別采用外標(biāo)法和一測多評法計(jì)算含有量，結(jié)果見表7，可知2 種方法所得結(jié)果相近［相對誤差（RE）＜3.0%］。

3 討論

3.1 供試品溶液制備 十味香鹿膠囊由10 味藥材組成，成分復(fù)雜，考察各人參皂苷含有量時(shí)常伴有其他組分干擾，故供試品溶液制備是定量測定的關(guān)鍵因素。本實(shí)驗(yàn)采用不同極性的溶劑（如二氯甲烷、乙酸乙酯、正丁醇等）以除去極性較低的脂溶性雜質(zhì)，以及極性較高的水溶性雜質(zhì)，與《中國藥典》 方法相比色譜峰分離度高，峰形良好。

3.2 一測多評法測定［13］本實(shí)驗(yàn)分別采用多點(diǎn)校正法和斜率法對一測多評法所得相對校正因子進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)RE＜3.0%，表明2 種方法無明顯差異。另外，RTRi／s在給定的條件下相對穩(wěn)定，可作為初步定位的依據(jù)。

表7 各人參皂苷含有量測定結(jié)果（mg／粒， n＝6）Tab.7 Results of content determination for various ginsenosides（mg／capsule， n＝6）

4 結(jié)論

本研究建立一測多評法同時(shí)測定十味香鹿膠囊中人參皂苷Rg1、Re、Rf、Rb1、Rb3的含有量，該方法操作簡單，穩(wěn)定可靠，解決了相關(guān)對照品缺失、成本高昂等問題，從而更有效地控制該制劑質(zhì)量。