四味土木香散揮發(fā)油的β-環(huán)糊精包合工藝

李 娜劉德旺趙紅梅杭凌宇張 屏包保全

（內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 呼和浩特010110）

四味土木香散為蒙醫(yī)治療流感等瘟疫熱病的經(jīng)典方和基礎(chǔ)方，經(jīng)辯證加味可形成62 方，1977 年首次作為民族藥載入《中國藥典》。該方由土木香、苦參、懸鉤子木、山柰4 味藥材粉碎成粗粉后混勻制成（微煎），其氣香，味極苦、微辛，具有清溫解表功效，用于瘟病初期、發(fā)熱發(fā)冷、頭痛咳嗽、咽喉腫痛、胸脅作痛等癥［1］。方中揮發(fā)油是主要活性成分，其中土木香揮發(fā)油所含土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯具有驅(qū)蟲、抗菌等作用，而山柰揮發(fā)油所含對(duì)甲氧基桂皮酸乙酯、肉桂酸乙酯具有抗癌、抑菌、興奮腸道平滑肌等作用［2-4］。

揮發(fā)油為多種類型成分的混合物，包括脂肪族、芳香族、含硫含氮化合物，但更多的為單萜、倍半萜、含氧衍生物，并根據(jù)其比重不同分為輕油和重油，它在光、氧條件下極易氧化變質(zhì)，從而影響復(fù)方療效。β-環(huán)糊精是由7 個(gè)葡萄糖分子組成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)化合物，其立體結(jié)構(gòu)類似空心圓臺(tái)，內(nèi)部以氧原子為主，具有疏水性；外部以羥基為主，具有親水性，因此能與難溶性藥物形成包合物，從而增加藥物在水中的溶出度，同時(shí)避免藥物與光、熱、水、氧的直接接觸，進(jìn)而提高其穩(wěn)定性［5-7］。本實(shí)驗(yàn)采用β-環(huán)糊精包合混合揮發(fā)油，通過正交試驗(yàn)對(duì)包合工藝進(jìn)行優(yōu)化，并對(duì)其進(jìn)行穩(wěn)定性考察。

1 材料

1.1 儀器 高效液相色譜系統(tǒng)（配置LC-20AD 色譜泵、SPD-20AXR 二極管陣列檢測(cè)器、Labsolution Version 5.71 SP1 工作站）、IRAffinity-1 紅外分光光度計(jì)（日本島津公司）；AB135-S 電子天平（0.01 mg，瑞士梅特勒-托利多公司）；MYP11-2磁力攪拌器（上海梅影儀器儀表制造有限公司）；DZ3320A 差熱分析儀（南京大展機(jī)電技術(shù)研究所）；S-4800 掃描電鏡（日本日立公司）。

1.2 試劑與藥物 土木香內(nèi)酯（LPT2014005）、異土木香內(nèi)酯（LPT2014011）、對(duì)甲氧基桂皮酸乙酯（110835-201603）對(duì)照品均購自中國食品藥品檢定研究院；肉桂酸乙酯對(duì)照品（MAYA-CR5019）購自浙江瑪雅試劑有限公司；β-環(huán)糊精（天津市大茂化學(xué)試劑廠）；甲醇、乙腈為色譜純（美國Fisher 公司）；其余試劑均為分析純；水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 包合物制備［8-10］采用飽合水溶液法。稱取4 g β-環(huán)糊精置于250 mL 具塞錐形瓶中，加入100 mL純化水，置于恒溫磁力攪拌器上加熱溶解，待溶解完畢、溫度升至50 ℃時(shí)，緩慢滴加含揮發(fā)油的乙醇（1∶10），繼續(xù)恒溫?cái)嚢? h，取出，置于冰箱中冷藏24 h，快速抽濾，20 mL 水洗滌后再用石油醚洗滌3 次，每次10 mL，40 ℃減壓真空干燥器中干燥4 h，即得。

2.2 包合率、收率測(cè)定

2.2.1 空白回收率 采用2015 年版《中國藥典》揮發(fā)油測(cè)定法（通則2204）［11］。取300 mL 水，置于裝有沸石的圓底燒瓶中，連接揮發(fā)油測(cè)定器，移液管加1 mL 二甲苯于揮發(fā)油測(cè)定器中，加熱沸騰蒸餾30 min 后停止加熱，放置15 min，讀取二甲苯容積。取1 mL 揮發(fā)油至圓底燒瓶中，連接測(cè)定器加熱沸騰蒸餾約5 h，至測(cè)定器中油量不再增加時(shí)停止加熱，放置1 h，讀取揮發(fā)油體積，自油層中減去二甲苯量，即為揮發(fā)油量，平行3 次，計(jì)算平均值，公式為空白回收率＝餾出流量／加入揮發(fā)油量×100%，測(cè)得空白回收率為71%。

2.2.2 包合率 采用2015 年版《中國藥典》 揮發(fā)油測(cè)定法（通則2204）。稱取“2.1”項(xiàng)下包合物置于圓底燒瓶中，按“2.2.1”項(xiàng)下方法讀取揮發(fā)油體積，計(jì)算包合率，公式為包合率＝包合物中揮發(fā)油體積／加入揮發(fā)油體積×100%，測(cè)得包合率為74.12%。

2.2.3 收率 取“2.1”項(xiàng)下包合物計(jì)算收率，公式為收率＝包合物實(shí)際質(zhì)量／（β-環(huán)糊精、揮發(fā)油總加入量）×100%，測(cè)得收率為83.12%。

2.3 指標(biāo)性成分含有量、包封率測(cè)定［12］

2.3.1 色譜條件 Diamonsil C18色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相乙腈-0.1% 磷酸（55∶45）；體積流量1.0 mL／min；檢測(cè)波長210 nm（土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯）、254 nm（對(duì)甲氧基桂皮酸乙酯、肉桂酸乙酯）；柱溫25 ℃；進(jìn)樣量20 μL。色譜圖見圖1。

圖1 不同波長下各成分HPLC 色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of various constituents under different wavelengths

2.3.2 對(duì)照品溶液制備 稱取土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯、對(duì)甲氧基桂皮酸乙酯、肉桂酸乙酯對(duì)照品各約2 mg，置于10 mL 量瓶中，甲醇溶解并稀釋至刻度，制成每1 mL 分別含四者201.1、198.7、203.5、202.2 μg 的溶液，即得。

2.3.3 揮發(fā)油供試品溶液制備 稱取揮發(fā)油約100 mg，置于50 mL 量瓶中，甲醇超聲處理后定容至刻度，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3.4 包合物供試品溶液制備 稱取包合物約500 mg，置于50 mL 量瓶中，甲醇超聲處理后定容至刻度，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3.5 空白樣品溶液制備 按照四味土木香處方比例不加揮發(fā)油，按“2.1”項(xiàng)下方法制備陰性樣品，稱取約500 mg，置于50 mL 量瓶中，甲醇超聲處理后定容至刻度，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液，即得。

2.3.6 線性關(guān)系考察 分別取對(duì)照品溶液0.2、0.5、1、2、5 mL，加甲醇稀釋定容至25 mL，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定。以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y）進(jìn)行回歸。結(jié)果，土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯、對(duì)甲氧基桂皮酸乙酯、肉桂酸乙酯方程分別為Y＝61.32X-8.32（r＝0.999 7）、Y＝58.94X-17.42（r＝0.999 6）、Y＝26.65X＋9.24（r＝0.999 8）、Y＝32.67X＋11.35（r＝0.999 7），均在8.0～200.0 μg／mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

截至2016年底，我國已并網(wǎng)發(fā)電的秸稈直燃發(fā)電項(xiàng)目近260個(gè)，累計(jì)并網(wǎng)裝機(jī)容量約為6400MW。主要分布在山東省、安徽省、黑龍江省、江蘇省、河北省、湖北省、吉林省、河南省、湖南省、山西省。

2.3.7 精密度試驗(yàn) 取“2.3.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定6 次，測(cè)得土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯、對(duì)甲氧基桂皮酸乙酯、肉桂酸乙酯峰面積RSD 分別為1.5%、1.8%、1.2%、1.5%，表明儀器精密度良好。

2.3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取“2.3.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液，于0、2、4、6、8、12、24 h 在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯、對(duì)甲氧基桂皮酸乙酯、肉桂酸乙酯峰面積RSD 分別為2.0%、1.6%、1.2%、1.5%，表明溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.9 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批包合物，按“2.3.4”項(xiàng)下方法平行制備6 份供試品溶液，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)得土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯、對(duì)甲氧基桂皮酸乙酯、肉桂酸乙酯含有量RSD 分別為1.5%、1.6%、1.2%、1.9%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.3.10 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取含有量已知的包合物25 mg，共9 份，土木香內(nèi)酯、異土木香內(nèi)酯、對(duì)甲氧基桂皮酸乙酯、肉桂酸乙酯含有量分別為8.87、11.4、13.8、4.3 mg，加入0.8、1.0、1.2 倍量對(duì)照品溶液，按“2.3.4”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，在“2.3.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算回收率。結(jié)果，各成分平均加樣回收率分別為99.30%、98.47%、98.45%、100.7%，RSD分別為2.1%、1.2%、1.7%、1.7%。

2.3.11 包封率測(cè)定 公式為包封率＝m包／m總×100%，其中m包為包合β-環(huán)糊精揮發(fā)油中4 種成分總含有量，m總為未包合揮發(fā)油中4 種成分總含有量，測(cè)得包封率為78.16%。

2.4 正交試驗(yàn) 通過預(yù)實(shí)驗(yàn)及文獻(xiàn)查閱［13］發(fā)現(xiàn)，影響揮發(fā)油包合的主要因素為β-環(huán)糊精與揮發(fā)油比例（A）、包合溫度（B）、攪拌時(shí)間（C），故選取上述3 個(gè)因素，各因素取3 個(gè)水平，按L9（34）正交表設(shè)計(jì)試驗(yàn)，因素水平見表1。

表1 因素水平Tab.1 Factors and levels

以包合率、收率、包封率為評(píng)價(jià)指標(biāo)，其中包合率作為主要指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)設(shè)定為0.6；收率、包封率作為次要指標(biāo)，權(quán)重系數(shù)均設(shè)定為0.2，再將9 批試驗(yàn)中各指標(biāo)最大者計(jì)為1，其余按比例折算后乘以相應(yīng)權(quán)重系數(shù)再求和，作為綜合評(píng)分。結(jié)果見表2，方差分析見表3。

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果Tab.2 Design and results of tests

表3 方差分析Tab.3 Analysis of variance

由表2 可知，各因素影響程度依次為A＞C＞B；由表3 可知，因素A、C對(duì)包合效果有顯著影響（P＜0.05），而B無顯著影響（P＞0.05）。因此，確定最優(yōu)包合工藝為A2B2C3，即揮發(fā)油與β-環(huán)糊精比例4∶1，包合溫度50 ℃，攪拌時(shí)間2 h。

2.6 包合物表征

2.6.1 TLC 精密稱取揮發(fā)油0.5 g（1 份）、包合物1.0 g（2 份），置于10 mL 量瓶中，乙醇定容至刻度，1 份包合物于乙醇中超聲處理45 min，濾過，取續(xù)濾液；另1 份包合物溶于乙醇中，不作任何處理。土木香薄層色譜法按照2015 年版《中國藥典》 四部通則0502 項(xiàng)下薄層色譜法，將揮發(fā)油、包合物點(diǎn)樣于同一用0.25%硝酸銀溶液制備的硅膠G 薄層板上，以石油醚（69～70 ℃）-甲苯-乙酸乙酯（10∶1∶1）為展開劑，10 ℃以下避光展開2 次，取出，晾干，噴以5% 茴香醛硫酸溶液，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰；山柰薄層色譜法按照相同方法，將揮發(fā)油、包合物點(diǎn)樣于同一GF254薄層板上，以正己烷-乙酸乙酯（18∶1）為展開劑，展開，取出，晾干，置于紫外燈（254 nm）下檢視，結(jié)果見圖2。由此可知，供試品色譜在與對(duì)照藥材相應(yīng)位置上顯相同顏色斑點(diǎn)；解包后包合物斑點(diǎn)及Rf值與揮發(fā)油一致，而未解包者無對(duì)應(yīng)斑點(diǎn)，表明揮發(fā)油包合前后主要成分基本一致，成功包入β-環(huán)糊精空腔中。

表4 驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果（n＝3）Tab.4 Results of verification tests（n＝3）

圖2 樣品TLC 色譜圖Fig.2 TLC chromatograms of samples

2.6.2 差式掃描量熱（DSC）取揮發(fā)油、β-環(huán)糊精、揮發(fā)油與β-環(huán)糊精物理混合物（1∶4）、包合物適量，在氮?dú)猸h(huán)境下進(jìn)行DSC 掃描，升溫速度10 ℃／min，溫度范圍15～350 ℃，結(jié)果見圖3。由此可知，揮發(fā)油、β-環(huán)糊精在108、120 ℃分別有1 個(gè)明顯吸熱峰；物理混合物在上述2 種溫度下均有明顯吸熱峰；包合物DSC 曲線未出現(xiàn)揮發(fā)油、β-環(huán)糊精吸收峰，僅在80 ℃出現(xiàn)1 個(gè)弱峰，而且峰形、峰面積均有變化，表明包合物不是簡單的混合物，可能生成了新物相，同時(shí)揮發(fā)油已包埋于β-環(huán)糊精分子空腔內(nèi)。

圖3 樣品DSC 曲線Fig.3 DSC curves for samples

2.6.3 傅里葉變換紅外光譜（FTIR）取揮發(fā)油、β-環(huán)糊精、物理混合物、包合物適量，加入適量KBr 混合均勻，壓制成片，在4 000～400 cm-1波數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行紅外特征測(cè)定，結(jié)果見圖4。由此可知，包合后揮發(fā)油在1 716.64、1 604.77、1 514.12、1 265.30 cm-1等處的吸收峰已經(jīng)消失或明顯減弱，而在物理混合物中仍然存在，表明揮發(fā)油進(jìn)入β-環(huán)糊精空腔，其紅外振動(dòng)受到限制；包合物特征峰與β-環(huán)糊精相似，峰形相同，但前者在1 423.46、1 367.53 cm-1處出現(xiàn)新吸收峰，表明兩者是不同物相；物理混合物整體紅外吸收特征與β-環(huán)糊精相似，但紅外吸收中存在大量較弱的吸收峰，表明其紅外圖譜是由吸收較強(qiáng)的β-環(huán)糊精紅外圖譜與吸收較弱的揮發(fā)油紅外圖譜加和而成的。

圖4 樣品FTIR 圖譜Fig.4 FTIR spectra for samples

2.6.4 掃描電鏡（SEM）取β-環(huán)糊精、包合物適量，經(jīng)導(dǎo)電膠粘樣、噴金鍍膜處理后觀察其形態(tài)學(xué)特征，結(jié)果見圖5。由此可知，β-環(huán)糊精為不規(guī)則板狀的晶體，并帶有細(xì)碎顆粒；包合物為表面光滑的塊狀結(jié)晶，無裂紋，與前者相比其形態(tài)和晶型發(fā)生了重大變化，表明可能形成包合物。

2.7 穩(wěn)定性考察［12］稱取包合物、物理混合物各3 份，每份4 g，密封于玻璃瓶中，分別在強(qiáng)光［（4 500±500）lx］、高濕（90%，25 ℃）、高溫（60 ℃）條件下放置10 d，于0、3、7、10 d 取樣，測(cè)定揮發(fā)油相對(duì)含有量，結(jié)果見表5。由此可知，包合物揮發(fā)油含有量在3、7、10 d 呈下降趨勢(shì)，但程度緩慢，而物理混合物下降非常明顯，表明包合物穩(wěn)定性明顯優(yōu)于物理混合物，并且高溫、高濕對(duì)揮發(fā)油穩(wěn)定性具有明顯影響。

圖5 樣品SEM 圖Fig.5 SEM images for samples

表5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（%， n＝3）Tab.5 Result of stability tests（%， n＝3）

3 討論

四味土木香散中土木香、山柰揮發(fā)油是重油、輕油混合揮發(fā)油，整體偏重，本實(shí)驗(yàn)在提取揮發(fā)油時(shí)采用2015 年版《中國藥典》 揮發(fā)油測(cè)定法（通則2204）乙法進(jìn)行測(cè)定，再通過飽和水溶液法對(duì)其進(jìn)行包合［14-16］。水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油時(shí)，從揮發(fā)油提取器上只能讀出揮發(fā)油總體積，而不能測(cè)得其主要有效成分含有量，所得工藝與有效成分或療效的相關(guān)性不強(qiáng)；正交試驗(yàn)所優(yōu)選包合工藝中測(cè)得的包合率與最大包封率有所差異，可能是穩(wěn)定性較差的成分在包合過程中發(fā)生結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化，導(dǎo)致其含有量降低，故本實(shí)驗(yàn)以最優(yōu)包合工藝中的包合率作為主要評(píng)價(jià)指標(biāo)，包合率、揮發(fā)油包封率為次要指標(biāo)，對(duì)工藝進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。

四味土木香散是復(fù)方制劑，土木香、山柰揮發(fā)油共同包合時(shí)可減少單獨(dú)包合工作量，提高制劑穩(wěn)定性，可為相關(guān)新劑型的研發(fā)奠定基礎(chǔ)。