樣品保存液在豬口腔液檢測(cè)中的應(yīng)用

柴偉東

（勃林格殷格翰動(dòng)物保?。ㄉ虾＃┯邢薰荆虾?200040）

近些年來(lái)，國(guó)內(nèi)外動(dòng)物醫(yī)學(xué)界對(duì)豬口腔液的研究報(bào)道日漸增多和深化，特別是國(guó)內(nèi)非洲豬瘟發(fā)生以來(lái)，多個(gè)研究證實(shí)口腔液中的病毒檢出時(shí)間點(diǎn)比血液中早1～4 d[1]，表面口腔液可作為血清樣品的替代品，早期監(jiān)測(cè)和評(píng)估豬群整體健康狀況的診斷樣品。豬口腔液由唾液和血清滲出液組成，除水分之外還有具有生物效能的黏液素、淀粉酶、溶菌酶、脂肪酶等成分，同時(shí)豬口腔液中有大量的細(xì)菌及外界的糞便、飼料等復(fù)雜成分。

目前普遍認(rèn)可的口腔液保存方法是將樣品置于生理鹽水中，儲(chǔ)運(yùn)在有藍(lán)冰（冰袋）的條件下，溫度可維持在0～8 ℃，最好在24 h內(nèi)檢測(cè)。在實(shí)踐中，大量樣品的采集持續(xù)時(shí)間較久，樣品并沒(méi)有一直維持在冷藏環(huán)境中，有時(shí)候運(yùn)輸距離也較遠(yuǎn)，時(shí)間超過(guò)了24 h，用常規(guī)的生理鹽水方法保存和運(yùn)輸樣品，使得口腔液樣品中的核酸酶及細(xì)菌大量增殖產(chǎn)生的蛋白成分可能會(huì)導(dǎo)致其中的病毒核酸容易降解，進(jìn)而影響核酸提取質(zhì)量及檢測(cè)結(jié)果。針對(duì)病毒特性和不同類(lèi)型的樣品特點(diǎn)，應(yīng)確定相應(yīng)的儲(chǔ)運(yùn)溫度和樣品保護(hù)液的使用。

表1 引物和探針序列

1 材料和方法

1.1 豬口腔液樣品的采集

在早晨飼喂前，豬只最活躍的狀態(tài)下采集口腔液。取直徑1.6 cm，長(zhǎng)度1 m的棉繩，將兩端松散，兩端下垂懸掛在飼喂欄上，繩子盡量離開(kāi)地面和污染的欄柱，繩子末端與豬肩胛部高度相同，保證豬容易接觸到，讓豬自由咀嚼30 min，將棉繩濕潤(rùn)的末端放入密封袋，用力擠壓，將擠出來(lái)的口腔液轉(zhuǎn)移到離心管中。樣品運(yùn)輸?shù)綄?shí)驗(yàn)室后對(duì)樣品不進(jìn)行離心處理，直接冷凍保存。

1.2 實(shí)驗(yàn)環(huán)境

所有實(shí)驗(yàn)步驟均在生物安全二級(jí)（BSL-2）實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成，其中病毒參考品的制備，樣品分組以及樣品核酸提取均在生物安全柜內(nèi)操作。

1.3 參考品的制備

對(duì)上述口腔液應(yīng)用核酸檢測(cè)方法排除了PRRS和PR病原。將口腔液分為2組，每 ml加入100 μL病毒原液，制成2種病毒的參考品，使參考品初始病毒核酸量在105～106copies/μL范圍之間。

1.4 樣品分組及保存

將參考品按1∶10的比例加入生理鹽水中，渦旋混勻后，按每管210 μL分裝制成生理鹽水組樣品，分別置于4 ℃冰箱（2～8 ℃）、室溫（22～25 ℃）和高溫（40 ℃）條件下保存1 d、3 d和7 d。商業(yè)化的樣品保存液A、B和C組樣品以同樣的方式處理。分別于各個(gè)時(shí)間點(diǎn)取兩個(gè)平行樣品置于-80 ℃保存。

1.5 樣品核酸提取

取各個(gè)時(shí)間點(diǎn)樣品200 μL，用賽默飛公司的MagMAX? CORE Nucleic Acid Purification Kit核酸提取試劑盒進(jìn)行樣品核酸提取。

1.6 探針?lè)▽?shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)

PRRSV的qRT-PCR方法使用Takara公司的一步法試劑（One Step PrimeScriptTMRT-PCR Kit），PRV的qRT-PCR方法使用北京擎科公司的試劑（2XT5 Fast qPCR Mix (Probe)）。引物和探針序列見(jiàn)表1。用天隆Gentier 32R實(shí)時(shí)PCR系統(tǒng)對(duì)各樣品進(jìn)行熒光PCR分析。以1×100～1×106copies/μL的稀釋質(zhì)粒樣品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣品的病毒檢出量。

2 結(jié)果

2.1 參考品初始病毒核酸量及其CT值

本實(shí)驗(yàn)以參考品0 d時(shí)檢測(cè)的病毒檢出量為基值，計(jì)算并比較各時(shí)間點(diǎn)樣品病毒檢出量的變化。其中PRRSV參考品0 d時(shí)CT值為21.24，病毒核酸量為1×105copies/μL；PRV參考品0 d時(shí)CT值為22.91，病毒核酸量為1×105copies/μL。

2.2 樣品保存液對(duì)口腔液樣品中核酸檢出量的影響

在第3天冷藏環(huán)境中，生理鹽水組在第3天時(shí)PRRS病毒檢出量低于50%，PR病毒檢出量下降18%，低于樣品保存液組；3種不同的商業(yè)保存液A、B、C都對(duì)病毒核酸有較好的保護(hù)作用，沒(méi)有差異。在第3天常溫和高溫環(huán)境中，生理鹽水組PRRS病毒檢出量低于70%～80%，PR病毒檢出量下降30%～40%，低于樣品保存液組；3種不同的商業(yè)保存液A、B、C都對(duì)病毒核酸有較好的保護(hù)作用，沒(méi)有顯著差異。

在第7天冷藏環(huán)境中，生理鹽水組在第7天的時(shí)候PRRS病毒檢出量低于90%，PR病毒檢出量下降36%，低于樣品保存液組；3種不同的商業(yè)保存液A、B、C都對(duì)病毒核酸有較好的保護(hù)作用，沒(méi)有顯著差異。在第7天常溫和高溫環(huán)境中，生理鹽水檢測(cè)不出PRRSV，PR病毒檢出量下降到80%以下，顯著低于樣品保存液組；3種不同的商業(yè)保存液A、B、C都對(duì)病毒核酸有的保護(hù)作用，雖然沒(méi)有顯著差異，但以樣品保存液A的保護(hù)核酸效果較為優(yōu)秀。如圖1所示。

3 討論

豬口腔液在疾病診斷、檢測(cè)和健康狀態(tài)分析等方面已得到了良好的推廣應(yīng)用，但口腔液樣品的儲(chǔ)運(yùn)一直是其應(yīng)用的限制因素之一。口腔液樣品成分復(fù)雜，含有大量的酶類(lèi)（包括核酸酶），而這些樣品中的病毒等檢測(cè)的靶標(biāo)為病毒的核酸，極易受到樣品中核酸酶的影響而降解。此外，口腔液中大量的細(xì)菌增殖所產(chǎn)生的毒素與大蛋白分子對(duì)病毒核酸和樣品處理也帶來(lái)了極大的干擾。用常規(guī)生理鹽水，即使儲(chǔ)運(yùn)于冷藏環(huán)境，也無(wú)法做到很好的保護(hù)樣品中病毒核酸的作用。因此，需要盡早抑制樣品中RNA酶活性及病原的增殖。

目前市面上商業(yè)化的樣品保存液有多種，成分包括表面活性劑、異丙醇、無(wú)水乙醇、銨鹽等單品或多種復(fù)合成分，作用主要為殺死樣品中的病原微生物和保護(hù)釋放出來(lái)的核酸。通過(guò)比較3種商用樣品保存液與生理鹽水的區(qū)別，發(fā)現(xiàn)現(xiàn)有的保存液A、B和C在不同溫度和時(shí)間條件下都有保護(hù)PRRSV和PRV的作用，彼此之間沒(méi)有顯著差異，但對(duì)RNA病毒的保護(hù)作用在第7天明顯下降；而常規(guī)使用的生理鹽水在各種條件下均不能保護(hù)口腔液樣品中的核酸，在第7天的時(shí)候已檢測(cè)不到PRRSV。

此外，溫度在樣品儲(chǔ)運(yùn)中也起到至關(guān)重要的作用。實(shí)驗(yàn)中4 ℃保存條件的2種病毒參考品的核酸量降低幅度都小于室溫和高溫條件，說(shuō)明低溫運(yùn)輸有利于獲得正確樣品核酸檢測(cè)值。干冰的溫度為-74 ℃，對(duì)病毒核酸樣品的保護(hù)更有利，但干冰運(yùn)輸?shù)某杀据^高。使用藍(lán)冰冷藏運(yùn)輸并結(jié)合使用任何一種樣品保存液作為保護(hù)劑，在7 d的時(shí)候PRRSV的檢出量仍高于30%，PRV的檢出量高于80%。而7 d的時(shí)間足夠?qū)⒖谇灰簶悠窂膰?guó)內(nèi)北方運(yùn)輸?shù)侥戏?，并完成檢測(cè)，其檢測(cè)結(jié)果較為可靠。因此，以樣品保存液為樣品保護(hù)劑和藍(lán)冰冷藏運(yùn)輸配套即可基本滿(mǎn)足口腔液樣品中病毒核酸檢測(cè)的需求。

為了更好地測(cè)試保存和運(yùn)輸條件對(duì)于口腔液中病毒核酸樣品的影響，實(shí)驗(yàn)所使用的模擬樣品的起始濃度為1×105～1×106copies/μL，檢測(cè)的CT值為20～23，此樣品濃度在實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)方法的最佳檢測(cè)范圍內(nèi)[4]。但實(shí)驗(yàn)的模擬樣品與實(shí)際口腔液樣品相比其病毒核酸濃度偏高，其目的在于展示儲(chǔ)運(yùn)條件對(duì)于核酸樣品檢測(cè)的影響。實(shí)際口腔液樣品攜帶其他病毒的樣品對(duì)儲(chǔ)運(yùn)條件的敏感性也可以進(jìn)行類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)。