晶膠固載副干酪乳桿菌及合成苯乳酸的實驗研究

許 娜，關(guān)今韜，張頌紅，贠軍賢，關(guān)怡新，姚善涇

(1.浙江工業(yè)大學(xué) 化學(xué)工程學(xué)院 綠色化學(xué)合成技術(shù)國家重點實驗室培育基地，浙江 杭州 310032;2.浙江大學(xué) 化學(xué)工程與生物工程學(xué)院，浙江 杭州 310027)

1 引 言

苯乳酸是一種典型的高值有機酸，能抑制革蘭氏陰性菌、陽性菌和部分真菌的生長，具有良好的抗菌性，也是合成新型高分子材料聚苯乳酸的單體，還可以作為合成新藥的中間體，在化工、食品、材料、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有重要用途[1-4]。由于化學(xué)法合成苯乳酸路徑復(fù)雜，存在較為嚴重的環(huán)境污染問題，目前尚不能大規(guī)模生產(chǎn)，而生物法合成苯乳酸條件溫和，工藝路線簡單，是近幾年國內(nèi)外重點關(guān)注的研究方向[5-6]。但是，微生物發(fā)酵合成苯乳酸存在成本高、高產(chǎn)菌株缺乏、工業(yè)化困難等難題。酶法合成苯乳酸雖合成效率高于野生菌株，但其制備過程成本高，步驟復(fù)雜，穩(wěn)定性和安全性仍有待考究[7-8]。固定化全細胞生物催化劑將為解決上述問題提供新的發(fā)展方向，它將游離的微生物細胞通過化學(xué)或物理的方法截留在一定的有限的空間內(nèi)，既可以保持微生物細胞原有的催化活性，又可以改善活性流失，具有易于分離、減輕底物抑制和提高穩(wěn)定性等優(yōu)點[9-14]。

晶膠介質(zhì)是近年來出現(xiàn)的一種新型生物分離介質(zhì)，內(nèi)有尺寸數(shù)十到數(shù)百微米的超大孔隙并相互連通，在水中有良好的連通性和彈性，可以允許含有微生物細胞或細胞碎片的復(fù)雜料液通過，在生化分離領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用前景[15-18]。其中聚甲基丙烯酸羥乙酯(poly(2-hydroxyethyl methacrylate)，pHEMA)晶膠具有生物相容性好、機械強度高、制備成本低等優(yōu)點。SAVINA等[19]提出pHEMA晶膠以其優(yōu)秀的力學(xué)性能，可以用作細胞培養(yǎng)支架載體；NIMET等[20]將干細胞包埋于HEMA復(fù)合葡聚糖晶膠，用于修復(fù)骨損傷；EFREMENKO等[14]利用聚乙烯醇晶膠復(fù)合用于釀酒酵母細胞長時間儲存。但是，將pHEMA晶膠用作制備生物催化劑合成苯乳酸，尚未見報道。

本文通過結(jié)晶致孔法制備pHEMA晶膠，然后在其骨架上接枝帶有胺基陰離子的甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(2-(dimethylamino)ethyl methacrylate，DMAEMA)得到陰離子交換晶膠，將該晶膠與微生物表面的負電基團通過靜電力吸附結(jié)合，制得復(fù)合生物催化劑，并考察了所得復(fù)合生物催化劑合成苯乳酸的能力。

2 材料和方法

2.1 材料

2.1.1 試劑

L-苯乳酸(phenyllactic acid，PLA)、甲基丙烯酸羥乙酯(2-hydroxyethyl methacrylate，HEMA)、聚乙二醇二丙烯酸酯(poly(ethylene glycol) diacrylate，PEGDA)、四甲基乙二胺(N,N,N,N’–tetramethylethylenediamine，TEMED)、甲醇及牛血清白蛋白(Bovine albumin serum，BSA)購于Sigma公司；三氟乙酸、DMAEMA購于阿拉丁試劑；葡萄糖、蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、檸檬酸氫二銨及無水乙酸鈉購于生工生物工程有限公司；硫酸鎂、硫酸錳、磷酸氫二鉀、吐溫80及鹽酸購于華東醫(yī)藥股份有限公司；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

2.1.2 儀器

Agilent 1260 infinity高效液相色譜系統(tǒng)(Agilent，美國)；CR21N高速冷凍離心機(Hitachi Koki，日本)；Milli-Q Synthesis超純水機(Millipore，美國)；SPX-150B-Z生化培養(yǎng)箱(上海博迅實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠)；HZ-2411KB疊式中型恒溫搖床(太倉市華利達實驗設(shè)備有限公司)；HS-1300-U超凈工作臺(蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司)；DW-HL290超低溫冷凍儲存箱(中科美菱)；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器(上海申安醫(yī)療器械廠)；THD-3030低溫恒溫槽，寧波天恒儀器廠。

2.1.3 菌種和培養(yǎng)基

副干酪乳桿菌L.paracasei16C3菌株分離自泡菜，本課題組保藏。

肉湯培養(yǎng)基(MRS培養(yǎng)基)：葡萄糖20 mg?mL-1，蛋白胨10 mg?mL-1，酵母膏5 mg?mL-1，牛肉膏10 mg?mL-1，檸檬酸二胺 2 mg?mL-1，無水乙酸鈉 5 mg?mL-1，硫酸錳 0.25 mg?mL-1，硫酸鎂 0.58 mg?mL-1，磷酸氫二鉀 2 mg?mL-1，吐溫 801 mL?L-1。

2.2 實驗方法

2.2.1 陰離子交換晶膠制備

實驗使用的陰離子交換晶膠pHEMA-DMAEMA，采用課題組建立的結(jié)晶致孔、聚合反應(yīng)和接枝修飾方法進行制備[16-17]。在直徑4～6 mm，高為10 mm的玻璃管中通過低溫冷凍結(jié)晶致孔制備得到晶膠基質(zhì)，按3～5 mm的厚度切片，然后用濃度為0.5 mol?L-1的DMAEMA單體進行接枝而得。

2.2.2 陰離子交換晶膠基礎(chǔ)性能測試[21]

陰離子交換晶膠的孔隙率采用稱重法測定；吸附容量通過考察晶膠介質(zhì)對模型蛋白BSA的吸附進行評價：用磷酸鹽緩沖液(0.02 mol?L-1，pH 7.2)在不同流速(1、2和3 cm?min-1)下進行吸附層析，測定陰離子交換晶膠介質(zhì)的吸附容量，蛋白濃度的測量采用考馬斯亮藍法；晶膠介質(zhì)內(nèi)部結(jié)構(gòu)通過掃描電鏡表征：將晶膠在不同體積濃度(10%～100%)的乙醇溶液中進行梯度脫水、冷凍干燥，然后用離子濺射儀進行噴金處理，最后用掃描電鏡觀察并拍攝照片。

2.2.3 復(fù)合生物催化劑的制備與微觀結(jié)構(gòu)表征

將甘油保藏的副干酪乳桿菌菌株經(jīng)活化一次，按6%接種量接種于肉湯培養(yǎng)基中，35 ℃靜置培養(yǎng)8 h，再將干燥后的pHEMA陰離子交換晶膠投入發(fā)酵液，于35 ℃繼續(xù)靜置培養(yǎng)16 h，瀝干晶膠表面水分，得到pHEMA種子晶膠。最后，將pHEMA種子晶膠投入肉湯培養(yǎng)基中，繼續(xù)35 ℃靜置培養(yǎng)48 h，瀝干晶膠表面水分，得到復(fù)合生物催化劑。其內(nèi)部結(jié)構(gòu)通過掃描電鏡進行表征，過程與上述晶膠介質(zhì)相同。

2.2.4 復(fù)合生物催化劑發(fā)酵合成苯乳酸

將pHEMA種子晶膠于30 mL培養(yǎng)基中發(fā)酵培養(yǎng)，以傳統(tǒng)發(fā)酵方式為對照實驗，每隔12 h(12、24、36、48、60、72和84 h)取樣，考察不同時間點發(fā)酵液中苯乳酸濃度。

2.2.5 復(fù)合生物催化劑轉(zhuǎn)化合成苯乳酸

復(fù)合生物催化劑和無晶膠的全細胞催化劑經(jīng)透性化處理后，以5 mL 0.1 mol?L-1的PB 8.0緩沖溶液為底物溶液，葡萄糖濃度為2 mg?mL-1，調(diào)節(jié)苯丙氨酸濃度分別為0.5、1、2和3 mg?mL-1，搖床轉(zhuǎn)速為75 r?min-1，搖床控溫35 ℃，轉(zhuǎn)化48 h，考察2種生物催化劑生物轉(zhuǎn)化能力，其中復(fù)合生物催化劑的用量按其固載細胞的量為100 mg?mL-1計算，無晶膠的全細胞催化劑用量也為100 mg?mL-1。

3 結(jié)果與討論

3.1 陰離子交換晶膠的形態(tài)結(jié)構(gòu)分析

圖1是陰離子交換晶膠切片的形貌特征和內(nèi)部微觀結(jié)構(gòu)掃描電鏡圖像。從圖中可見，pHEMA-DMAEMA陰離子交換晶膠內(nèi)部具有相互連通的超大孔隙，其孔徑范圍為10～200 μm，介質(zhì)壁面光滑?？紫堵史从沉司z介質(zhì)內(nèi)流體流動空間的相對大小，以水為測試流體，測得該晶膠的有效孔隙率為 75.1%，絕干孔隙率為 82.7%，說明該晶膠介質(zhì)孔隙空間大，相互連通形成了網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)，適用于微生物細胞的生長，有利于底物和代謝產(chǎn)物的交換和傳質(zhì)。

圖1 陰離子交換pHEMA晶膠的形貌與微觀結(jié)構(gòu)Fig.1 Morphology and microstructure of the anion exchange pHEMA cryogels

3.2 陰離子交換晶膠的吸附性能分析

文獻中常以BSA為模型蛋白，來間接評價陰離子交換晶膠介質(zhì)吸附容量和吸附性能[15-18]。因此，以BSA為模型蛋白質(zhì)，在不同流速條件下對pHEMA-DMAEMA晶膠介質(zhì)的吸附性能進行了研究。用磷酸鹽緩沖液(0.02 mol?L-1，pH 7.2)平衡床柱，上樣蛋白濃度 1 mg?mL-1，洗脫液為 1 mol?L-1NaCl (相同磷酸鹽緩沖液配置)。不同流速下BSA的吸附曲線和吸附容量如圖2所示。可見，不同流速下的BSA層析曲線無明顯差異，同時洗脫峰對稱性較好。通常，用于生物分離的pHEMA陰離子交換晶膠的吸附容量較大，例如DONG等[16]制備的pHEMA-DMAEMA晶膠，其在1、2和3 cm?min-1流速條件下對BSA的吸附容量分別為4.04、3.71和3.69 mg?mL-1。因此，通過控制接枝條件，適當(dāng)降低吸附容量，以便適度吸附細胞，形成復(fù)合生物催化劑，結(jié)果見圖2(b)?？梢姡诹魉?、2和3 cm?min-1流速下，pHEMA-DMAEMA晶膠介質(zhì)對BSA的吸附容量分別為0.75、0.63和0.62 mg?mL-1，說明pHEMA晶膠具有一定數(shù)量的陰離子交換基團，適于后續(xù)吸附細胞，適合用于制備復(fù)合生物催化劑。

圖2 不同流速下晶膠對BSA的吸附層析性能與吸附容量Fig.2 Chromatographic behaviors and BSA absorption capacities of the pHEMA-DMAEMA cryogel at various flow rates

3.3 晶膠副干酪乳桿菌復(fù)合生物催化劑表征

復(fù)合生物催化劑內(nèi)部結(jié)構(gòu)如圖3所示。由圖中可以看出，大量桿狀的副干酪乳桿菌在晶膠孔隙內(nèi)沉積，并成堆生長，與晶膠孔隙內(nèi)壁緊密結(jié)合?；诰z介質(zhì)較大的比表面積和較多的吸附位點，形成了高濃度生物催化劑。

圖3 晶膠復(fù)合生物催化劑內(nèi)部結(jié)構(gòu)電鏡照片F(xiàn)ig.3 SEM micrographs of the cell-immobilized cryogel biocatalysts

3.4 復(fù)合生物催化劑發(fā)酵合成苯乳酸

通過高效液相色譜分析發(fā)酵上清液中的苯乳酸含量，濃度變化如圖4所示。從圖中可以看出，發(fā)酵開始后12 h內(nèi)，代謝苯乳酸濃度快速上升后逐漸趨平，到24 h時，復(fù)合生物催化劑代謝的苯乳酸含量明顯高于傳統(tǒng)發(fā)酵下的細胞代謝，由0.71 mg?mL-1提升到0.95 mg?mL-1。圖5是復(fù)合生物催化劑發(fā)酵過程中生物量變化。由圖可見，按常規(guī)發(fā)酵，無晶膠時發(fā)酵液中的細胞生物量比較低，但隨時間呈穩(wěn)定上升趨勢；發(fā)酵36 h后，生物量趨于平衡，細胞干重最高為 2.83 mg?mL-1。而副干酪乳桿菌在pHEMA-DMAEMA陰離子交換載體中生長的速度迅速上升，經(jīng)過72 h發(fā)酵，細胞干重達到最高，為7.10 mg?mL-1，細胞濃度是無晶膠常規(guī)發(fā)酵時的 2.5倍。因此，以離子交換晶膠為載體，利用晶膠對副干酪乳桿菌細胞的吸附作用，在發(fā)酵過程中可以形成高濃度生物催化劑，通過減輕底物抑制和提高酶系的穩(wěn)定性，提高了發(fā)酵過程的生物量，這與本課題組關(guān)于晶膠微球固定化細胞培養(yǎng)實驗效果一致[22]，進而提高了苯乳酸產(chǎn)量。

圖4 晶膠復(fù)合生物催化劑發(fā)酵與無晶膠發(fā)酵時產(chǎn)苯乳酸濃度的對比Fig.4 Comparison of PLA concentrations with and without cell-immobilized cryogel biocatalysts during fermentation synthesis

3.5 復(fù)合生物催化劑轉(zhuǎn)化苯丙氨酸合成苯乳酸

以苯丙氨酸為底物，利用復(fù)合生物催化劑進行生物轉(zhuǎn)化，在不同底物濃度下合成苯乳酸，如圖6所示。從圖中可見，當(dāng)?shù)孜餄舛葹?.5 mg?mL-1時，復(fù)合生物催化劑轉(zhuǎn)化生成的苯乳酸的產(chǎn)量明顯大于全細胞催化下的產(chǎn)量，苯乳酸濃度最高為0.15 mg?mL-1，苯丙氨酸轉(zhuǎn)化率達30%，約為全細胞催化劑苯乳酸產(chǎn)量的3倍；當(dāng)?shù)孜餄舛葹? mg?mL-1時，復(fù)合生物催化劑的轉(zhuǎn)化能力仍然大于全細胞催化劑，苯乳酸濃度最高為0.23 mg?mL-1，轉(zhuǎn)化率可達 20%，約為全細胞催化劑下苯丙氨酸轉(zhuǎn)化率的2.5倍；當(dāng)?shù)孜餄舛葹? mg?mL-1時，苯乳酸濃度最高為0.23 mg?mL-1，苯丙氨酸轉(zhuǎn)化率可達 10%，約為全細胞催化劑苯丙氨酸轉(zhuǎn)化率 1.5倍；當(dāng)?shù)孜餄舛葹? mg?mL-1時，苯乳酸濃度最高為0.41 mg?mL-1，苯丙氨酸轉(zhuǎn)化率仍為10% 與全細胞催化劑轉(zhuǎn)化能力相當(dāng)。 由此可以推斷，細胞表面帶負荷，晶膠骨架吸附位點通過離子交換作用將細胞固定在孔隙內(nèi)表面，在一定程度上提高了細胞內(nèi)酶系的穩(wěn)定性，從而提高了細胞對 PHE底物和苯乳酸產(chǎn)物抑制的耐受性；同時，復(fù)合生物催化劑內(nèi)發(fā)達的孔隙有利于底物充分向細胞表面擴散[22]；當(dāng)?shù)孜餄舛仍降蜁r，單位體積晶膠內(nèi)細胞生物量充足，大部分苯丙氨酸有較高的概率擴散到達細胞表面和內(nèi)部，在酶的催化下進行轉(zhuǎn)化合成苯乳酸，轉(zhuǎn)化率高；隨底物濃度的增大，晶膠內(nèi)細胞生物量不足以為所有的苯丙氨酸底物分子提供反應(yīng)機會，一部分苯丙氨酸分子將不能到達酶位點，底物利用率低，從而轉(zhuǎn)化率下降，但合成的苯乳酸產(chǎn)物濃度仍然提高。

圖5 晶膠復(fù)合生物催化劑發(fā)酵與無晶膠發(fā)酵過程中細胞干重隨時間變化的對比Fig.5 Comparison of dried cell concentrations with and without cell-immobilized cryogel biocatalysts during fermentation synthesis

圖6 不同底物濃度下晶膠復(fù)合生物催化劑與使用全細胞催化劑轉(zhuǎn)化合成苯乳酸的對比Fig.6 Comparison of PLA concentrations and conversion ratios with cell-immobilized cryogel biocatalysts and whole-cell biocatalysts during biotransformation synthesis

4 結(jié) 論

利用陰離子交換功能 pHEMA-DMAEMA晶膠對副干酪乳桿菌的吸附作用，在發(fā)酵過程中可以形成高菌體濃度復(fù)合生物催化劑，能夠用于苯乳酸的發(fā)酵合成和轉(zhuǎn)化合成。pHEMA-DMAEMA晶膠內(nèi)部有尺寸10～200 μm量級的超大孔隙，其相互連通且十分發(fā)達，有效孔隙率75.1%，絕干孔隙率為82.7%，對BSA蛋白吸附容量為0.75 mg?mL-1，適于吸附固定副干酪乳桿菌，并提供有利于菌體生長。復(fù)合生物催化劑發(fā)酵的生物量及苯乳酸產(chǎn)量均明顯高于常規(guī)游離細胞發(fā)酵情況，其生物量由常規(guī)的2.83 mg?mL-1提高到7.1 mg?mL-1，苯乳酸產(chǎn)量由常規(guī)的0.71 mg?mL-1提升到0.95 mg?mL-1。復(fù)合生物催化劑轉(zhuǎn)化生成的苯乳酸產(chǎn)量也明顯高于常規(guī)的全細胞催化劑，當(dāng)?shù)孜锉奖彼岬臐舛葹?.5 mg?mL-1時，苯丙氨酸轉(zhuǎn)化率高達30%，是全細胞催化劑的3倍；當(dāng)?shù)孜锉奖彼岬臐舛葹? mg?mL-1時，苯丙氨酸轉(zhuǎn)化率可達20%，是全細胞催化劑的2.5倍；當(dāng)?shù)孜锉奖彼岬臐舛仍黾又? mg?mL-1時，苯丙氨酸轉(zhuǎn)化率為10%，是全細胞催化劑的 1.5倍。因此，復(fù)合型生物催化劑合成苯乳酸的性能明顯優(yōu)于常規(guī)全細胞催化劑，且制備過程簡單，分離容易，安全性好，易于放大，具有廣闊的應(yīng)用前景。