枯草芽孢桿菌酶的還原性能及用于靛藍(lán)染料還原

廖 歡,吳艷麗,2,周 亭，陳建芳

(1.湖南工程學(xué)院 材料與化工學(xué)院，湘潭 411100；2.德永佳紡織制衣有限公司，東莞 523000)

靛藍(lán)染料作為一種還原染料，因牢度優(yōu)良，尤其是耐日曬和耐皂洗色牢度，被廣泛應(yīng)用在纖維素纖維上[1-3].但該類染料不溶于水，不利于后續(xù)染色，通常改進(jìn)措施是將其分子共軛雙鍵系統(tǒng)中的羰基在堿性溶液中與保險(xiǎn)粉(連二亞硫酸鈉)相互作用，羰基還原轉(zhuǎn)變成羥基，成為可溶于水的隱色體[4-6].同時(shí)，保險(xiǎn)粉在反應(yīng)過(guò)程中，被氧化成硫酸鹽等一系列含硫物質(zhì)，而這些含硫物質(zhì)不能回收再利用，只能隨著印染廢水排放到自然界中，降解后會(huì)產(chǎn)生H2S，污染大氣[7-8].目前，有研究還原染料間接電化學(xué)染色利用電化學(xué)還原代替保險(xiǎn)粉的工藝，劉祥霞[9]等利用葡萄糖作為靛藍(lán)染料的還原劑，測(cè)定了葡萄糖在不同還原體系中分子結(jié)構(gòu)的變化，且優(yōu)化了還原及染色工藝.譚曉冬[10]使用超聲波對(duì)靛藍(lán)進(jìn)行超聲電化學(xué)還原，并運(yùn)用新型鐵-三乙醇胺-葡萄糖酸鈣(Fe-TEA-Ca)絡(luò)合體系作為媒介，以達(dá)到染色目的.以上研究均有特色，但是前者存在染色時(shí)間長(zhǎng)，上染率偏低，而后者操作復(fù)雜且設(shè)備占地面積大等問(wèn)題.

針對(duì)以上問(wèn)題，本文通過(guò)制備具有還原性的枯草芽孢桿菌酶，并測(cè)試其在靛藍(lán)染料體系中的還原能力，嘗試在電化學(xué)還原中使用更環(huán)保的生物酶-蒽醌還原體系，為后續(xù)生物酶運(yùn)用于電化學(xué)還原染色研究提供基礎(chǔ).目前，暫未見(jiàn)關(guān)于生物酶運(yùn)用到電化學(xué)還原靛藍(lán)染料的相關(guān)研究報(bào)道.

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

枯草芽孢桿菌(生化試劑，鄭州華冠生物技術(shù)開(kāi)發(fā)有限公司)；蛋白胨、瓊脂粉、酵母浸粉(均為生化試劑，北京普博欣生物試劑公司)；靛藍(lán)(化學(xué)純，徐州開(kāi)達(dá)精化有限公司)；1,8-二羥基-9,10-蒽醌(1,8-DHAQ，分析純，西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司)；Tris(三羥甲基氨基甲烷，色譜純，北京普博欣生物科技責(zé)任有限公司)；氫氧化鈉、硫酸、氯化鈉、磷酸鈉(均為分析純，天津市風(fēng)船化學(xué)試劑科技有限公司).

1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

LRH-150B生化培養(yǎng)箱、YX系列全溫振蕩器、TS-211B光照搖床、JY92-II超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)、LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌箱、722型分光光度計(jì)、TK-98022868型臺(tái)面式pH/ISE測(cè)試儀、COO2天津艾達(dá)恒晟電解池.

1.3 培養(yǎng)基的配方與配制

枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基配方如表1所示.

表1 枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)基配方

枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)：

用1 L的三角錐形瓶按照以上處方配制500 ml的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)液，用紗布封口后在立式壓力蒸汽滅菌箱內(nèi)滅菌20 min.待滅菌完成后，溫度降至60 ℃時(shí)在單人單面凈化臺(tái)上接種枯草芽孢桿菌.接種完后將培養(yǎng)液放入轉(zhuǎn)速為160 rpm、溫度為37 ℃的水浴振蕩器中培養(yǎng)12 h，再將培養(yǎng)液取出，進(jìn)行第一次離心.離心后將培養(yǎng)液和細(xì)胞分開(kāi)，培養(yǎng)液可直接用于實(shí)驗(yàn)，細(xì)胞則用pH為7的磷酸鈉鹽緩沖液溶解，用超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)將細(xì)胞粉碎，再采用0.22 μm的濾紙和無(wú)油真空泵進(jìn)行過(guò)濾，過(guò)濾后的酶液留作實(shí)驗(yàn)[11-12].

1.4 還原酶的定位

枯草芽孢桿菌不僅分泌胞內(nèi)酶，還有胞外酶，實(shí)驗(yàn)需要的是具有還原性的酶.通過(guò)將培養(yǎng)液和輔酶NADH結(jié)合，再與1,8-DHAQ作用，看溶液的導(dǎo)電性及還原能力是否符合靛藍(lán)還原染色的要求定位還原酶.電解液配制：各取5 mL枯草芽孢桿菌胞內(nèi)酶與胞外酶培養(yǎng)液分別加入1.8 mM/L的輔酶(NADH)，用Tris-HCl緩沖溶液混合，將0.06 mM/L的1,8-DHAQ用Tris-HCl緩沖液溶解，將酶混合液與1,8-DHAQ溶液混合，再將混合后的溶液分別定容至100 mL.

1.5 還原能力的測(cè)定1.5.1 電子傳遞能力測(cè)試

閉合回路中的電流大小反映溶液的導(dǎo)電能力，因此實(shí)驗(yàn)通過(guò)測(cè)試外電流的大小來(lái)表示溶液的導(dǎo)電能力.實(shí)驗(yàn)在閉合回路中接入一個(gè)萬(wàn)用表和電流表，將配制好的電解液放入電解池中，通過(guò)調(diào)節(jié)外加電壓來(lái)改變回路中的電子傳遞能力.將電源電壓調(diào)至1 V、3 V…15 V，記錄不同外電壓下的電流值，平行測(cè)試3次，取平均值.

1.5.2 還原電位的測(cè)試

用868型臺(tái)面式pH/ISE測(cè)試儀測(cè)試體系的還原電位.接通電路，將電源電壓分別調(diào)至1 V，3 V…15 V，測(cè)試電解液的還原電位.

1.5.3 染料還原效果的測(cè)試

測(cè)試完還原電位后，向電解液中加入1 g靛藍(lán)，每隔10 min各取三組1 ml的染液樣品，一共取6次(0 min、10 min、20 min、30 min、40 min、50 min)，用容量瓶定容至50 ml，再用分光光度計(jì)測(cè)試其吸光度，平行測(cè)試3次，取平均值.

2 結(jié)果與討論

2.1 枯草芽孢桿菌酶的電子傳遞能力

由于溶解酶體系的Tris-NaOH(pH=11)緩沖溶液本身有導(dǎo)電性，所以測(cè)試酶液的導(dǎo)電性之前必須測(cè)試Tris緩沖溶液的導(dǎo)電性.再向Tris-NaOH(pH=11)緩沖溶液中分別加入含胞外酶與胞內(nèi)酶的培養(yǎng)液，溫度為60 ℃，具體測(cè)試結(jié)果如表2所示.

表2 Tris-NaOH(pH=11)緩沖溶液與含枯草

由表2可知，Tris-NaOH緩沖溶液具有一定的導(dǎo)電能力，當(dāng)緩沖液中加入胞外酶后，電流基本保持不變，這說(shuō)明胞外酶基本沒(méi)有傳遞電子能力.同時(shí)，含有胞內(nèi)酶的電解液隨著外加電壓的增大，電流也在增大，當(dāng)外加電壓達(dá)到15 V時(shí)，電流數(shù)值是胞外酶的131倍.說(shuō)明胞內(nèi)酶電子傳遞能力遠(yuǎn)高于胞外酶，因此只有胞內(nèi)酶才具有輸送電子能力.

2.2 枯草芽孢桿菌酶的還原電位

首先測(cè)試100 mL Tris-HCl緩沖溶液在不同的外壓下還原電位的變化情況，測(cè)試完Tris-HCl緩沖溶液的還原電位后分別向緩沖溶液中加入過(guò)量的胞內(nèi)酶液與胞外酶液，pH調(diào)節(jié)至11，溫度至60 ℃，測(cè)試不同外壓下還原電位的變化情況，具體測(cè)試結(jié)果如表3所示.

表3 Tris-HCl緩沖溶液與含枯草芽孢桿菌酶溶液還原電位隨時(shí)間及電壓的變化

備注：“+”表示氧化，“-”表示還原.

由表3可知，胞內(nèi)酶的還原電位隨外加電壓增大，電位也在增加，而胞外酶基本無(wú)變化. 當(dāng)外加電壓達(dá)到15 V時(shí)，胞內(nèi)酶的還原電位為867 mV，高于靛藍(lán)所需要的還原電位760 mV，因此可用作靛藍(lán)電化學(xué)染色體系的還原劑.

2.3 pH值對(duì)枯草芽孢桿菌胞內(nèi)酶電子傳遞能力的影響

測(cè)試溫度為60 ℃，在不同pH值條件下，胞內(nèi)酶的電子傳遞能力，具體結(jié)果如表4所示.

表4 不同pH值胞內(nèi)酶溶液的電子傳遞能力測(cè)試表

由表4可知，酶體系在pH為11時(shí)導(dǎo)電能力最強(qiáng)，原因是胞內(nèi)酶在pH值為11時(shí)活性最強(qiáng)；另外1,8-二羥基-9,10-蒽醌不溶于中性或酸性水溶液中，在強(qiáng)堿性條件下溶解度較大，因此，溶液中溶解較多蒽醌也是導(dǎo)電性增強(qiáng)的原因之一.

2.4 酶體系還原染料效果

采用酶體系還原靛藍(lán)染料，并測(cè)定不同時(shí)間點(diǎn)隱色體的吸光度，具體結(jié)果如表5、圖1所示.

表5 酶體系隱色體吸光度

圖1 酶體系隱色體吸光度

從圖1可知，隨著時(shí)間的推移，溶液中的隱色體濃度不斷增大，當(dāng)還原時(shí)間為40 min時(shí)，隱色體濃度達(dá)到最大，測(cè)試出的最大吸光度為0.402.在生物酶體系中，輔酶(NADH)先和枯草芽孢桿菌中提取的酶液形成絡(luò)合體系，此絡(luò)合體系中的NADH-還原酶先失去一個(gè)氫，變?yōu)镹AD-還原酶體，NAD-還原酶體系不穩(wěn)定，當(dāng)接觸到陰極銅管時(shí)，Cu給出一個(gè)電子使其變成穩(wěn)定的NADH還原酶結(jié)構(gòu)，NADH還原酶將失去的電子傳給了1,8-二羥基-9,10-蒽醌(1,8-DHAQ)，得到電子后，蒽醌中的羰基變?yōu)榱u基，被還原的蒽醌遇到靛藍(lán)，將電子傳遞給靛藍(lán)，靛藍(lán)首先被還原成不溶于水的隱色酸，隱色酸遇見(jiàn)氫氧化鈉變?yōu)榭扇苄缘碾[色體鈉鹽.當(dāng)還原時(shí)間超過(guò)40 min后，吸光度出現(xiàn)較小的下降趨勢(shì)，可能是生成的隱色體被氧氣氧化所造成.

3 結(jié)論

通過(guò)培養(yǎng)枯草芽孢桿菌，分泌出酶，由測(cè)試可知具有還原能力的酶是胞內(nèi)酶，當(dāng)生物酶體系的外加電壓調(diào)至15 V時(shí)，胞內(nèi)酶的還原電位為867 mV，高于靛藍(lán)所需要的還原電位760 mV，可用做靛藍(lán)電化學(xué)染色體系的還原劑，且酶體系溫度為60 ℃，pH為11，還原時(shí)間為40 min時(shí)，對(duì)靛藍(lán)染料的還原效果最佳.