非洲豬瘟病毒SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法的建立

賈云飛， 趙福杰， 朱靜靜， 王超群， 吳亞楠， 魏戰(zhàn)勇,4

(1.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)經(jīng)濟(jì)與管理學(xué)院，河南 鄭州 450002；2.河南農(nóng)業(yè)大學(xué)牧醫(yī)工程學(xué)院，河南 鄭州 450002；3.許昌海關(guān)，河南 許昌 461000；4.河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河南 鄭州 450002)

非洲豬瘟(African swine fever, ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的一種急性、熱性、高度接觸性傳染病[1]，最早于1921年在肯尼亞暴發(fā)，隨后相繼擴(kuò)散至歐洲、中美洲、非洲和亞洲的多個(gè)國家[2]。該病臨床癥狀以高熱、皮膚發(fā)紺、呼吸障礙和神經(jīng)癥狀為主，病程短、發(fā)病率和死亡率幾乎達(dá)100%，被世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)列為法定報(bào)告的動(dòng)物疫病，也是中國動(dòng)物病原微生物名錄中規(guī)定的一類動(dòng)物傳染病[3-4]。中國首例非洲豬瘟疫情2018-08-03在遼寧沈陽暴發(fā)[5]，隨后疫情持續(xù)在中國蔓延，迅速波及大陸地區(qū)全部省份，2019-05-10，隨著香港上水屠宰場內(nèi)一頭死亡生豬的內(nèi)臟樣本中檢測出非洲豬瘟病毒，疫情擴(kuò)大至香港，給中國生豬養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)也影響著國內(nèi)豬肉市場的供需穩(wěn)定。

雖然首次發(fā)現(xiàn)ASFV至今已將近100 a，各國科學(xué)家也一直致力于ASFV病原及免疫學(xué)相關(guān)方面的研究，但目前世界上仍沒有可有效預(yù)防ASFV感染的疫苗，也無有效的治療藥物，僅能依賴有限的抗原檢測方法對ASFV感染開展早期診斷，進(jìn)而通過撲殺感染動(dòng)物來實(shí)現(xiàn)對非洲豬瘟疫情的控制。因此，對ASFV進(jìn)行快速、準(zhǔn)確的診斷在疫情防控方面尤為重要。但是，由于ASF與豬瘟等其他出血性豬病的發(fā)病癥狀非常相似，很難通過臨床診斷的方法進(jìn)行區(qū)分，ASF的確診只能依靠實(shí)驗(yàn)室方法。目前，ASFV核酸的PCR和熒光定量PCR檢測方法是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織推薦的抗原檢測方法，研究人員建立過多種針對ASFV不同抗原的PCR檢測方法。AGUERO等[6]和曾少靈等[7]曾根據(jù)ASFVVP72基因設(shè)計(jì)引物，建立了用于ASFV 早期感染的快速診斷方法；吳憶春等[8]研制了ASFV快速檢測PCR試劑盒；BASTO等[9]建立了可用于檢測蜱蟲體內(nèi)ASFV的套氏PCR方法；崔尚金等[10]建立了ASFV的高效納米PCR檢測方法；KING 等[11]、李維彬等[12]、張泉等[13]、黃萍等[14]、TIGNON 等[15]、李洪利等[16]多個(gè)國內(nèi)外研究團(tuán)隊(duì)先后以ASFVVP72基因?yàn)榘谢蚪⒒赥aqMan的ASFV實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測方法；曾少靈等[17]和董志珍等[18]也分別根據(jù)ASFVVP73和P54基因建立過 TaqMan 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR檢測方法；郭少平等[19]根據(jù) ASFVK205R基因建立TaqMan實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 檢測方法；MCKILLEN 等[20]根據(jù)9GL基因建立MGB探針實(shí)時(shí)熒光定量PCR 檢測方法。但是這些PCR檢測方法的靈敏度和特異性均相對偏低。因此，本研究擬建立一種更加靈敏、準(zhǔn)確的ASFV檢測方法。

ASFV基因組約170～190 kb，含有151個(gè)ORF，可編碼150～200種蛋白質(zhì)[21]。其中，P72基因在不同ASFV間較為保守，因此可被用作ASFV檢測中的靶基因。在比對了多株ASFV的P72基因序列后，從中確定了P72基因的保守區(qū)域，根據(jù)中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心分離到的中國流行株ASFV-SY18的序列[4]設(shè)計(jì)了特異性引物，摸索了各種試驗(yàn)條件后建立了ASFV的SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 病毒核酸樣品及質(zhì)粒 PEDV、PDCoV、HP-PRRSV和PRV的核酸樣品均由河南省動(dòng)物性食品安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室提取和保存。連接有ASFVP72目的基因的質(zhì)粒由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成，命名為ASFV-P72-pUC57。其中，目的片段長度417 bp，連于pUC57載體。

1.1.2 主要試劑及儀器 UltraSYBR Mixture購自于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；CFX96實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀購自于Bio-Rad公司(美國)。

1.1.3 定量引物的設(shè)計(jì)與合成 根據(jù)1.1.1中合成的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒ASFV-P72-pUC57的基因序列，選取其保守區(qū)，應(yīng)用Primer 5.0基因分析軟件設(shè)計(jì)多對特異性引物，然后在GenBank數(shù)據(jù)庫上用BLAST進(jìn)行特異性和保守性的比較分析，最終選定的引物序列見表1。引物由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

表1 檢測ASFV-P72的相關(guān)引物與探針信息

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 熒光定量RT-PCR反應(yīng)條件與體系優(yōu)化 以1.0×105copies·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板，反應(yīng)體系設(shè)為25 μL，在反應(yīng)體系中加入引物P72 F2/P72 R2，使其終濃度分別為0.20、0.40、0.60、1.00 μmol·L-1，根據(jù)RT-PCR結(jié)果，遵循Ct值最小和熒光閾值最高原則，并確保熔解曲線無非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行引物濃度的優(yōu)化篩選。將優(yōu)化后的反應(yīng)體系分別在Tm±8 ℃內(nèi)設(shè)置50～60 ℃的10個(gè)退火溫度，進(jìn)行反應(yīng)條件的優(yōu)化，最終確定最佳反應(yīng)體系與反應(yīng)條件。

1.2.2 構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線 計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度，用ddH2O進(jìn)行10倍倍比稀釋，稀釋成10個(gè)梯度(1.0×102～1.0×108copies·μL-1)作為模板。采用1.2.1中優(yōu)化后的反應(yīng)體系與反應(yīng)條件進(jìn)行熒光定量RT-PCR擴(kuò)增，根據(jù)所得的Ct值與對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.3 靈敏度試驗(yàn) 以1.0～1.0×109copies·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分別做模板，對SYBR Green I熒光定量PCR方法進(jìn)行敏感性測定，根據(jù)所得熔解曲線，獲得其最低檢出拷貝數(shù)。

1.2.4 特異性試驗(yàn) 按照1.2.1建立的反應(yīng)體系，分別以PEDV、PDCoV、HP-PRRSV、PRV核酸為模板，同時(shí)設(shè)1.0×107copies·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為陽性對照，以ddH2O為陰性對照，進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增，檢測所建方法的特異性。

1.2.5 重復(fù)性試驗(yàn) 選取1.0×102、1.0×105、1.0×108copies·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分別作為模板，進(jìn)行3次批內(nèi)與批間熒光定量RT-PCR反應(yīng)擴(kuò)增，根據(jù)Ct值計(jì)算變異系數(shù)，驗(yàn)證所建方法的可重復(fù)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 反應(yīng)條件與反應(yīng)體系優(yōu)化

最終確定優(yōu)化后的SYBR Green I實(shí)時(shí)熒光定量PCR體系為2×UltraSYBR Mixture 12.5 μL, ddH2O 8.5 μL, P72 F2/P72 R2引物各1 μL，標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒模板2.0 μL。最佳反應(yīng)條件為：95 ℃，10 s；55 ℃，30 s；72 ℃，30 s；共40個(gè)循環(huán)；95 ℃，15 s；65 ℃ 至 95 ℃,每0.5 ℃·s-1為間隔繪制熔解曲線。該條件下繪制的熔解曲線峰單一，在熔解溫度Tm=(80±0.5) ℃時(shí)出現(xiàn)特異性峰，無非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物和引物二聚體，表明該反應(yīng)特異性良好(圖1)。

1. 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒組；2. 陰性對照。1. Standard plasmid group；2. Negative control.

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將建立的SYBR Green I熒光定量PCR方法對1.0×102～1.0×108copies·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行定量檢測，以讀取的Ct值為y軸，以標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒濃度為x軸繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得標(biāo)準(zhǔn)方程y=-3.318 4x+39.085, 相關(guān)系數(shù)R2=0.999 8(圖2)，表明該檢測方法的Ct值與10倍倍比稀釋的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒之間具有良好的線性關(guān)系。

2.3 靈敏性檢測

用建立的SYBR Green I熒光定量PCR方法對1.0～1.0×109copies·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒進(jìn)行定量敏感性檢測。結(jié)果顯示該方法的最低檢出量為1.0 copies·μL-1(圖3)，表明該檢測方法均具有極高的靈敏性。

圖2 SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.4 特異性檢測

用建立的SYBR Green I熒光定量PCR方法檢測PEDV、PDCoV、HP-PRRSV、PRV核酸樣品，以1.0×107copy·μL-1標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為陽性對照，發(fā)現(xiàn)其余病毒均未出現(xiàn)陽性擴(kuò)增，并且無非特異性擴(kuò)增條帶(圖4)，表明該檢測方法具有良好的特異性。

2.5 重復(fù)性檢測

對建立的SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。以1.0×102、1.0×105、1.0×108copies·μL-1的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒分別作為模板，進(jìn)行3次批內(nèi)與批間熒光定量PCR反應(yīng)擴(kuò)增，同一質(zhì)粒濃度的擴(kuò)增Ct值在批次內(nèi)與批次間都非常穩(wěn)定。計(jì)算批內(nèi)與批間Ct值的變異系數(shù)均小于1%(表2)，表明該檢測方法具有良好的可重復(fù)性。

圖3 SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法的靈敏性檢測結(jié)果

圖4 SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法的特異性試驗(yàn)結(jié)果(A)及熔解曲線分析(B)

表2 SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法的重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果

3 討論

在ASF的檢測中，病原PCR檢測具有簡單、快速、靈敏度高、特異性好等特點(diǎn)，是目前最常用的ASFV實(shí)驗(yàn)室檢測方法，也是世界動(dòng)物衛(wèi)生組織推薦的ASFV抗原檢測方法。實(shí)時(shí)熒光定量PCR具有更高的敏感性和特異性，并且可以用于計(jì)算ASFV的相對或絕對含量，也被越來越多地應(yīng)用到了ASFV的檢測工作中，尤其還有學(xué)者利用不同病毒的保守基因建立了多重?zé)晒舛縋CR檢測方法，實(shí)現(xiàn)了ASFV和多種其他病原的鑒別診斷。MCKILLEN 等[22]建立了可同時(shí)鑒別 PRV、ASFV、豬圓環(huán)病毒2型(PCV2)和豬細(xì)小病毒(PPV)的實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 分子信標(biāo)檢測方法；于恒智等[23]建立了可同時(shí)鑒別ASFV、小反芻獸疫病毒(PPRV)、西尼羅河熱病毒(WNV)、亨德拉病毒(HeV)和尼帕病毒(NiV)等5種外來動(dòng)物疫病的并聯(lián)熒光定量PCR檢測方法。但是，這些ASFV熒光定量檢測方法幾乎都是TaqMan探針法，操作中需要用到熒光標(biāo)記的探針，價(jià)格昂貴導(dǎo)致檢測成本很高，而本研究建立的SYBR Green I熒光定量檢測方法可以免于合成探針從而降低檢測成本，并且檢測靈敏性達(dá)到了1.0×100copies·μL-1，明顯優(yōu)于世界動(dòng)物衛(wèi)生組織推薦的PCR檢測方法。

除了檢測靈敏度極強(qiáng)以外，本研究建立的SYBR Green I熒光定量PCR檢測方法的特異性和重復(fù)性結(jié)果顯示也很好，可以準(zhǔn)確地從含豬流行性腹瀉病毒、豬δ冠狀病毒、高致病性豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病毒等病原的樣品中鑒別檢測出ASFV。此外，本研究中用到的檢測基因P72，在ASFV毒株間序列相對保守，是ASFV熒光定量PCR檢測中的常用檢測基因，常被用于ASFV診斷和鑒別檢測方法的建立中；標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒序列來源于CN201801病毒株(GenBank：MH722357.1)，它是由中國動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心于2019年分離鑒定的中國ASF疫情的流行毒株，該病毒株的P72基因序列與格魯吉亞Georgia 2007/1分離株、俄羅斯 Krasnodar 2012和Irkutsk 2017分離株、 以及愛沙尼亞Estonia 2014分離株的P72序列有100% 相似性，同屬于ASFV 基因型II型毒株，與其他基因型的ASFV毒株存在一定的序列差異[4]。因此，基于此毒株基因序列設(shè)計(jì)的特異性引物，對中國臨床樣品的檢測有更高的特異性，可以更加準(zhǔn)確地對中國目前流行的非洲豬瘟病毒株進(jìn)行檢測和診斷。

本研究成功建立了一種基于SYBR Green I的ASFV熒光定量PCR檢測方法，且靈敏性、特異性和重復(fù)性都較好，可用于中國非洲豬瘟的準(zhǔn)確診斷及病原的定量分析，有助于國內(nèi)ASFV疫情的監(jiān)測和防控。