Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化威靈仙飲片的炮制工藝

張永妹， 蔣佳雯， 李 玲， 譚家華， 田源紅， 羅 君*， 殷少文

(1.貴州中醫(yī)藥大學(xué) 第一附屬醫(yī)院， 貴州 貴陽(yáng) 550001； 2.貴州中醫(yī)藥大學(xué)， 貴州 貴陽(yáng) 550001； 3.貴陽(yáng)市第三人民醫(yī)院， 貴州 貴陽(yáng) 550001)

威靈仙為毛茛科植物威靈仙(ClematischinensisOsbeck)、棉團(tuán)鐵線蓮(ClematishexapetalaPall.)或東北鐵線蓮(ClematismanshuricaRupr.)的干燥根及根莖。威靈仙味辛、咸，性溫，有小毒，歸膀胱經(jīng)，具有祛風(fēng)濕、通經(jīng)絡(luò)、消骨鯁等功效，主要用于治療痛風(fēng)、風(fēng)濕頑痹、腰膝冷痛、腳氣、癥瘕、積聚、破傷風(fēng)及諸骨哽咽等癥[1]。其藥理作用研究表明，威靈仙在抗氧化、降血壓、降血糖、免疫抑制、利膽、鎮(zhèn)痛抗炎、抗腫瘤、利尿及松弛平滑肌等方面表現(xiàn)出多種藥理活性[2-5]。

威靈仙飲片在現(xiàn)行版藥典的炮制工藝只有簡(jiǎn)單凈制方法，但在全國(guó)各省均有地方特色的威靈仙飲片炮制工藝[6]。在貴州，據(jù)2005版《貴州省中藥飲片炮制規(guī)范》記載的炮制方法為酒潤(rùn)麩炒[7]，該工藝存在涉及輔料較多、工序操作復(fù)雜且無(wú)具體工藝參數(shù)、炮制品質(zhì)量參差不齊等問(wèn)題，且目前未見關(guān)于酒潤(rùn)麩炒威靈仙工藝的研究報(bào)道。為此，筆者等采用Box-Behnken響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)法，優(yōu)化威靈仙酒潤(rùn)麩炒飲片的炮制工藝，明確該炮制工藝參數(shù)，擬為貴州省威靈仙酒潤(rùn)麩炒飲片的開發(fā)與利用提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

藥材：威靈仙，購(gòu)買于同濟(jì)堂藥業(yè)(批號(hào)：20170201；產(chǎn)地：四川)。

試劑：齊墩果酸對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所，110709-201607，供薄層鑒別和含量測(cè)定用)，乙腈(色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)，甲醇(色譜純，天津科密歐化學(xué)試劑有限公司)，水為娃哈哈純凈水，黃酒(酒精度≥16.5%，浙江塔牌紹興酒廠)；甲醇、乙酸乙酯、稀乙醇、乙腈等均為分析純。

儀器：Thermo ultiMate 3000高效液相色譜儀(上海硅儀生化科技有限公司)，AUW 220D十萬(wàn)分之一電子天平(蘇州島津儀器有限公司)，METTLER TOLEDO ME204E萬(wàn)分之一電子天平(梅特勒-托利多儀器上海有限公司)，TW-2000W型可控調(diào)溫電爐(郫縣永信電器廠)，HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋(常州澳華儀器有限公司)，LDP-150高速多功能粉碎機(jī)(浙江永康市紅太陽(yáng)機(jī)電有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 炮制方法 取凈威靈仙段，加適量黃酒拌勻，悶潤(rùn)一定時(shí)間，照麩炒法(附錄一炮制通則)炒至表面淡黃色時(shí)取出，篩去蜜麩皮，放涼[6]。

1.2.2 齊墩果酸含量的測(cè)定 按照2015版藥典規(guī)定，采用高效液相色譜法測(cè)定威靈仙中齊墩果酸的含量，作為優(yōu)化酒潤(rùn)麩炒威靈仙飲片炮制工藝的評(píng)價(jià)指標(biāo)。

1) 色譜條件。色譜柱：WondaSilC18(250 mm×4.6 mm，5 μm)。以乙腈∶水=90∶10為流動(dòng)相進(jìn)行洗脫，檢測(cè)波長(zhǎng)為205 nm，柱溫30℃，流速為1 mL/min，進(jìn)樣體積為10 μL。

2) 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制及線性范圍。制備濃度為1 mg/mL、0.7 mg/mL、0.64 mg/mL、0.5 mg/mL、0.448 mg/mL、0.33 mg/mL和0.25 mg/mL的齊墩果酸對(duì)照品溶液。以相同的體積10 μL依次進(jìn)樣，按1.2.2的1)項(xiàng)進(jìn)行測(cè)定，以齊墩果酸對(duì)照品。溶液濃度(x)為橫坐標(biāo)，以齊墩果酸峰面積為縱坐標(biāo)(y)制定標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到相應(yīng)的回歸方程y=118.82x-0.045(R2=0.999 7)，表明齊墩果酸在2.5 ～10.0 μg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

齊墩果酸含量=[10 000×(y+0.045)]/[(稱樣量×118.82)]×100%

3) 供試品溶液的制備。精密稱取樣品粉末(過(guò)四號(hào)篩)4 g置于索氏提取器中，加乙酸乙酯適量，加熱回流3 h，棄去乙酸乙酯液，藥渣揮干溶劑，連同濾紙筒轉(zhuǎn)移至錐形瓶中，精密加入稀乙醇50 mL，稱定重量，加熱回流1 h，放冷，再稱定重量，用稀乙醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，過(guò)濾，精密量取續(xù)濾液25 mL，于99℃水浴上蒸干，殘?jiān)? mol/L鹽酸溶液30 mL使溶解，加熱回流2 h。立即冷卻，移入分液漏斗中，用水10 mL分次洗滌容器，洗液并入分液漏斗中。加乙酸乙酯振搖提取3次，每次15 mL，合并乙酸乙酯液，70℃以下濃縮至近干，加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至50 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液[1]。

1.2.3 單因素試驗(yàn) 根據(jù)1.2.1的炮制方法，制備酒潤(rùn)麩炒威靈仙飲片，在預(yù)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，分別考察黃酒用量、悶潤(rùn)時(shí)間、蜜麩用量、炒制溫度及炒制時(shí)間等因素對(duì)酒潤(rùn)麩炒威靈仙飲片中齊墩果酸含量的影響。

1) 黃酒用量。取100 g威靈仙藥材5份，黃酒用量分別為6%、9%、12%、15%和18%，固定悶潤(rùn)時(shí)間為12 h，用12%蜜麩于溫度180℃下炒制10 min取出，篩去蜜麩皮，放涼，粉碎。

2) 悶潤(rùn)時(shí)間。取100 g威靈仙藥材5份，在最佳黃酒用量下，分別悶潤(rùn)8 h、10 h、12 h、14 h和16 h，用12%蜜麩于溫度180℃下炒制時(shí)間10 min取出，篩去蜜麩皮，放涼，粉碎。

3) 蜜麩用量。取100 g威靈仙藥材5份，在最佳黃酒用量及悶潤(rùn)時(shí)間下，蜜麩用量分別為3%、6%、9%、12%和15%，于溫度180℃下炒制10 min取出，篩去蜜麩皮，放涼，粉碎。

4) 炒制溫度。取100 g威靈仙藥材5份，在最佳黃酒用量、悶潤(rùn)時(shí)間及蜜麩用量下分別于140℃、160℃、180℃、200℃和220℃下炒制10 min取出，篩去蜜麩皮，放涼，粉碎。

5 ) 炒制時(shí)間。取100 g威靈仙藥材5份，在最佳黃酒用量、悶潤(rùn)時(shí)間、蜜麩用量及炒制溫度下分別炒制6 min、8 min、10 min、12 min和14 min，取出篩去蜜麩皮，放涼，粉碎。

1.2.4 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì) 由于不同炒制時(shí)間的威靈仙飲片中齊墩果酸含量差異較小，說(shuō)明該因素對(duì)酒潤(rùn)麩炒威靈仙飲片炮制工藝沒(méi)有影響，因此該因素不納入響應(yīng)面試驗(yàn)。在參考相關(guān)文獻(xiàn)[8-12]及預(yù)試驗(yàn)和單因素試驗(yàn)考察的基礎(chǔ)上，選擇黃酒用量(A)、悶潤(rùn)時(shí)間(B)、蜜麩用量(C)和炒制溫度(D)為考察因素，根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，采Design-Expert 8.0.6設(shè)計(jì)4因素3水平共29個(gè)處理的響應(yīng)面試驗(yàn)，其中中心點(diǎn)試驗(yàn)5次重復(fù)；以色譜圖中齊墩果酸的含量為響應(yīng)值對(duì)酒潤(rùn)麩炒威靈仙飲片炮制工藝進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化，其因素與水平值設(shè)置見表1。

表1威靈仙飲片炮制工藝的響應(yīng)面試驗(yàn)因素及水平

Table 1 Factor and level of response surface test for processing technology ofC.chinensisdecoction pieces

水平 Level蜜麩用量/% Honey bran dosage黃酒用量/% Rice wine dosage悶潤(rùn)時(shí)間/h Moistening time炒制溫度/℃ Stir-baking temperature-196818001212102001151812220

1.2.5 最佳工藝的驗(yàn)證 取威靈仙藥材3份，按響應(yīng)面試驗(yàn)優(yōu)選出來(lái)的工藝參數(shù)進(jìn)行炮制。并測(cè)定齊墩果酸含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用SPSS20.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，Design Expert 8.0.6 對(duì)響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對(duì)威靈仙飲片齊墩果酸含量的影響

從表2可知，隨著黃酒用量及蜜麩用量的增加、悶潤(rùn)時(shí)間及炒制時(shí)間的延長(zhǎng)及炒制溫度的升高齊墩果酸含量均呈先升后降趨勢(shì)。黃酒用量、悶潤(rùn)時(shí)間、蜜麩用量、炒制溫度和炒制時(shí)間分別為12%、10 h、12%、200℃和14 min的威靈仙飲片齊墩果酸含量在各單因素處理中最高，分別為1.67%、1.70%、1.67%、1.75%和1.67%。

表2 不同因素下威靈仙飲片的齊墩果酸含量

2.2 威靈仙飲片的最佳炮制工藝

2.2.1 二次回歸模型的建立 從表3可知，不同處理威靈仙飲片齊墩果酸含量。對(duì)其結(jié)果進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合，得到回歸模型為齊墩果酸含量=1.63-0.023A+0.013B+0.12C-0.016D+0.053AB+0.073AC+0.045AD-0.038BC+0.045BD-0.0075CD+0.028A2+0.13B2-0.29C2+0.072D2(R2=0.911 4)。經(jīng)方差分析，回歸模型P<0.000 1，說(shuō)明模型極顯著；失擬項(xiàng)P為0.062 7，不顯著，對(duì)模型是有利的，無(wú)明顯失擬因素存在，表明該回歸模型的擬合情況良好，因此可用該回歸方程代替試驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。此外，因素C、B2和C2為顯著影響因素，其P值分別為0.000 3、0.002 2和< 0.000 1，說(shuō)明對(duì)酒潤(rùn)麩炒威靈仙飲片中齊墩果酸含量影響較顯著，其他項(xiàng)不顯著。

表3 威靈仙飲片炮制工藝各處理的齊墩果酸含量

2.2.2 響應(yīng)面分析 響應(yīng)面圖及等高線圖反應(yīng)2個(gè)變量對(duì)齊墩果酸含量的交互影響。從圖1～3看出， BC交互的曲線最陡，說(shuō)明對(duì)齊墩果酸含量的影響最顯著； DC交互的曲線稍陡，說(shuō)明影響較顯著；AC交互的曲線趨于平緩，響應(yīng)值變化較小，說(shuō)明影響不顯著。因素間交互作用的影響依次為BC>DC>AC。

2.2.3 最佳工藝及驗(yàn)證 用Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化法預(yù)測(cè)最優(yōu)工藝為蜜麩用量9.6%，黃酒用量6.49%，悶潤(rùn)10.48 h，炒制溫度為181.5℃，預(yù)測(cè)含量為1.93%。考慮到實(shí)際操作方便，將威靈仙的酒麩制炮制工藝確定為取凈威靈仙藥材，加6%黃酒拌勻，悶潤(rùn)10 h后，晾干，稱取10%蜜麩、于180℃溫度下炒制，篩去蜜麩皮，放涼，即得。經(jīng)測(cè)定，最佳工藝下3次重復(fù)的齊墩果酸含量分別為1.93%、1.89%和1.88%，平均為1.90%。非常接近Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化法預(yù)測(cè)的含量值(1.93%)，說(shuō)明優(yōu)選出來(lái)的最佳工藝可靠。

3 結(jié)論與討論

根據(jù)貴州省2005版的《貴州省中藥飲片炮制規(guī)范》的炮制方法威靈仙酒潤(rùn)麩炒炮制工藝，將該工藝的影響因素暫定為黃酒用量、蜜麩用量、悶潤(rùn)時(shí)間、炒制溫度和炒制時(shí)間，采用單因素試驗(yàn)方法對(duì)上述影響因素進(jìn)行試驗(yàn)，結(jié)果表明，對(duì)威靈仙飲片中齊墩果酸含量影響較大的主要有黃酒用量、悶潤(rùn)時(shí)間、蜜麩用量、炒制溫度4個(gè)因素，炒制時(shí)間對(duì)其含量沒(méi)有影響，因此不納入該工藝影響因素之內(nèi)。在進(jìn)行 Box-Benhnken響應(yīng)面分析設(shè)計(jì)時(shí)，選擇黃酒用量、悶潤(rùn)時(shí)間、蜜麩用量、炒制溫度4個(gè)因素作為考察對(duì)象進(jìn)行Box-Benhnken 4因素3水平的中心組合試驗(yàn)。

在前期試驗(yàn)中與傳統(tǒng)的工藝優(yōu)選方法進(jìn)行對(duì)比研究發(fā)現(xiàn)，采用正交或均勻設(shè)計(jì)進(jìn)行優(yōu)化，而這2種設(shè)計(jì)的方法均是以線性數(shù)學(xué)模型進(jìn)行擬合，雖具有試驗(yàn)次數(shù)少的優(yōu)點(diǎn)，但精確度不高，所建立的數(shù)學(xué)模型預(yù)測(cè)性較差。Box-Benhnken響應(yīng)面分析法采用多元二次方程擬合考察因素和響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，可得出影響因素和響應(yīng)值之間的相互關(guān)系，最終優(yōu)選出最優(yōu)的工藝參數(shù)，該方法進(jìn)一步提升了精準(zhǔn)度，具有試驗(yàn)次數(shù)相對(duì)較少，效率更高，可預(yù)測(cè)的優(yōu)點(diǎn)。

試驗(yàn)結(jié)果表明，威靈仙飲片的最佳炮制工藝為取凈威靈仙藥材100 g，加黃酒6%拌勻，悶潤(rùn)10 h后，稱取10%蜜麩、于溫度180℃下炒制，篩去蜜麩皮，放涼，即得。該飲片質(zhì)量檢測(cè)指標(biāo)符合藥典要求，且驗(yàn)證性試驗(yàn)結(jié)果也表明，實(shí)測(cè)值(1.9.%)和預(yù)測(cè)值(1.93%)非常接近，擬合的數(shù)學(xué)模型方程相關(guān)系數(shù)R2=0.911 4，可見，通過(guò)Box-Benhnken效應(yīng)面優(yōu)化酒潤(rùn)麩炒威靈仙飲片的炮制工藝方案設(shè)計(jì)是合理的。