氣調(diào)貯藏對(duì)大蒜鱗莖膜脂過氧化系統(tǒng)的影響

白友強(qiáng) ，陶金華 ，何 梅，許 建,*

（1.青島酒店管理職業(yè)技術(shù)學(xué)院，山東 青島 266100；2.新疆農(nóng)業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院園林科技分院，新疆 昌吉 831100）

大蒜(Allium sativumL.)為百合科蔥屬草本植物，大蒜采收后經(jīng)過休眠期后鱗芽中胚芽開始生長(zhǎng)，生理代謝活動(dòng)加劇，導(dǎo)致其營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗增加，品質(zhì)劣變[1-2]。氣調(diào)貯藏是目前國(guó)際上較為先進(jìn)的貯藏保鮮方式之一，通過調(diào)控貯藏環(huán)境中的氣體體積分?jǐn)?shù)、溫度、濕度等條件，降低果蔬的呼吸強(qiáng)度，從而達(dá)到保持產(chǎn)品品質(zhì)的目的[3-4]。Choi等[5]研究了人工氣調(diào)貯藏（CA）和自發(fā)氣調(diào)（MA）對(duì)大蒜貯藏效果的影響，認(rèn)為CA與MA均能夠顯著延緩大蒜品質(zhì)的劣變。

果蔬在貯藏過程中，細(xì)胞內(nèi)活性氧代謝平衡被破壞，自由基的大量產(chǎn)生與積累加劇了對(duì)果蔬組織細(xì)胞的傷害，從而加速了果蔬的衰老[6]。膜脂過氧化是構(gòu)成生物膜的不飽和脂肪酸發(fā)生自由基反應(yīng)，研究認(rèn)為膜脂過氧化過程中自由基與丙二醛（MDA）對(duì)生物膜均有嚴(yán)重的損害作用[7]，這種損害主要是通過細(xì)胞膜中蛋白的聚合、交聯(lián)以及類脂的變化引起。過氧化物酶（POD）、超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化氫酶（CAT）以及抗壞血酸過氧化物酶（APX）等抗氧化酶被認(rèn)為是植物體內(nèi)重要的活性氧清除系統(tǒng)，對(duì)自由基清除與活性氧代謝平衡有重要作用[8-9]。黃瓜在受到逆境脅迫時(shí)，體內(nèi)的抗氧化酶系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生相應(yīng)的防御響應(yīng)[10]。

前人研究認(rèn)為，不適的氣調(diào)參數(shù)會(huì)加速產(chǎn)品品質(zhì)的劣變，如出現(xiàn)高二氧化碳傷害、異味等不良現(xiàn)象[11]。氣調(diào)貯藏過程中，O2、CO2比例是影響貯藏效果的重要因素，而目前針對(duì)大蒜的這一研究鮮見報(bào)道。為此，探究適宜的氣調(diào)貯藏參數(shù)對(duì)大蒜貯藏保鮮有重要意義。本文以新疆本地產(chǎn)的白皮蒜為試材，研究不同氣調(diào)參數(shù)對(duì)大蒜鱗莖膜脂過氧化系統(tǒng)的影響，以期為大蒜氣調(diào)貯藏提供技術(shù)參考與理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

新疆白皮蒜：該大蒜為春播大蒜，待大蒜完全生理成熟后，于2015年9月中旬采收，采收后自然陰干，選取無損傷、無病蟲害、蒜皮顏色正常，大小均勻的鱗莖。

磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、愈創(chuàng)木酚、過氧化氫、氮藍(lán)四唑（NBT）、核黃素、三氯乙酸（TCA）、硫代巴比妥酸（TBA）等均為分析純。

1.1.2 儀器與設(shè)備

TU-1810型紫外可見分光光度計(jì)，購(gòu)于北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；GL-20-Ⅱ型高速冷凍離心機(jī)，購(gòu)于上海安亭科學(xué)儀器有限公司；AL204-IC型電子天平，購(gòu)于梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；600型恒溫水浴鍋，購(gòu)于上海一恒科學(xué)儀器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

在冷藏條件下（4~6℃），本試驗(yàn)設(shè)置不同的O2和CO2濃度比例，其中O2濃度固定比例為3.5%，CO2濃度設(shè)置4個(gè)梯度，分別為5%、8%、11%、14%，其他以N2補(bǔ)充。充氣包裝時(shí)，先使用真空包裝機(jī)在真空度0.09 MPa下排除空氣，并熱封；然后使用針管注射器按照比例注入不同體積氣體。為保證袋內(nèi)氣體成分穩(wěn)定，每周使用真空包裝機(jī)排凈袋內(nèi)氣體，并按照設(shè)定比例重新注入新氣體。包裝袋材質(zhì)為聚乙烯（PE）復(fù)合鄰苯基苯酚（OPP），厚度為60 μm，包裝袋尺寸為：25 cm×18 cm，每個(gè)包裝中注入氣體總體積為200 mL，每個(gè)袋子中6個(gè)鱗莖，設(shè)置4次重復(fù)，每30 d取樣一次，共取5次樣，4個(gè)處理，共計(jì)80個(gè)氣調(diào)包裝袋，480個(gè)鱗莖。

每次取相應(yīng)的單獨(dú)包裝袋，將塑料袋剪開后選取完整、未病害腐爛的大蒜鱗莖，去掉蒜皮后用液氮急速充分速凍處理，然后將凍樣存放于-30℃冰箱中，用于測(cè)定相關(guān)指標(biāo)。

1.2.2 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.2.2.1 過氧化物酶（POD）活性

采用分光光度法，參照曹建康等[12]方法，并在此基礎(chǔ)上略做修改。測(cè)定時(shí)準(zhǔn)確稱取0.5 g凍樣，在預(yù)冷的研缽中加入2 mL 0.05 mol·L-1pH 7.0的磷酸緩沖液冰浴研磨，加緩沖液使最終體積為5 mL。將提取液于10 000 r·min-1冷凍離心20 min，上清液即為酶液，置于4℃冰箱中備用。測(cè)定時(shí)取0.1 mL酶液，反應(yīng)體系為 2.9 mL。POD 反應(yīng)體系：100 mmol·L-1pH 6.0 的磷酸緩沖液100 mL，內(nèi)含56 μL愈創(chuàng)木酚和38 μL 30%過氧化氫；以每克樣品（鮮重）每分鐘吸光度變化值1為1個(gè)活性單位（U）。

1.2.2.2 過氧化氫酶（CAT）活性

參照曹建康等[12]方法，酶液提取方法與“1.2.2.1”相同，測(cè)定時(shí)取0.1 mL酶液，反應(yīng)體系為2.9 mL。反應(yīng)體系：50 mmol·L-1pH 7.0的磷酸緩沖液100 mL，內(nèi)含 30%過氧化氫溶液 227 μL。以每克樣品（鮮重）每分鐘吸光度變化值變化0.01為1個(gè)活性單位（U）。

1.2.2.3 超氧化物歧化酶（SOD）活性

參照曹建康等[12]方法，反應(yīng)體系：50mmol·L-1pH7.8的磷酸緩沖液1.7 mL，130 mmol·L-1NET溶液0.3 mL，750 μmol·L-1NBT 0.3 mL，100 μmol·L-1EDTA-Na2溶液 0.3 mL，20 μmol·L-1核黃素 0.3 mL。以每分鐘每克樣品（鮮重）的反應(yīng)體系對(duì)氮藍(lán)四唑光化還原的抑制為50%為一個(gè)SOD活性單位（U）表示。

1.2.2.4 抗壞血酸氧化酶（APX）活性

測(cè)定方法參照曹建康等[12]的方法，反應(yīng)體系為：2.6 mL反應(yīng)緩沖液（含0.1 mmol/L EDTA和0.5 mmol/L抗壞血酸）+0.3 mL 2 mmol/L H2O2+0.1 mL酶液。在290 nm處測(cè)定吸光度值，以蒸餾水為參比進(jìn)行調(diào)零，每隔30 s記錄一次，連續(xù)測(cè)定7個(gè)數(shù)據(jù)點(diǎn)。以每克樣品（鮮重）每分鐘吸光度變化值變化0.01為1個(gè)活性單位（U）。

1.2.2.5 丙二醛含量

參考曹建康等[12]方法，采用硫代巴比妥酸（TBA）法。兩者反應(yīng)生成紅棕色的三甲基復(fù)合物（3,5,5-三甲基惡唑-2,4-二酮），該復(fù)合物在波長(zhǎng)532 nm處有最大光吸收，單位：nmol·g-1。

1.2.3 數(shù)據(jù)處理

采用DPS6.55軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，方差分析采用LSD（最小顯著性差異）進(jìn)行差異檢驗(yàn)（α=0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同氣調(diào)貯藏對(duì)大蒜鱗莖POD活性的影響

過氧化物酶（POD）是植物體內(nèi)產(chǎn)生的一類氧化還原酶，在果蔬成熟衰老過程中其活性不斷變化，是以過氧化氫（H2O2）為電子受體進(jìn)而催化底物氧化的酶。果蔬在貯藏過程中，或者植株在逆境環(huán)境會(huì)因H2O2累積而刺激POD活性升高，此時(shí)表明抵御氧化劑對(duì)膜系統(tǒng)破壞的能力增強(qiáng)。由圖1可見，在大蒜氣調(diào)貯藏過程中，POD活性呈持續(xù)上升趨勢(shì)，處理組間在貯藏期60 d內(nèi)差異較小，隨后差異增大。貯藏60 d時(shí)，氣調(diào)貯藏各處理POD活性介于13.46~15.68 U，組間差異較小。各處理POD活性在90~120 d有快速升高的趨勢(shì)。隨著貯藏時(shí)間的延長(zhǎng)，CO2濃度5%處理組的酶活性有所下降，CO2濃度為14%時(shí)，POD活性急劇上升，且至150 d時(shí)為43.51 U。由此可見，氣調(diào)貯藏條件下CO2濃度增加能夠刺激POD活性的升高。

2.2 不同氣調(diào)貯藏對(duì)大蒜鱗莖CAT活性的影響

果蔬體內(nèi)積累的過氧化氫（H2O2）能夠直接或間接地導(dǎo)致細(xì)胞膜脂質(zhì)過氧化損害，從而加速細(xì)胞的衰老和凋亡。而過氧化氫酶（CAT）能夠催化H2O2分解為水和分子氧，從而減少H2O2對(duì)果蔬組織造成的氧化傷害。由圖2可見，在氣調(diào)貯藏過程中，CAT活性出現(xiàn)峰值然后下降。各處理組在貯藏30 d時(shí)活性有所下降，下降幅度較一致，組間差異不顯著。而在貯藏60 d時(shí)，4個(gè)處理組皆達(dá)到活性高峰，且二氧化碳濃度越高，其處理組的酶活性越大，CO2濃度14%、11%處理組的CAT活性分別為 326.94、285.86 U，8%與5%處理組酶活性分別為248.17、256.85 U，兩者間差距不顯著。貯藏期超過60d后，各組酶活性均有不同程度下降，至150d時(shí)，以CO2濃度8%處理組活性最高，為179.05U，而其他處理組酶活性介于123.26~133.11 U，CO2濃度達(dá)到11%時(shí)活性降低幅度較大。由此可見，氣調(diào)貯藏條件下CO2濃度增加促使CAT活性的升高，隨著貯藏期的延長(zhǎng)，以8%CO2濃度的CAT活性最高。

2.3 不同氣調(diào)貯藏對(duì)大蒜鱗莖SOD活性的影響

2.4 不同氣調(diào)貯藏對(duì)大蒜鱗莖APX活性的影響

抗壞血酸過氧化物酶（APX）是以抗壞血酸為電子供體的專一性過氧化物酶，能夠催化過氧化氫與抗壞血酸發(fā)生氧化-還原反應(yīng)，使抗壞血酸氧化形成單脫氫抗壞血酸[11]。由圖4可見，在大蒜鱗芽氣調(diào)貯藏期內(nèi)，APX活性整體呈先升高后下降趨勢(shì)。貯藏30 d時(shí)，APX活性均有所上升，以CO2濃度11%組的活性最高，為191.40 U；CO2濃度8%次之，為149.44 U；5%、14%處理組酶活性相對(duì)較低，分別為127.52、113.19 U。貯藏60 d時(shí)，各處理均有所下降，以CO2濃度8%、11%下降幅度最大，分別降至85.67、168.54 U。貯藏90~120 d時(shí)，各處理組酶活性相對(duì)穩(wěn)定，變化幅度較小，以CO2濃度5%、14%酶活性相對(duì)較高。貯藏至150 d時(shí)，8%處理組酶活性最低，為31.18 U，其他處理組介于58.53~75.88 U。CO2濃度8%~11%時(shí)，APX活性較高，而以5%處理酶活性較穩(wěn)定。

2.5 不同氣調(diào)貯藏對(duì)大蒜鱗莖丙二醛含量影響

丙二醛作為膜脂過氧化的重要產(chǎn)物之一，是植物衰老生理和抗逆生理中的常用評(píng)價(jià)指標(biāo)，能夠通過影響線粒體呼吸鏈復(fù)合物與線粒體內(nèi)關(guān)鍵酶活性，繼而加劇生物膜的損傷。由圖5可見，在大蒜鱗莖氣調(diào)貯藏過程中，MDA含量呈持續(xù)上升趨勢(shì)，11%CO2處理組持續(xù)在較高水平。CO2濃度11%、14%較5%、8%處理組提前進(jìn)入MDA含量快速增加期。在貯藏150 d內(nèi)，5%CO2與8%CO2處理組的MDA含量為較穩(wěn)定上升，由初始值16.1 nmol·g-1分別升高至22.1、23.3 nmol·g-1。在貯藏 120 d 內(nèi)，CO2濃度14%處理組上升至20.6 nmol·g-1，升幅緩慢，而在150 d時(shí)急劇升高至 34.6 nmol·g-1，變化顯著（P＜0.05）。11%CO2處理組的大蒜鱗莖在貯藏90 d內(nèi)上升幅度較穩(wěn)定，升高至 21.3 nmol·g-1，而在 120~150 d 時(shí)，分別快速升高至26.9、32.9 nmol·g-1。由此可見，CO2濃度升高促進(jìn)細(xì)胞膜脂過氧化，MDA含量持續(xù)上升。

3 討論與結(jié)論

低氧/高二氧化碳環(huán)境下能夠較好保持果蔬的貯藏品質(zhì)，但園藝作物對(duì)二氧化碳和低氧的敏感度不同，易于造成脅迫傷害而加促品質(zhì)劣變，目前針對(duì)大蒜鱗莖氣調(diào)貯藏的氣體參數(shù)研究較少。不適宜的貯藏環(huán)境將加劇鱗莖膜脂過氧化速度，因此研究該部分內(nèi)容能夠探明氣調(diào)參數(shù)對(duì)大蒜鱗莖的影響。試驗(yàn)結(jié)果顯示：在氣調(diào)貯藏過程中，POD、CAT、SOD、APX 四種抗氧化酶活性均有不同程度的上升，但上升規(guī)律有所差異。POD活性呈持續(xù)上升趨勢(shì)，且在60 d內(nèi)各處理組變化均較為緩慢，而CAT、SOD、APX活性變化幅度較大，均出現(xiàn)活性高峰。60 d后活性變化加劇，且二氧化碳濃度大于11%時(shí)酶活性表現(xiàn)較高，以貯藏期60 d的CAT活性表現(xiàn)尤為顯著。形成這一現(xiàn)象的原因可能是：一方面，在貯藏60 d內(nèi)，大蒜在該貯藏階段尚處于休眠期至休眠破除期，該階段大蒜鱗芽生理代謝活動(dòng)微弱，受到氣體環(huán)境影響不敏感；另一方面，休眠期破除后，鱗莖自身的呼吸代謝將消耗氧氣而釋放二氧化碳，繼續(xù)改變貯藏環(huán)境中O2與CO2比例，使得CO2濃度持續(xù)升高，由此帶來高二氧化碳/低氧脅迫傷害，使得抗氧化酶活性升高。

研究認(rèn)為，正常情況下植物體內(nèi)抗氧化酶活性維持在一定水平，當(dāng)脅迫發(fā)生時(shí)，抗氧化系統(tǒng)將被激活，多種酶的活性相對(duì)升高[13]。所以，大量的自由基積累激發(fā)抗氧化酶系統(tǒng)啟動(dòng)，提升了抗氧化酶活性。APX作為專一催化抗壞血酸與過氧化氫發(fā)生氧化-還原反應(yīng)的過氧化物酶，能夠清除細(xì)胞內(nèi)積累的H2O2[12]。本研究中發(fā)現(xiàn)，貯藏30 d時(shí)以CO2濃度11%處理組大蒜鱗莖APX活性最高，而CO2濃度14%組保持在較低水平。究竟其原因有以下可能：一方面是高二氧化碳條件抑制了大蒜的生理活動(dòng)，使得呼吸強(qiáng)度降低；另一方面，在抗氧化酶系統(tǒng)中，POD、CAT均以H2O2為底物清除自由基，POD、CAT活性變化競(jìng)爭(zhēng)性地影響APX活性。

MDA是膜脂過氧化的終端產(chǎn)物，能夠直接反映膜脂過氧化程度。由試驗(yàn)結(jié)果可見，當(dāng)CO2濃度高于8%時(shí)，MDA含量顯著升高，可見大蒜鱗莖氣調(diào)貯藏的氣體配比中CO2濃度不應(yīng)高于8%。結(jié)合抗氧化酶活性變化可見，MDA對(duì)CO2濃度的響應(yīng)變化規(guī)律與其相似，即高濃度CO2誘導(dǎo)抗氧化酶活性升高，增促M(fèi)DA積累。

石海燕等[14]研究了“紫花”芒果在低溫氣調(diào)貯藏條件下SOD、CAT、POD活性的變化趨勢(shì)，研究認(rèn)為這三種酶活性在芒果后熟過程中呈上升趨勢(shì)，而氣調(diào)貯藏能夠顯著抑制其活性。羅淑芬等[15]研究氣調(diào)包裝對(duì)刀豆抗氧化酶活性的影響，氣體組分在1%～4%O2+1%CO2時(shí)能夠抑制刀豆PPO活性的上升和SOD活性的降低。本試驗(yàn)研究認(rèn)為，在3.5%O2+5%～8%CO2氣調(diào)貯藏條件下，能夠延緩大蒜抗氧化酶活性的升高，抑制MDA累積，減輕膜脂過氧化程度，從而保持大蒜鱗莖的品質(zhì)。