青麥仁凍藏期內(nèi)菌相分析及優(yōu)勢(shì)菌的分離鑒定

高玲玲，張康逸，何夢(mèng)影，康志敏，溫青玉，趙 迪

（河南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)副產(chǎn)品加工研究中心，河南 鄭州 450002）

青麥仁是指在乳熟后期、蠟熟期收獲的小麥粒，此時(shí)期的麥仁雖已飽滿但尚未成熟，呈淺青色或碧綠色。與成熟小麥相比，青麥仁具有獨(dú)特的口味和特殊的香氣，且其含有豐富的蛋白質(zhì)、膳食纖維和α、β兩種淀粉酶，具有幫助人體消化、降低血糖的功能[1-2]，深受消費(fèi)者喜愛(ài)。近年來(lái)，隨著人民生活水平的提高和膳食結(jié)構(gòu)的改善，青麥仁市場(chǎng)需求量逐年增加，市場(chǎng)前景廣闊。

一般情況下，小麥安全貯藏的含水量為12%~14%[3]。而青麥仁季節(jié)性強(qiáng)、收獲期短、含水量高，不適宜常溫貯藏。速凍能較好地保持其原有的色澤、香氣及營(yíng)養(yǎng)價(jià)值[4]，是鮮食谷物類(lèi)產(chǎn)品加工和貯藏的重要方式之一[5-6]。但由于青麥仁營(yíng)養(yǎng)豐富，水分活度較高，在收獲后進(jìn)行加工和冷凍貯藏過(guò)程中，一旦條件適宜其殘留的微生物就會(huì)迅速生長(zhǎng)繁殖，導(dǎo)致青麥仁腐敗，產(chǎn)生諸如色澤、風(fēng)味的改變，甚至營(yíng)養(yǎng)成分被破壞等不同程度的品質(zhì)問(wèn)題[7-9]。因此，對(duì)速凍青麥仁中的菌相進(jìn)行分析以及探討引起青麥仁腐敗變質(zhì)的優(yōu)勢(shì)微生物的種類(lèi)、數(shù)量等，不僅能夠了解和掌握速凍青麥仁加工與速凍過(guò)程中的優(yōu)勢(shì)菌群，為青麥仁防腐抑菌試驗(yàn)提供目標(biāo)菌，同時(shí)也可以為青麥仁腐敗變質(zhì)機(jī)制的分析和腐敗菌控制措施的制定提供理論依據(jù)。

經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，食品貯藏過(guò)程中易受細(xì)菌和霉菌的影響[10-11]。但關(guān)于凍藏期食品菌相的研究報(bào)道多集中在米面制品、肉類(lèi)、奶類(lèi)及水產(chǎn)等[12-15]，對(duì)于凍藏期內(nèi)鮮食谷物菌相及優(yōu)勢(shì)菌的研究則未見(jiàn)報(bào)道。本研究以凍藏期內(nèi)的青麥仁為對(duì)象，在傳統(tǒng)分離方法的基礎(chǔ)上，分析速凍青麥仁的菌相，并結(jié)合16S rDNA對(duì)優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行鑒定，研究青麥仁凍藏期內(nèi)優(yōu)勢(shì)菌株出現(xiàn)的可能性，對(duì)青麥仁貯藏保鮮、貨架期預(yù)測(cè)及生物控制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 材料與試劑

貯藏于-20℃的速凍青麥仁：由本實(shí)驗(yàn)室提供。

PCA培養(yǎng)基、孟加拉紅培養(yǎng)基、改良MC培養(yǎng)基、PDA培養(yǎng)基、YNA培養(yǎng)基、NA培養(yǎng)基、明膠培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基、蛋白胨、酵母浸粉、葡萄糖、瓊脂、硫酸鎂、碳酸鈣，購(gòu)于北京奧博星生物技術(shù)有限公司；磷酸二氫鉀、氫氧化鈉、氯化鈉、無(wú)水乙醇，購(gòu)于天津市科密歐化學(xué)試劑開(kāi)發(fā)中心；DNA純化試劑盒，購(gòu)于北京百泰克生物技術(shù)有限公司；引物合成，生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備

SPX-250B-Z型生化培養(yǎng)箱，SW-CJ-1bu型潔凈工作臺(tái)，YXQ-LS-50S11型高壓滅菌鍋，HNY-2102C型恒溫培養(yǎng)振蕩器，BCD-202TD型冰箱，XSP-BM-2MC型顯微鏡，HH-S2型恒溫水浴槽，JB/T5374型電子天平，ABI-2720型PCR儀。

1.2 方法

利用傳統(tǒng)微生物培養(yǎng)法和菌落PCR技術(shù)進(jìn)行青麥仁凍藏期內(nèi)微生物種類(lèi)及優(yōu)勢(shì)菌的分析。

1.2.1 樣品的預(yù)處理

將貯藏于-20℃的青麥仁取出后在無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)分裝成10 g/份的樣品后立即進(jìn)行各項(xiàng)指標(biāo)測(cè)定，所用器具均經(jīng)過(guò)高溫殺菌。

1.2.2 菌相分析

利用選擇性培養(yǎng)基對(duì)速凍青麥仁中的細(xì)菌、乳酸菌、芽孢桿菌、霉菌酵母菌進(jìn)行平板計(jì)數(shù)，培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件見(jiàn)表1。

表1 不同菌相的選擇性培養(yǎng)基的培養(yǎng)條件Table 1 Incubation conditions and selective media for different microflora

1.2.2.1 速凍青麥仁菌相的分離純化

稱(chēng)取青麥仁10 g，加入90 mL無(wú)菌水，用無(wú)菌研缽研成勻漿。將青麥仁勻漿按比例10-3、10-4、10-5的稀釋梯度進(jìn)行稀釋?zhuān)靡埔簶尫謩e吸取1 mL懸液至各選擇性培養(yǎng)基中，用涂布器涂布均勻后，每個(gè)稀釋度重復(fù)3次，置于28℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h后，取適當(dāng)稀釋度的瓊脂平板計(jì)算菌落總數(shù)。

在培養(yǎng)基上選取典型菌落在相應(yīng)的選擇性培養(yǎng)基上反復(fù)劃線分離純化后進(jìn)行培養(yǎng)，將純化好的單菌落制成15%甘油菌懸液，放入-80℃冰箱保存。

1.2.2.2 菌相基本形態(tài)特征

對(duì)分離純化后的單個(gè)細(xì)菌的菌落形態(tài)（包括菌落顏色、菌落形狀、菌落隆起度、菌落邊緣、菌落透明度、表面形態(tài)、質(zhì)地等）進(jìn)行觀察、記錄[16]。

1.2.3 優(yōu)勢(shì)微生物的鑒定

1.2.3.1 生理生化試驗(yàn)

參考東秀珠等[17]的方法對(duì)優(yōu)勢(shì)微生物進(jìn)行生理生化鑒定。

1.2.3.2 16S rDNA序列測(cè)定

將優(yōu)勢(shì)菌株按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明提取細(xì)菌DNA，細(xì)菌擴(kuò)增所用的引物為通用引物27f和 1492r(1)。上游引物 27f：5′-AGAGTTTGATCCT GGCTCAG-3′，下游引物 1492(1)：5′-GGTTACCTTGT TACGACTT-3′。PCR擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性5 min，94℃變性45 s，55℃退火45 s，72℃延伸45 s，共30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10 min，PCR產(chǎn)物經(jīng)電泳檢測(cè)后送上海生工測(cè)序。將測(cè)序的拼接結(jié)果在NCBI網(wǎng)站上利用Blast軟件在GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行同源性分析。采用MEGA4.0軟件依據(jù)鄰位相鄰法對(duì)所有分離鑒定菌株的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中序列進(jìn)行分析比較，繪出系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析與制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 速凍青麥仁的菌相分析

在一種或一類(lèi)食品中，內(nèi)在各種微生物之間相互競(jìng)爭(zhēng)與拮抗、互利共生或偏利共生以適應(yīng)各自環(huán)境條件而共存于食品內(nèi)環(huán)境中，形成了特定微生物群體分布，稱(chēng)為食品微生物菌相[18]。青麥仁由于含水量較成熟小麥高，凍藏過(guò)程中溫度波動(dòng)易受微生物污染使其品質(zhì)降低，而導(dǎo)致谷物變質(zhì)的微生物主要是細(xì)菌和霉菌[19-20]。因此，本研究取貯藏于-20℃冰箱的青麥仁，分別采用PCA培養(yǎng)基、CFC培養(yǎng)基、改良MC培養(yǎng)基和孟加拉紅培養(yǎng)基分析速凍青麥仁中微生物菌群基本構(gòu)相。

通過(guò)對(duì)速凍青麥仁菌相分析（圖1）可知：在青麥仁凍藏期間，細(xì)菌為主要菌群，其中細(xì)菌總數(shù)為3.76 lg(CFU/g)。我國(guó)尚無(wú)對(duì)于速凍青麥仁的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，一般采用速凍面米制品的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)[21]作為標(biāo)準(zhǔn)。GB 19295—2011[21]中規(guī)定，速凍面米制品的菌落總數(shù)不應(yīng)超過(guò)4lg(CFU/g)，因此，鮮食青麥仁可通過(guò)速凍的方式貯藏。霉菌酵母菌相對(duì)較少，為0.56 lg(CFU/g)。這些微生物即青麥仁凍藏過(guò)程中的初始菌相，是解凍后引起青麥仁發(fā)生腐敗的主要原因。

2.2 菌相基本形態(tài)特征

通過(guò)對(duì)速凍青麥仁中的微生物分離純化，將形態(tài)特征一致的歸為一種，共得到細(xì)菌28種，真菌3種。各菌株形態(tài)特征如表2、表3所示。

2.3 優(yōu)勢(shì)微生物鑒定

細(xì)菌和霉菌只要環(huán)境適宜時(shí)，就能迅速繁殖，使某些菌群占優(yōu)勢(shì)，構(gòu)成解凍后的青麥仁腐敗時(shí)特征性菌相，造成其腐敗變質(zhì)。由于青麥仁中霉菌數(shù)量較細(xì)菌少，故從細(xì)菌中選取速凍青麥仁的優(yōu)勢(shì)微生物。分別統(tǒng)計(jì)28株細(xì)菌的菌落總數(shù)，按數(shù)量及所占比例選擇前3株作為優(yōu)勢(shì)菌株進(jìn)行鑒定，各菌株菌落總數(shù)如圖2所示。

通過(guò)對(duì)速凍青麥仁細(xì)菌菌落總數(shù)測(cè)定并結(jié)合基本形態(tài)觀察，選取3株優(yōu)勢(shì)微生物（QX-1、QX-4、QX-26）進(jìn)行生理生化試驗(yàn)和16S rDNA序列測(cè)定。

2.3.1 優(yōu)勢(shì)微生物的生理生化鑒定

上述生理生化試驗(yàn)結(jié)果表明：QX-1、QX-26為革蘭氏陰性菌，QX-4為革蘭氏陽(yáng)性菌。3株菌都為好氧菌，過(guò)氧化氫酶試驗(yàn)陽(yáng)性，在過(guò)低或者過(guò)高的溫度下都不適宜生長(zhǎng)，在鹽濃度低時(shí)生長(zhǎng)旺盛，鹽濃度過(guò)高時(shí)，菌株生長(zhǎng)受到抑制。QX-1和QX-26能使明膠液化，QX-1和QX-4能使淀粉水解（表4）。

表4 優(yōu)勢(shì)微生物生理生化試驗(yàn)結(jié)果Table 4 Results of conventional physiological and biochemical tests of dominant microorganisms

2.3.2 16S rDNA序列測(cè)定

將分離得到的3株優(yōu)勢(shì)菌QX-1、QX-4和QX-26進(jìn)行16S rDNA測(cè)序鑒定。提取這3株優(yōu)勢(shì)菌的基因組DNA，并以此為模板擴(kuò)增16S rDNA，經(jīng)電泳檢測(cè)（圖3），擴(kuò)增的條帶長(zhǎng)度約1 400 bp。將PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果在NCBI中進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)（圖4）。

由圖4可知，所有序列與己知菌株的序列相似度均≥98%，說(shuō)明鑒定結(jié)果可靠。經(jīng)分子生物學(xué)鑒定后3株菌株分別為：QX-1為鞘氨醇單胞菌屬、QX-4為微桿菌屬、QX-26為不動(dòng)桿菌屬。

3 結(jié)論與討論

采用菌落計(jì)數(shù)法測(cè)定速凍青麥仁中的菌落總數(shù)，其中細(xì)菌總數(shù)為3.76 lg(CFU/g)。由于我國(guó)尚無(wú)對(duì)速凍青麥仁的衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)，故采用GB 19295—2011[21]速凍面米制品衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)為參考。標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定：速凍面米制品的菌落總數(shù)不應(yīng)超過(guò)4 lg(CFU/g)。由此可知，速凍是鮮食青麥仁最佳貯藏方式之一。

大部分微生物在速凍貯藏條件下其生長(zhǎng)繁殖因溫度因素影響而受到抑制。微桿菌屬及不動(dòng)桿菌屬菌株常見(jiàn)于冷凍食品中[22-24]，多為水產(chǎn)類(lèi)及肉類(lèi)，谷物類(lèi)則少見(jiàn)報(bào)道。鄧佳等[25]發(fā)現(xiàn)，微桿菌屬為導(dǎo)致藍(lán)莓腐爛的病原細(xì)菌，故猜測(cè)其有可能是速凍青麥仁中優(yōu)勢(shì)腐敗菌之一，應(yīng)對(duì)其進(jìn)行進(jìn)一步的研究。傅曉方等[26]從玉米中分離到的不動(dòng)桿菌具有固氮酶活性和產(chǎn)吲哚乙酸（IAA）、降解有機(jī)磷能力，且可促進(jìn)小麥幼苗生長(zhǎng)、降解玉米赤霉稀酮[27]。鞘氨醇單胞菌是一類(lèi)豐富的新型微生物資源，可用于芳香化合物的生物降解[28]，該屬菌株憑借自身的高代謝能力與多功能的生理特性，在環(huán)境保護(hù)及工業(yè)生產(chǎn)方面具有巨大的應(yīng)用潛力。孫建光等[29]在玉米及芹菜中發(fā)現(xiàn)內(nèi)生鞘氨醇單胞菌，而本試驗(yàn)中分離到的鞘氨醇單胞菌是青麥仁本身所具有的還是由于外界因素影響攜帶的尚有待進(jìn)一步驗(yàn)證，其應(yīng)用潛力也值得進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用。

本試驗(yàn)對(duì)凍藏期內(nèi)青麥仁菌相進(jìn)行分析可知，其細(xì)菌菌落總數(shù)為3.76 lg(CFU/g)。經(jīng)分離純化后得到特異性細(xì)菌28株，真菌3株，菌落基本形態(tài)觀察及菌落總數(shù)計(jì)數(shù)得到速凍青麥仁中優(yōu)勢(shì)菌群3株，經(jīng)生理生化鑒定及16S rDNA序列測(cè)定可知速凍青麥仁中的3株優(yōu)勢(shì)菌分別為：QX-1鞘氨醇單胞菌屬、QX-4微桿菌屬和QX-26不動(dòng)桿菌屬。