沉淀法制備的紫杉醇白蛋白微粒包封率測(cè)定1)

錢(qián)佳怡 隋小宇 潘虹 袁橙 董巖 簡(jiǎn)白羽

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，齊齊哈爾，161006)

紫杉醇(PTX)是從紅豆杉屬植物的樹(shù)皮和針葉中提取的一種次生代謝產(chǎn)物[1]，具有廣譜、高效的抗腫瘤效果，尤其是針對(duì)非小細(xì)胞肺癌、轉(zhuǎn)移性乳腺癌和難治愈性乳腺癌[2]。由于其在水中溶解度極低，很大程度上限制了其臨床應(yīng)用。目前，一些藥物載體制劑常用于解決其水溶性問(wèn)題，例如脂質(zhì)體、微球、固體脂質(zhì)納米粒、乳劑等[3]。

白蛋白微粒是由人或動(dòng)物的白蛋白制備而成的載藥系統(tǒng)[4]，多數(shù)由人血清白蛋白(HSA)或牛血清白蛋白(BSA)制備而成。白蛋白微粒載藥系統(tǒng)，無(wú)毒、生物相容性高[5]，可提高藥物的水溶性[6]，起到緩釋作用[7]。由于白蛋白載藥系統(tǒng)具有以上優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)在越來(lái)越多的將其用于藥物制劑，尤其是抗癌藥物制劑的研究或臨床應(yīng)用中，如紫杉醇白蛋白納米粒[8]。由于紫杉醇白蛋白載藥系統(tǒng)，不僅能降低藥物的不良反應(yīng)，并且用藥前無(wú)需進(jìn)行皮質(zhì)激素及抗組胺藥物的預(yù)處理，可直接用藥，提高患者用藥的順應(yīng)性；近年來(lái)已經(jīng)越來(lái)越多的應(yīng)用于卵巢癌、乳腺癌等疾病的臨床治療，成為癌癥治療的一線(xiàn)用藥[9]。

目前，白蛋白微粒的制備方法主要有乳化法-揮發(fā)法、噴霧干燥法、沉淀法等[10-12]。其中，乳化溶劑揮發(fā)法在制備過(guò)程中需要用到氯仿等中高毒性的有機(jī)溶劑，并且去除有機(jī)溶劑耗時(shí)長(zhǎng)，有殘留風(fēng)險(xiǎn)；噴霧干燥法在制備過(guò)程中存在粒徑不均勻、包封率低等問(wèn)題[10]；而沉淀法操作相對(duì)簡(jiǎn)單，不需使用中高毒性有機(jī)溶劑，且重復(fù)性較好，是一種環(huán)境友好并且高效的方法。目前，對(duì)于沉淀法制備白蛋白微粒的研究較少[13]。

包封率是白蛋白微粒制備過(guò)程中的一個(gè)重要評(píng)價(jià)指標(biāo)[14]，指被包封入微粒內(nèi)的藥物與體系中藥物總量的百分比。目前在沉淀法制備白蛋白微粒載藥系統(tǒng)的過(guò)程中，包封率的測(cè)定主要采用消化法[15]。但消化法在包封率測(cè)定過(guò)程中需反復(fù)離心，操作比較繁瑣。有機(jī)溶劑萃取法是一種利用藥物的溶解性，將難溶性游離藥物從體系中萃取出來(lái)的一種方法，可以用于脂溶性藥物載體系統(tǒng)包封率的測(cè)定，操作簡(jiǎn)單且重現(xiàn)性好，多用于載體藥物包封率的測(cè)定，但目前很少見(jiàn)到使用該方法測(cè)定白蛋白載藥系統(tǒng)包封率的相關(guān)研究。因此，本課題擬以紫杉醇白蛋白微粒作為模型藥物，以有機(jī)溶劑萃取法進(jìn)行包封率的測(cè)定。

1 材料與方法

1.1 材料及主要儀器

紫杉醇(大連美侖生物技術(shù)有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥98%；紫杉醇對(duì)照品(大連美侖生物技術(shù)有限公司，質(zhì)量分?jǐn)?shù)≥99%；牛血清白蛋白(大連美侖生物制藥有限公司)；色譜級(jí)甲醇、分析級(jí)二氯甲烷(北京百靈威科技有限公司)；水為自制超純水。

JY96-IIN型超聲波細(xì)胞破碎儀(上海滬析實(shí)業(yè)有限公司)；T6紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(北京普析通用儀器有限公司)；高效液相色譜儀(包括AS1000進(jìn)樣器、2000-檢測(cè)器、PC2001-二元泵、Laballiance工作站，天津市蘭博實(shí)驗(yàn)儀器設(shè)備有限公司)。

1.2 紫杉醇質(zhì)量濃度測(cè)定

吸收波長(zhǎng)的選擇：取紫杉醇對(duì)照品配制為50 mg·L-1的對(duì)照品溶液，在200～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外-可見(jiàn)全波長(zhǎng)掃描。

色譜條件[10]：色譜柱為C18(250.0 mm×4.6 mm，5 μm)；流動(dòng)相為V(甲醇)∶V(水)=75∶25；流速為1.0 mL·min-1；進(jìn)樣量為20 μL。

白蛋白微粒的制備：采用沉淀法制備紫杉醇-白蛋白微粒及空白微粒[13]。取處方量PTX溶于適量乙醇作為油相，將BSA分散于適量純化水中作為水相，在冰水浴下將乙醇迅速注入水相中，超聲5 min(超聲3 s，間歇3 s)，在渦旋下向其中加入BSA質(zhì)量15%的氯化鋅使PTX混懸液與BSA共沉淀，制得PTX-BSA微粒。同法制得空白微粒。

線(xiàn)性范圍的考察：取適量紫杉醇對(duì)照品，用二氯甲烷稀釋定容制備成10、15、20、50、75、100 mg·L-1，按試驗(yàn)設(shè)定的色譜條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖，以峰面積對(duì)紫杉醇質(zhì)量濃度進(jìn)行線(xiàn)性回歸。

精密度：①日內(nèi)精密度。精密吸取適量?jī)?chǔ)備液，二氯甲烷稀釋定容制備成40、50、60 mg·L-1，按試驗(yàn)設(shè)定的色譜條件進(jìn)樣分析，分別進(jìn)樣5次，記錄色譜圖，計(jì)算峰面積。②日間精密度。精密吸取適量?jī)?chǔ)備液，二氯甲烷稀釋定容制備成40、50、60 mg·L-1，按試驗(yàn)設(shè)定的色譜條件連續(xù)進(jìn)樣5 d，記錄色譜圖，計(jì)算峰面積。

回收率：精密吸取適量紫杉醇儲(chǔ)備液，稀釋至紫杉醇質(zhì)量濃度為40、50、60 mg·L-1，各3份，按試驗(yàn)設(shè)定的色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算回收率。

1.3 包封率測(cè)定

萃取法測(cè)定包封率：精密吸取320 μL紫杉醇白蛋白微粒，加入2 mL二氯甲烷，渦旋5 min，靜置15 min，取下層有機(jī)相液體[13]，過(guò)膜后按試驗(yàn)設(shè)定的色譜條件進(jìn)樣分析，計(jì)算體系中游離的紫杉醇質(zhì)量(m1)、投藥量(m2)。計(jì)算包封率(E)，E={(m2-m1)/m2}×100%。

游離藥物回收率：精密吸取適量紫杉醇儲(chǔ)備液，加水稀釋至紫杉醇質(zhì)量濃度為40、50、60 mg·L-1的溶液。取0.32 mL樣品溶液加2 mL二氯甲烷，置于離心管中，渦旋5 min，靜置15 min。取下層清液過(guò)濾，取續(xù)濾液，按試驗(yàn)設(shè)定的色譜條件進(jìn)樣分析，一式三份，計(jì)算回收率。

萃取法加樣回收率：精密吸取1 mL空白載體溶液，再精密吸取適量紫杉醇儲(chǔ)備液，加水稀釋至紫杉醇質(zhì)量濃度為40、50、60 mg·L-1的溶液。取樣品0.32 mL加入2 mL二氯甲烷溶液，置于離心管中，渦旋5 min，靜置15 min。取下層清液過(guò)濾，取續(xù)濾液，按試驗(yàn)設(shè)定的色譜條件進(jìn)樣分析，一式三份，計(jì)算回收率。

2 結(jié)果與分析

在200～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行紫外-可見(jiàn)全波長(zhǎng)掃描，結(jié)果顯示紫杉醇在227 nm處有最大吸收。因此，高效液相色譜法檢測(cè)紫杉醇質(zhì)量濃度時(shí)，確定檢測(cè)波長(zhǎng)為227 nm。

線(xiàn)性范圍檢測(cè)結(jié)果表明：紫杉醇在10～100 mg·L-1呈良好線(xiàn)性關(guān)系，回歸方程為A=0.691 3ρ+5.925，R2=0.999 5，式中的A為峰面積、ρ為紫杉醇質(zhì)量濃度。

日內(nèi)精密度試驗(yàn)結(jié)果表明：低中高3個(gè)紫杉醇質(zhì)量濃度樣品進(jìn)樣5次，計(jì)算峰面積的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)分別為0.63%、1.24%、1.62%。

日間精密度試驗(yàn)結(jié)果表明：低中高3個(gè)濃度樣品進(jìn)樣5次，計(jì)算峰面積的RSD分別為1.54%、1.60%、1.44%。

回收率試驗(yàn)結(jié)果表明：低中高3個(gè)紫杉醇質(zhì)量濃度平均回收率，分別為97.6%、95.8%、101.0%。

低中高3個(gè)紫杉醇質(zhì)量濃度的樣品溶液各3份，經(jīng)二氯甲烷渦旋萃取并過(guò)濾后，其濾液中藥物的平均回收率分別為94.86%、95.38%、98.61%(見(jiàn)表1)。

表1 游離紫杉醇回收率測(cè)定結(jié)果(n=5)

加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果表明：低中高3個(gè)紫杉醇質(zhì)量濃度平均回收率，分別為94.80%、96.92%、101.67%(見(jiàn)表2)。

表2萃取法測(cè)定紫杉醇白蛋白包封率的加樣回收率測(cè)定結(jié)果(n=5)

紫杉醇質(zhì)量濃度(萃取前測(cè)量值)/mg·L-1紫杉醇質(zhì)量濃度(萃取后測(cè)量值)/mg·L-1回收率/%4037.9294.805048.4696.926061.00101.67

取3批自制載藥微粒樣品，按試驗(yàn)設(shè)定方法分別測(cè)定包封率，每組測(cè)定3次，測(cè)定結(jié)果表明：采用有機(jī)溶劑萃取法測(cè)定的白蛋白微粒包封率在92.70%～94.10%之間(見(jiàn)表3)。

表3 紫杉醇白蛋白微粒包封率(n=3)

3 討論與結(jié)論

在難溶性藥物活性成分的制劑研究中，載體制劑以其特有的優(yōu)越性得到越來(lái)越廣泛的關(guān)注。其中白蛋白微粒作為一種安全、穩(wěn)定、降解能力高的藥物載體系統(tǒng)，得到了越來(lái)越多的應(yīng)用，而在其進(jìn)行制備及優(yōu)化過(guò)程中，包封率是一個(gè)重要的指標(biāo)。測(cè)定包封率時(shí)需要分離游離藥物與載體制劑，常用的方法有離心法、消化法等。其中，離心法在測(cè)定白蛋白載體藥物包封率時(shí)，需要通過(guò)離心將蛋白微粒與游離藥物及蛋白進(jìn)行分離，重現(xiàn)性較差，結(jié)果不穩(wěn)定。消化法操作較為復(fù)雜，使用不方便。有機(jī)溶劑萃取法一般用于脂溶性載體藥物包封率的測(cè)定，其操作簡(jiǎn)便、分離速度快，且結(jié)果較穩(wěn)定。本試驗(yàn)將該方法用于白蛋白微粒包封率的測(cè)定，具有一定的創(chuàng)新性。

在預(yù)試驗(yàn)中，曾對(duì)萃取法中的有機(jī)相進(jìn)行了初步篩選，包括二氯甲烷、正己烷及氯仿，綜合考慮藥物在有機(jī)相中的溶解度及有機(jī)相毒性，最后選擇二氯甲烷作為有機(jī)相進(jìn)行萃取。在包封率測(cè)定過(guò)程中，未與載體結(jié)合的藥物以游離的狀態(tài)存在于體系中；在萃取過(guò)程中，游離藥物被萃取到有機(jī)相中，而藥物載體不溶于有機(jī)相，從而將藥物載體與游離藥物分開(kāi)。在渦旋過(guò)程中，有輕微乳化現(xiàn)象出現(xiàn)，但結(jié)果表明，并未對(duì)回收率結(jié)果產(chǎn)生影響。在操作過(guò)程中，應(yīng)注意渦旋的時(shí)間以及樣品與有機(jī)相的比例，時(shí)間過(guò)短游離藥物萃取不完全，時(shí)間過(guò)長(zhǎng)則容易造成藥物載體破壞，導(dǎo)致藥物泄露；樣品與有機(jī)相的比例則不應(yīng)過(guò)大，比例過(guò)大易造成萃取次數(shù)增加，操作繁瑣。

本試驗(yàn)建立的紫杉醇白蛋白微粒包封率測(cè)定方法，操作簡(jiǎn)單、結(jié)果準(zhǔn)確、穩(wěn)定且重現(xiàn)性好，符合方法學(xué)要求，對(duì)紫杉醇白蛋白微粒的進(jìn)一步處方優(yōu)化及質(zhì)量控制具有一定意義，同時(shí)對(duì)于其他難溶性藥物活性成分的白蛋白載體制劑研究具有一定的參考價(jià)值。