TLR4和IL-5在兒童嗜酸性粒細(xì)胞性結(jié)腸炎的表達(dá)及作用機(jī)制研究 ???

謝靜 熊莉婭 耿嵐嵐 楊敏 陳佩瑜 王洪麗 龔四堂

【摘要】目的 檢測Toll樣受體4（TLR4）和IL-5在兒童嗜酸性粒細(xì)胞性結(jié)腸炎（EC）的表達(dá)水平及相關(guān)性，探討TLR4在兒童EC發(fā)病過程中的作用機(jī)制。方法 收集EC患兒的結(jié)腸黏膜標(biāo)本，共28例，同期收集腸黏膜正常對照組25例。分析2組患兒的臨床資料，采用免疫組織化學(xué)法檢測其結(jié)腸黏膜中TLR4、IL-5表達(dá)情況并對結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果 EC組患兒主要表現(xiàn)為血便、腹瀉，大多患兒內(nèi)鏡下見結(jié)腸黏膜充血、水腫、小結(jié)節(jié)增生、糜爛和阿弗它潰瘍，8例患兒內(nèi)鏡下結(jié)腸黏膜正常;黏膜病理提示黏膜下有大量嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，均≥20個/高倍鏡視野。對照組患兒主要表現(xiàn)為腹痛，內(nèi)鏡下示全結(jié)腸黏膜正常，黏膜病理示未見明顯病理改變。與對照組比較，EC組結(jié)腸黏膜TLR4水平降低（Z = -4.448，P < 0.05），結(jié)腸黏膜IL-5表達(dá)水平增高（Z = -7.015，P < 0.05）。TLR4、IL-5表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r = -0.5325，P < 0.05）。結(jié)論 機(jī)體受到過敏原、毒素等刺激時，腸道TLR4不能反應(yīng)性增高可能是EC發(fā)病機(jī)制之一。EC患兒腸組織TLR4表達(dá)明顯下降，而IL-5明顯升高，其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)輔助性T淋巴細(xì)胞（Th）1/Th2平衡，使EC患兒傾向于Th2表型應(yīng)答，釋放大量IL-5細(xì)胞因子，參與EC的發(fā)生。

【關(guān)鍵詞】嗜酸性粒細(xì)胞性結(jié)腸炎; Toll樣受體4; 白介素-5

【Abstract】Objective To measure the expression levels of Toll-like receptor 4 （TLR4） and interleukin 5（IL-5） in the colonic mucosa of children with eosinophilic colitis（EC） and analyze their correlation， aiming to explore the mechanism of TLR4 in the pathogenesis of pediatric EC. Methods The colonic mucosal specimens were collected from 28 children diagnosed with EC and 25 healthy controls. Clinical data of all children were retrospective analyzed. The expression levels of TLR4 and IL-5 in the colonic mucosa were detected by immunohistochemistry and the results were analyzed. Results Clinical manifestations of EC children mainly included bloody stools and diarrhea. Colonic mucosal congestion， edema， small nodular hyperplasia， patchy erosion and Aphtha ulcer were observed under endoscope in most EC children. Normal colonic mucosa was noted under endoscope in 8 EC cases. Mucosal biopsy of all cases in the EC group showed a large quantity of eosinophil infiltration （≥20/HPF）. All cases in the control group had abdominal pain and the whole colon specimens were normal and no significant pathological changes were observed. Compared with the control group， the TLR4 level in the colonic mucosa was significantly down-regulated （Z = -4.448， P < 0.05）， whereas the expression level of IL-5 was significantly up-regulated in the EC group （Z = -7.015， P < 0.05）. The expression level of TLR4 was negatively correlated with that of IL-5 （r = -0.532， P < 0.05）. Conclusions When the body is stimulated by allergens and toxins， etc.， the inability of TLR4 to respond to gastrointestinal tract may be one of the pathogenesis of EC. The expression of TLR4 in the intestinal tissues of EC children is significantly down-regulated， whereas that of IL-5 is remarkably up-regulated， suggesting that the mechanism is probably that by regulating the Th1/Th2 balance， EC children tend to respond to Th2 phenotype， release a large quantity of IL-5 cytokines， and participate in the incidence of EC.

【Key words】Eosinophilic colitis;Toll-like receptor 4;Interleukin 5

嗜酸性胃腸道疾?。‥GID）包括嗜酸性粒細(xì)胞性食管炎、胃腸炎、結(jié)腸炎，是胃腸道組織中嗜酸性粒細(xì)胞（EOS）異常浸潤導(dǎo)致的消化系統(tǒng)疾病，臨床表現(xiàn)多樣化，兒童少見。近年來隨著兒童胃腸鏡的廣泛開展，該病也引起了臨床醫(yī)師關(guān)注。目前EGID發(fā)病機(jī)制尚不明確，研究認(rèn)為EGID是輔助性T淋巴細(xì)胞（Th）2介導(dǎo)的過敏反應(yīng)，Th2的優(yōu)勢應(yīng)答導(dǎo)致IL-5、Eotaxin釋放增多，IL-5是EOS分化和增殖的關(guān)鍵細(xì)胞因子，Eotaxin促進(jìn)成熟EOS向腸道聚集，這可能是EOS異常浸潤和炎癥發(fā)生的基礎(chǔ)[1]。而Toll樣受體4（TLR4）通過樹突細(xì)胞分泌IL-12、Ⅰ型干擾素，使Th0偏向Thl細(xì)胞分化以調(diào)節(jié)Th1/Th2的平衡[2]。因此，本文通過研究嗜酸性粒細(xì)胞性結(jié)腸炎（EC）患兒結(jié)腸黏膜中TLR4和IL-5的表達(dá)，來探討TRL4在EC發(fā)病中的作用機(jī)制。

對象與方法

一、研究對象

收集2011年2月至2013年4月在我院消化科確診為EC的患兒其結(jié)腸黏膜，共28例，診斷標(biāo)準(zhǔn)為Talley標(biāo)準(zhǔn)[3]。包括：①反復(fù)出現(xiàn)的腹痛、腹瀉、嘔吐等消化道癥狀;②病理證實(shí)結(jié)腸黏膜組織檢查有1個或1個以上部位EOS浸潤[≥20個/高倍鏡視野（HPF）];③無其它引起EOS增多的疾病，包括寄生蟲感染、炎癥性腸病、結(jié)締組織病、藥物過敏、高EOS綜合征、變異性哮喘及腫瘤等。同期收集結(jié)腸黏膜正常對照組25例，對照組患兒均按照羅馬Ⅲ診斷標(biāo)準(zhǔn)診斷為功能性腹痛，均經(jīng)過腸鏡檢查，鏡下及活組織病理檢查未見異常[4]。受試者家屬均知情同意，并經(jīng)醫(yī)院學(xué)術(shù)倫理委員會討論通過。

二、研究方法

1. 臨床資料分析

回顧性對所有患兒的臨床資料進(jìn)行分析，包括年齡、性別、臨床表現(xiàn)、實(shí)驗(yàn)室檢查、結(jié)腸鏡及黏膜病理檢查。

2.結(jié)腸黏膜標(biāo)本的收集及處理

行纖維結(jié)腸鏡時用活檢鉗取出患兒結(jié)腸黏膜后迅速固定于10%甲醛溶液中，送我院病理科進(jìn)行常規(guī)石蠟包塊，連續(xù)作厚5 μm的切片3張，60℃烤箱過夜，室溫下保存?zhèn)溆谩?/p>

3.采用免疫組織化學(xué)（組化）法檢測患兒結(jié)腸黏膜中TLR4、IL-5表達(dá)

切片脫蠟至水，檸檬酸抗原修復(fù)，3%過氧化氫去離子水消化，滴加一抗（TLR4、IL-5，Bioworld， USA，工作濃度1∶00），4℃過夜，PBS浸洗后，滴加二抗，DAB顯色，經(jīng)蘇木素復(fù)染，鹽酸酒精溶液分化，封片。用PBS代替一抗作陰性對照。

4.結(jié)果判讀

參照文獻(xiàn)[5]，由2名病理醫(yī)生單獨(dú)判斷免疫組化結(jié)果。顯微鏡下觀察細(xì)胞質(zhì)或細(xì)胞膜呈黃色、棕黃色或棕褐色為陽性。染色強(qiáng)度評分：按細(xì)胞顯示深淺記分，分為4級，0分為無色，1分為淡黃色，2分為棕黃色，3分為棕褐色。陽性細(xì)胞面積評分：按陽性細(xì)胞所占面積分為4級，0分為陰性，1分為陽性細(xì)胞≤1/3，2分為1/3 ～ 2/3，3分為 > 2/3。陽性表達(dá)水平采用染色強(qiáng)度評分×陽性細(xì)胞面積評分的積分表示，積分為0判斷為0分，積分為1 ～ 2判斷為1分，積分為3 ～ 4判斷為2分，積分為6 ～ 9判斷為3分。

三、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0進(jìn)行分析，定性資料用例（%）表示，其中無序分類資料組間比較用Fisher確切概率法，等級資料組間比較用秩和檢驗(yàn)。2個連續(xù)型變量相關(guān)性采用Pearson相關(guān)分析。P < 0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié)果

一、EC組和對照組的臨床表現(xiàn)比較

EC組28例，男20例、女8例，年齡（5.1±2.8）歲，便血14例（50%），主要為黏液血絲便，不同程度的腹痛12例（42.8%），腹瀉8例（28.6%），惡心、嘔吐3例（10.7%），腹脹1例（3.5%），營養(yǎng)不良1例（3.5%）。對照組25例，男18例、女7例，年齡（5.3±2.7）歲，均表現(xiàn)為腹痛，主要為臍周痛或中上腹痛。與對照組相比，EC組患兒便血、腹瀉的比例升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均< 0.05），以腹痛為主要癥狀的EC患者比例較低，差異亦有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P < 0.05），見表1。

二、EC組和對照組實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果比較

EC組EOS增高者5例，4例患兒血紅蛋白降低，8例患兒大便潛血試驗(yàn)陽性，所有患兒大便寄生蟲檢測均陰性，1例患兒血白蛋白降低，7例血清總IgE增高，8例患兒食物過敏原 IgE 檢測陽性，提示主要對牛奶、雞蛋、 大豆、鱈魚、螃蟹過敏。對照組血常規(guī)、糞便常規(guī)、總IgE、食物過敏原IgE、肝腎功能均正常。與對照組相比，EC患兒血清總IgE增高、食物過敏源IgE檢測陽性、大便潛血試驗(yàn)陽性比例均較高（P < 0.05），見表2。

三、EC組和對照組內(nèi)鏡和病理檢查結(jié)果比較

對照組25例患兒內(nèi)鏡下示全結(jié)腸黏膜光滑，黏膜下血管紋理清晰，未見糜爛、潰瘍及腫物等病變。黏膜病理示未見明顯病理改變，見圖1A。EC組患兒20例結(jié)腸黏膜充血、水腫，血管網(wǎng)紋理模糊，其中7例可見散在小結(jié)節(jié)樣增生;4例結(jié)腸黏膜有散在點(diǎn)片狀的糜爛和阿弗它樣潰瘍;3例可見散在小濾泡（見圖1B、C）。8例患兒結(jié)腸黏膜正常。EC組病理活檢提示黏膜下有大量EOS浸潤，均 ≥20個/HPF，見圖2。

四、EC組和對照組TLR4水平比較

在EC組和對照組中，TLR4在結(jié)腸上皮細(xì)胞中均有表達(dá)，陽性胞膜呈黃色、棕黃色或棕褐色，見圖3。與對照組相比，EC組結(jié)腸黏膜TLR4水平降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z = -4.448，P < 0.05），見表3。

五、EC組和對照組IL-5水平比較

在EC組中，IL-5在結(jié)腸上皮細(xì)胞中均有表達(dá)，陽性胞膜呈黃色、棕黃色或棕褐色，而對照組呈陰性表達(dá)，見圖4。與對照組相比，EC組結(jié)腸黏膜IL-5表達(dá)水平明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z = -7.015，P < 0.05），見表4。

六、結(jié)腸黏膜TLR4、IL-5表達(dá)的相關(guān)性

所有患兒實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示TLR4、IL-5表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)（r = -0.532，P < 0.05）。

討論

EGID是一種少見的可影響胃腸道從食道到直腸的任何節(jié)段或節(jié)段組合，從而產(chǎn)生各種臨床表現(xiàn)的慢性炎癥性腸病，最初由Kaijser于1937年描述，其特征是富含EOS的炎癥，沒有其它已知EOS增多的原因（即寄生蟲、感染、藥物反應(yīng)或惡性腫瘤）。EC是一種罕見的原發(fā)性EGID，美國最近對一個基于人口的數(shù)據(jù)庫進(jìn)行了調(diào)查，其中包括超過3500萬兒童和成人，報告的EC總體患病率為每10萬名受試者中有2.1人，每10萬名成人患病率為2.3，兒童每10萬人中有1.6人[6]。國內(nèi)報道 EC 患兒發(fā)病率明顯高于國外，本組資料中我們共收集到 EC 確診患兒 28 例，年齡1 ～ 12 歲，男女比例約1.8∶1。

雖然在過去的10年中報道的EC病例有所增加，但其病因、發(fā)生機(jī)制尚不清楚，臨床可因病變累及的部位、病理、范圍和程度而有所差異，主要表現(xiàn)為腹痛、惡心、嘔吐、腹瀉、體質(zhì)量減輕、胃腸道出血、腸道吸收不良或腹水[7]。本組資料中患兒的臨床癥狀主要為便血、腹瀉，大多數(shù)患兒內(nèi)鏡檢查可見結(jié)腸黏膜充血、水腫、血管紋理欠清晰、小結(jié)節(jié)樣增生，嚴(yán)重者可見點(diǎn)片狀的糜爛、阿弗它樣潰瘍。有8例患兒內(nèi)鏡下結(jié)腸黏膜正常。有研究表明，臨床癥狀和實(shí)驗(yàn)室檢查結(jié)果通常是非特異性的，可能伴有也可能不伴有外周血嗜酸性粒細(xì)胞增多癥[8]。診斷需要根據(jù)胃腸道癥狀，通過活組織檢查證實(shí)腸道EOS增多，并排除其他已知的組織EOS增多的原因。本組資料顯示僅有18%的患者外周血EOS增高，推測可能是本組患兒大部分曾服用抗過敏藥物的原因，并且外周血EOS的數(shù)量會隨病情變化而出現(xiàn)波動，因此僅憑此項(xiàng)結(jié)果正常排除EC是不可靠的，提示外周EOS對確診EC不是關(guān)鍵，而內(nèi)鏡下腸道組織活檢證實(shí)EOS浸潤> 20個/HPF是診斷EC的關(guān)鍵[9]。

EC的病因及發(fā)病機(jī)制尚不清楚，可能為環(huán)境、基因和免疫系統(tǒng)相互作用的結(jié)果，也可能與食物過敏，感染或炎癥性腸病共存，大量研究報道該病與過敏因素有關(guān)[10]。而在本組中 8例患兒食物變應(yīng)原IgE檢查陽性，這提示過敏因素可能在發(fā)病機(jī)制中有一定的作用。通過動物實(shí)驗(yàn)及臨床研究發(fā)現(xiàn)，過敏原或毒素等外源性或內(nèi)源性抗原刺激EC患者產(chǎn)生特異性免疫球蛋白，激活T淋巴細(xì)胞，導(dǎo)致Th1/Th2 平衡失調(diào)，Th2 細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-5 是重要的炎癥介質(zhì)，Th2 細(xì)胞的優(yōu)勢應(yīng)答導(dǎo)致IL-5、Eotaxin 等炎癥因子產(chǎn)生是消化道 EOS 異常浸潤和炎癥發(fā)生的基礎(chǔ)[2，8]。目前大多研究發(fā)現(xiàn) IL-5 在EC的發(fā)病機(jī)制中起到非常關(guān)鍵的作用，它促進(jìn)EOS產(chǎn)生、分化、活化及生存，并增強(qiáng)對趨化因子（如Eotaxin）的反應(yīng)性，向消化道轉(zhuǎn)移。Prussin研究發(fā)現(xiàn) IL-5+Th2 免疫反應(yīng)與EGID發(fā)生相關(guān)，而Kinoshita等[11]研究中發(fā)現(xiàn)嗜酸性食管炎及胃腸炎患兒的細(xì)胞因子 IL-5 同樣升高。

IL-5是Th2衍生的一類細(xì)胞因子，是EOS活化的關(guān)鍵介質(zhì)，也是EOS擴(kuò)增及其從骨髓中釋放所必需的[12]。當(dāng)激活時，胃腸組織浸潤的EOS可釋放嗜酸顆粒中的細(xì)胞毒性蛋白（包括EOS陽離子蛋白、EOS過氧化物酶、EOS來源的神經(jīng)毒素和主要基質(zhì)蛋白） ，還可合成血小板活化因子、白三烯C4等血管活性物質(zhì)，進(jìn)而造成器官損傷或功能障礙和更多EOS聚集，從而形成惡性循環(huán)。Straumann等（2001年）在特發(fā)性嗜酸性粒細(xì)胞性食管炎（EE）患者食管上皮活檢標(biāo)本中觀察到IL-5和TNF-α的表達(dá)增加，因此認(rèn)為特發(fā)性EE發(fā)病機(jī)制與Th2型過敏性炎癥反應(yīng)有關(guān)。本研究顯示EC組結(jié)腸上皮組織IL-5呈陽性表達(dá)，而對照組結(jié)腸組織IL-5呈陰性，可能與上述發(fā)病機(jī)制有關(guān)。

T淋巴細(xì)胞在免疫系統(tǒng)中占有重要地位，實(shí)驗(yàn)表明，炎癥性腸病患者中其腸道病變組織可見局部CD4+ T細(xì)胞浸潤并且功能異常[13]。CD4+ T細(xì)胞根據(jù)細(xì)胞因子的分泌分為Th1和Th2細(xì)胞.在正常情況下，體內(nèi)的Th1和Th2處于動態(tài)平衡狀態(tài)并相互調(diào)節(jié)，從而維持體內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定性。如果Th1和Th2失去平衡，則在組織和器官中發(fā)生炎癥并引起疾病。Camoglio等（1998年）在潰瘍性結(jié)腸（UC）小鼠模型中發(fā)現(xiàn)CD4+ T細(xì)胞產(chǎn)生大量IL-4和IL-5，單個IFN-γ正?；驕p少，說明UC的發(fā)生和發(fā)展與Th1/Th2的失衡強(qiáng)烈相關(guān)。TLR4是固有免疫系統(tǒng)識別病原微生物的主要受體，可以識別入侵病原體的不同分子模式，是連接天然免疫和獲得性免疫的橋梁，在人體的免疫系統(tǒng)中起著重要的作用。同時它也在Th1/Th2的平衡中起著關(guān)鍵作用。近期研究發(fā)現(xiàn) TLR4 的激活參與了某些過敏性炎癥疾病的發(fā)病過程。Eisenbarth等（2002年）在用卵清蛋白建立的哮喘小鼠模型研究中發(fā)現(xiàn)，小鼠吸入低濃度脂多糖（LPS）TLR4的激動劑的卵清蛋白，支氣管組織中 TLR4 低表達(dá)，從而產(chǎn)生抗原特異性 Th2 免疫應(yīng)答而發(fā)生哮喘癥狀，而吸入較高濃度 LPS的卵清蛋白則誘導(dǎo)Th1免疫保護(hù)應(yīng)答未出現(xiàn)哮喘癥狀。因此，TLR4介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在探索哮喘等Th2免疫應(yīng)答為主的過敏性疾病免疫防治機(jī)制中具有重要的研究價值。目前國內(nèi)外對TLR4與EC發(fā)病的關(guān)系的研究尚未見報道，因此本研究從TLR4與Th2免疫應(yīng)答關(guān)系探討EC可能的發(fā)病機(jī)制。

本文探討了EC患兒腸上皮細(xì)胞TLR4的表達(dá)情況。免疫組化結(jié)果顯示，在EC組和對照組中，TLR4在結(jié)腸上皮細(xì)胞中均有表達(dá)，但與對照組相比，EC組結(jié)腸黏膜TLR4水平降低。本文也探討了TLR4、IL-5相關(guān)性，結(jié)果顯示它們呈負(fù)相關(guān)，即EC組患兒結(jié)腸組織中TLR4低水平表達(dá)，而IL-5呈高水平表達(dá)。對照組患兒結(jié)腸組織中TLR4高水平表達(dá)，而IL-5呈低水平表達(dá)。因此我們推測EC患兒腸組織TLR4表達(dá)明顯下降，可能一定程度上使IFN-γ等Th1細(xì)胞因子的產(chǎn)生減少，通過調(diào)節(jié)導(dǎo)致Th1/Th2 平衡失調(diào)，從而傾向于Th2表型應(yīng)答，釋放大量IL-5細(xì)胞因子，參與EC的發(fā)生，該假設(shè)在我們前期構(gòu)建的輪狀病毒腸炎乳鼠動物模型中得到驗(yàn)證[14]。

綜上所述，我們推測機(jī)體受到過敏原、毒素等刺激時，腸道上皮細(xì)胞的TLR4不能反應(yīng)性增高或表達(dá)被抑制，從而導(dǎo)致產(chǎn)生抗原特異性Th2免疫應(yīng)答可能是EC發(fā)病機(jī)制之一，這也為EC的預(yù)防及治療提供新的思路。

參 考 文 獻(xiàn)

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（收稿日期：2019-11-18）

（本文編輯：楊江瑜）