扶正解毒化瘀顆粒對(duì)克雷伯桿菌肺炎所致多器官功能損傷小鼠心肌組織細(xì)胞因子及病理的影響研究*

李 猛, 王志梅, 徐紅日, 王成祥, 馬戰(zhàn)平

1. 陜西省中醫(yī)醫(yī)院(西安 710000)，2. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)(咸陽 712000)，3. 北京中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院(北京 100029)

主題詞 肺炎/中醫(yī)藥療法 肺炎克雷伯菌 @扶正解毒化瘀顆粒 動(dòng)物實(shí)驗(yàn) 小鼠

肺炎克雷伯桿菌肺炎(Klebsiellar pneumonia,KP)是臨床常見的感染性疾病，老年人及免疫功能低下者容易罹患，是誘發(fā)全身炎癥反應(yīng)綜合征(Systemic inflammatory response syndrome, SIRS)、造成多器官損傷或多器官功能障礙綜合征(Multiple organ dysfunction syndrome, MODS)的重要原因[1]，心肌損傷和功能不全是其病理改變的關(guān)鍵因素。機(jī)體感染后，釋放大量細(xì)胞因子，激活各種炎癥細(xì)胞，多種炎癥介質(zhì)失控性釋放，并呈“級(jí)聯(lián)放大”，誘導(dǎo)過度炎癥反應(yīng)，引起心肌細(xì)胞凋亡、抑制心肌收縮功能，導(dǎo)致心肌損害[2]。中醫(yī)藥在保護(hù)心肌功能、提高心肌細(xì)胞氧含量、增加組織血供、改善微循環(huán)等方面作用明顯[3]。扶正解毒化瘀顆粒具有清熱解毒、活血化瘀、益氣養(yǎng)陰的功效，用于治療老年肺炎療效顯著[4-5]。現(xiàn)以克雷伯桿菌肺炎所致多器官功能損傷模型小鼠為研究對(duì)象，通過觀察不同感染時(shí)相心肌組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ、IL-10的表達(dá)水平及心肌組織病理學(xué)的變化，揭示扶正解毒化瘀顆粒對(duì)克雷伯桿菌肺炎所致多器官功能損傷小鼠心肌組織的保護(hù)機(jī)制，為進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料與方法

1 動(dòng) 物 SPF級(jí)KM雄性小鼠128只，鼠齡4周，體重(20±5)g，由河南省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供(合格證號(hào)XK20110013)。標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，自由飲水。

2 藥 品 肺炎克雷伯桿菌由中國(guó)生物制品檢驗(yàn)鑒定所提供(菌株號(hào):K46114)，使用前用無菌生理鹽水稀釋至1.0×103CFU/ml。鹽酸左氧氟沙星膠囊由揚(yáng)子江藥業(yè)集團(tuán)有限公司提供(國(guó)藥準(zhǔn)字H19990051)，用純水配制成終濃度為4 mg/ml的溶液；扶正解毒化瘀顆粒由瓜蔞、敗醬草、薏苡仁各30 g，黃芩、連翹、漏蘆、赤芍各15 g，西洋參6 g組成，藥物由河南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室提供，采用免煎顆粒劑，用純水配制成終濃度為1.84 g/ml的溶液。

3 主要試劑與儀器 腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)-α(批號(hào)：EK0527)、白介素(Interleukin，IL)-1β(批號(hào)：EK0394)、IL-6(批號(hào)：EK0411)、IL-10(批號(hào)：EK0417)、干擾素(Interferon，IFN)-γ(批號(hào)：EK0375)、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測(cè)試劑盒由武漢云克隆科技股份有限公司提供。蘇木素-伊紅(Htoxylin eosin，HE)染色試劑盒(批號(hào)：G1120)由北京索萊寶科技有限公司提供。

TP1020全自動(dòng)組織脫水機(jī)、EG1150石蠟包埋機(jī)、RM2145型自動(dòng)切片機(jī)(Leica，德國(guó))；OLYMPUS-DP70型顯微鏡及顯微照相系統(tǒng)(奧林巴斯，日本)；Image-Pro Plus6.0專業(yè)圖像采集及分析系統(tǒng)(Media Cybernetics，美國(guó))；UV-260自動(dòng)分光光度計(jì)(島津，日本)。

4 方 法

4.1 分組與造模：128只小鼠稱重，隨機(jī)分為對(duì)照組、模型組、西藥組、中藥組，每組32只。參照文獻(xiàn)提供的造模方法[6-7]，用10%水合氯醛(0.1 ml/10g)腹腔麻醉小鼠，套管針經(jīng)喉部行氣管插管，注入提前備好的菌液0.1 ml(103CFU/ml)。對(duì)照組同法注入等量的無菌生理鹽水。動(dòng)物模型成功標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)進(jìn)行判斷[8]，本實(shí)驗(yàn)通過觀察小鼠一般情況、理化指標(biāo)以及病理變化，證實(shí)造模成功(另文發(fā)表)。

4.2 給藥：于造模前3天對(duì)中藥組、西藥組小鼠進(jìn)行藥物干預(yù)，按體重?fù)Q算成小鼠每日用藥劑量[0.01 ml/(g·d)]，中藥組、西藥組分別灌服中藥溶液、西藥溶液，對(duì)照組、模型組灌服生理鹽水，1次/d。

4.3 取材與指標(biāo)檢測(cè)：每組分別于造模后第1、3、5、7天各取8只小鼠，小鼠處死后，開腹、開胸取出心臟；縱切心臟組織，一部分組織用4%多聚甲醛固定液固定，待做HE染色；另一部分組織按1∶10加入生理鹽水后充分勻漿，分離上清液，放入-80 ℃冰箱中保存待測(cè)TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ、IL-10水平；操作嚴(yán)格按照產(chǎn)品說明書進(jìn)行。

檢測(cè)：采用ELISA法，檢測(cè)小鼠心肌組織TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ、IL-10水平(單位：pg/ml)；取固定好的心肌組織，用4%多聚甲醛固定液固定，經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋，切成4 μm厚的切片，常規(guī)HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察各臟器組織病理學(xué)改變。

5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 所有數(shù)據(jù)用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理，以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組間比較用單因素方差分析，組間兩兩比較用LSD檢驗(yàn)。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 四組心肌組織TNF-α比較 見表1。與對(duì)照組比較，模型組小鼠在感染后第1、3天，心肌組織TNF-α的含量顯著增高(P<0.05)；與模型組比較，中藥組小鼠在感染后第1天，心肌組織TNF-α的含量顯著降低(P<0.05)；與西藥組相比，中藥組小鼠在不同感染時(shí)相，心肌組織TNF-α的含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表1 不同感染時(shí)相小鼠心肌組織TNF-α的表達(dá)(pg/ml)

注:與對(duì)照組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2 四組心肌組織IL-1β比較 見表2。與對(duì)照組比較，模型組小鼠在感染后第1天，心肌組織IL-1β的含量顯著增高(P<0.05)；與西藥組相比，中藥組小鼠在不同感染時(shí)相，心肌組織IL-1β的含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表2 不同感染時(shí)相小鼠心肌組織IL-1β的表達(dá)(pg/ml)

注:與對(duì)照組比較，*P<0.05

3 四組心肌組織IL-6比較 見表3。與對(duì)照組比較，模型組小鼠在感染后第1天，心肌組織IL-6的含量顯著增高(P<0.01)；與模型組比較，中藥組小鼠在感染后第1天，心肌組織IL-6的含量顯著降低(P<0.05)；與西藥組相比，中藥組小鼠在不同感染時(shí)相，心肌組織IL-6的含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表3 不同感染時(shí)相小鼠心肌組織IL-6的表達(dá)(pg/ml)

注:與對(duì)照組比較，?P<0.01；與模型組比較，#P<0.05

4 四組心肌組織IFN-γ比較 見表4。與對(duì)照組比較，模型組小鼠在感染后第1、3天，心肌組織IFN-γ的含量顯著增高(P<0.05)；與西藥組相比，中藥組小鼠在不同感染時(shí)相，心肌組織IFN-γ的含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表4 不同感染時(shí)相小鼠心肌組織IFN-γ的表達(dá)(pg/ml)

注:與對(duì)照組比較，*P<0.05

5 四組心肌組織IL-10比較 見表5。與對(duì)照組比較，模型組小鼠在感染后第1、3天，心肌組織IL-10的含量顯著增高(P<0.05)，中藥組、西藥組小鼠在感染后第1、3、5、7天，心肌組織IL-10的含量顯著增高(P<0.05或P<0.01)；與模型組比較，中藥組小鼠在感染后第1天，心肌組織IL-10的含量顯著升高(P<0.05)；與西藥組相比，中藥組小鼠在不同感染時(shí)相，心肌組織IL-10的含量無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)。

表5 不同感染時(shí)相小鼠心肌組織IL-10的表達(dá)(pg/ml)

注:與對(duì)照組比較，*P<0.05，△P<0.01；與模型組比較，#P<0.05

6 四組小鼠心肌組織病理改變 造模后第1天，對(duì)照組小鼠心肌組織大致正常(見圖1A)；模型組小鼠心肌纖維斷裂、排列紊亂，間質(zhì)纖維組織增生，小血管周圍可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(見圖1B)；西藥組小鼠心肌組織病理情況較模型組有所減輕(見圖1C)，與中藥組差別不大；中藥組小鼠部分心肌纖維斷裂、排列紊亂，毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，小血管周圍可見中等量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(見圖1D)。

造模后第3天，對(duì)照組小鼠心肌組織大致正常(見圖2A)；模型組小鼠部分心肌纖維斷裂、排列紊亂，可見間質(zhì)纖維組織增生，小血管周圍可見中等量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(見圖2B)；西藥組、中藥組小鼠少部分心肌纖維斷裂、排列紊亂，可見毛細(xì)血管擴(kuò)張充血，小血管周圍可見少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，但較模型組有所減輕(見圖2C、圖2D)。

造模后第5天，對(duì)照組小鼠心肌組織大致正常(見圖3A)；模型組小鼠少部分心肌纖維斷裂、排列紊亂，小血管周圍可見少量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)(見圖3B)；西藥組、中藥組小鼠心肌組織病理情況較模型組有所減輕(見圖3C、圖3D)。

造模后第7天，對(duì)照組小鼠心肌組織大致正常(見圖4A)；模型組、西藥組、中藥組小鼠心肌組織病變情況基本恢復(fù)正常(見圖4B、圖4C、圖4D)。

討 論

老年人細(xì)菌性肺炎過程中，內(nèi)毒素誘發(fā)的炎性細(xì)胞因子對(duì)組織細(xì)胞的損害遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過內(nèi)毒素本身對(duì)機(jī)體的直接影響，因其誘發(fā)的細(xì)胞因子可引發(fā)一系列“瀑布樣級(jí)聯(lián)效應(yīng)”，從而造成多器官損傷，導(dǎo)致多器官功能障礙綜合征(MODS)的發(fā)生。在MODS所表現(xiàn)的病理過程與中醫(yī)熱邪、毒邪郁閉和損傷臟腑等病理改變極其類似[9]。葉天士所論述的“溫邪上受，首先犯肺，逆?zhèn)餍陌币步沂玖诉@一傳變過程[10]。心臟作為MODS常累及的靶器官，在MODS患者常常出現(xiàn)不同程度的心功能障礙或心力衰竭,而心功能障礙又是MODS病情加重及死亡的危險(xiǎn)因素[11]，細(xì)菌毒素激活的失控的介質(zhì)網(wǎng)絡(luò),最后可導(dǎo)致心功能衰竭和死亡。

在MODS發(fā)生過程中，細(xì)胞因子被認(rèn)為是罪魁禍?zhǔn)?，促?抗炎細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡起了關(guān)鍵作用。MODS的始動(dòng)因素類似中醫(yī)學(xué)的“毒邪”，“熱毒熾盛”是邪正交爭(zhēng)而引起的主要病機(jī)變化[12]，反映了“炎性因子異常增高、免疫反應(yīng)激烈”的病理過程。TNF-α是炎癥因子瀑布效應(yīng)的關(guān)鍵因子，可直接損傷冠狀動(dòng)脈血管，使心肌細(xì)胞供血減少，并通過誘發(fā)IL-1β、IL-6等炎癥因子的表達(dá)，損傷血管內(nèi)皮細(xì)胞，使血管壁通透性增加，損傷心肌細(xì)胞[13-15]。研究發(fā)現(xiàn)心衰患者TNF-α、IL-6、IL-1均高于正常人，且與心功能級(jí)數(shù)成正相關(guān)，與射血分?jǐn)?shù)成負(fù)相關(guān)[16]。IFN-γ過量產(chǎn)生可激活單核-巨噬細(xì)胞，促進(jìn)炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，加重炎癥反應(yīng)[17]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：模型組小鼠在感染后第1、3天，心肌組織TNF-α、IFN-γ、IL-10的含量顯著增高，IL-1β、IL-6的含量在感染后第1天顯著增高，提示機(jī)體感染后，釋放大量炎癥介質(zhì)和細(xì)胞因子，引起炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，形成SIRS，最終導(dǎo)致MODS，為了拮抗炎癥介質(zhì)，抑制過度炎癥反應(yīng)，自身免疫發(fā)揮調(diào)節(jié)作用，促炎因子隨之大量產(chǎn)生。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與模型組比較，中藥組小鼠在感染后第1天心肌組織中TNF-α、IL-6的含量顯著降低，提示扶正解毒化瘀顆粒可能通過降低促炎細(xì)胞因子表達(dá)減輕炎癥反應(yīng)，從而發(fā)揮心臟保護(hù)作用?，F(xiàn)代藥理作用研究表明，黃芩苷可降低肺炎衣原體刺激細(xì)胞產(chǎn)生的IL-8，在降低TNF-α、IL-6方面效果也很顯著[18-19]；黃芩提取物可干預(yù)CVB3m的復(fù)制, 對(duì)心肌具有一定的保護(hù)作用[20]。連翹煎煮液能夠降低大腸桿菌感染模型小鼠血清中IFN-γ、IL-4 水平，對(duì)感染模型小鼠起到保護(hù)作用[21]。敗醬草能明顯抑制脂多糖刺激枯否氏細(xì)胞分泌粒細(xì)胞一巨噬細(xì)胞集落刺激因子，減輕炎癥反應(yīng)[22]。薏苡仁酯可有效抑制促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β的產(chǎn)生，增加抗炎細(xì)胞因子IL-10產(chǎn)生,抑制內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)[23]。瓜蔞提取液具有一定的抗氧化、抗心肌缺血再灌注損傷等作用[24]。

IL-10具有拮抗促炎介質(zhì)和調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能的生物學(xué)特性，可減輕中性粒細(xì)胞介導(dǎo)的炎性浸潤(rùn)，減輕心肌損傷，發(fā)揮心肌保護(hù)作用；可通過抑制促炎細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β等的過度表達(dá)，在缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要的保護(hù)作用[25-26]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與模型組比較，中藥組小鼠在感染后第1天心肌組織中IL-10的含量顯著增高，提示扶正解毒化瘀顆?？赡芡ㄟ^提高IL-10等抗炎細(xì)胞因子表達(dá)降低機(jī)體炎癥反應(yīng)，減輕組織損傷。心肌組織病理結(jié)果顯示，中藥組小鼠心肌組織病理損傷程度較模型組減輕，提示扶正解毒化瘀顆粒對(duì)MODS小鼠心肌組織也具有一定保護(hù)作用?，F(xiàn)代藥理作用研究表明，連翹水煎液能夠提高大腸桿菌感染模型小鼠血清IL-10表達(dá)和IFN-γ/IL-4比值，提高小鼠的免疫調(diào)節(jié)功能[21]。漏蘆提取物能夠維持心肌細(xì)胞脂膜穩(wěn)定性、維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)與功能，對(duì)心肌細(xì)胞具有保護(hù)作用[27]。薏苡仁水提液能夠增強(qiáng)免疫抑制小鼠體液免疫、細(xì)胞免疫和非特異免疫功能[28]。瓜蔞皮、赤芍總苷能促進(jìn)小鼠免疫功能，調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)的失衡[29-30]。西洋參莖葉總皂苷可活化巨噬細(xì)胞，增強(qiáng)其吞噬能力，并產(chǎn)生生物活性物質(zhì)從而增強(qiáng)機(jī)體的免疫功能[31],并可通過抑制活性氧的增加及減少炎癥反應(yīng)的發(fā)生，有效的減弱心肌缺血再灌注引起的損傷[32]。另外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與西藥組比較，中藥組小鼠在不同感染時(shí)相心肌組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ、IL-10水平無顯著差異，但TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ整體水平低于西藥組、IL-10水平高于西藥組，且中藥組心肌組織病理損傷程度稍輕于西藥組，提示中藥組在降低促炎細(xì)胞因子水平、提高抗炎細(xì)胞因子、保護(hù)心肌組織等方面作用與西藥組無明顯差異。

MODS的中醫(yī)藥治療主要采取清熱解毒、活血化瘀、通腑瀉下、扶正固本等治法[33]。臨床和實(shí)驗(yàn)研究均發(fā)現(xiàn)清熱解毒類、活血化瘀類及多數(shù)補(bǔ)益類中藥及其提取成分具有免疫增強(qiáng)或免疫調(diào)節(jié)作用，對(duì)細(xì)胞因子可產(chǎn)生不同的影響[34]。本實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)扶正解毒化瘀顆粒對(duì)于“炎性因子異常增高、免疫反應(yīng)激烈”的干預(yù)作用，與國(guó)內(nèi)其他學(xué)者研究結(jié)果類似，如李建生等[35]報(bào)道中藥復(fù)方毒素清可通過阻抑心肌組織TNF-α、IL-1、巨噬細(xì)胞炎癥蛋白-2(MIP-2)蛋白表達(dá)、MIP-2 mRNA表達(dá)，對(duì)老年肺炎心肌損傷起到保護(hù)作用。

綜上所述，扶正解毒化瘀顆粒緊扣“熱毒熾盛”的病機(jī)，早用“清熱解毒”阻斷熱毒閉肺、逆?zhèn)餍陌募膊∵M(jìn)展過程，選用黃芩為君藥，以清上、中、下三焦之熱,尤長(zhǎng)于清肺熱；臣藥連翹、漏蘆清熱解毒、散結(jié)排膿，與君藥配合以達(dá)清熱解毒排膿的作用；敗醬草和薏苡仁常作對(duì)藥使用，以上清肺熱、下清大腸，熱邪得解；瓜蔞清熱化痰兼滑腸，使邪熱有去路，以解邪熱之毒；佐以赤芍涼血散瘀，所謂瘀消血行則熱散，與黃芩、連翹配合增強(qiáng)清熱涼血、活血消癰作用；西洋參益氣養(yǎng)陰，以達(dá)扶正祛邪之效。扶正解毒化瘀顆粒能夠抑制克雷伯桿菌肺炎所致多器官功能損傷小鼠心肌組織中TNF-α、IL-1β、IL-6、IFN-γ等促炎細(xì)胞因子的過度表達(dá)，同時(shí)能提高抗炎細(xì)胞因子IL-10的表達(dá)水平，以減輕由“促炎-抗炎細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)失衡”所導(dǎo)致的心臟局部炎癥反應(yīng)，減輕心肌組織的損傷程度，從而對(duì)心肌組織起到一定的保護(hù)作用。這對(duì)進(jìn)一步闡明扶正解毒化瘀顆粒干預(yù)MODS的作用機(jī)制具有一定的意義。