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    熒光原位雜交技術(shù)在產(chǎn)前診斷染色體嵌合體中的應(yīng)用價(jià)值

    2020-03-25 05:31:40李顯箏許玲胡晶晶黎鳳珍蔡嬋慧
    關(guān)鍵詞:嵌合體核型羊水

    李顯箏,許玲,胡晶晶,黎鳳珍,蔡嬋慧

    染色體G顯帶核型分析技術(shù)是目前檢測(cè)染色體異常的常規(guī)手段。在臨床工作中,染色體的嵌合現(xiàn)象時(shí)有發(fā)生,染色體嵌合體中異常核型所占比例不同,對(duì)于胎兒的預(yù)后影響也不同,從而增加了產(chǎn)前診斷遺傳咨詢的難度。常規(guī)G顯帶技術(shù)細(xì)胞經(jīng)體外培養(yǎng)后會(huì)改變異常嵌合體的嵌合比例,不能真實(shí)反映胎兒的核型情況。通過(guò)染色體微陣列比較基因組雜交檢測(cè)(chromosomal microarray analaysis,CMA)和熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization,F(xiàn)ISH)能檢測(cè)間期未經(jīng)培養(yǎng)細(xì)胞的嵌合狀態(tài),從而減少細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程對(duì)嵌合比例的影響,同時(shí)也能減少細(xì)胞周期對(duì)產(chǎn)前診斷的限制[1]。本文對(duì)染色體核型結(jié)果提示可能存在染色體嵌合現(xiàn)象的病例進(jìn)一步用CMA和FISH技術(shù)分析確定其異常核型及嵌合比例。

    1 對(duì)象與方法

    1.1 對(duì)象 廣東省婦幼保健院(我院)2016年1月—2018年12月因各種產(chǎn)前診斷指征就診的妊娠孕婦,22例行絨毛/羊水細(xì)胞體外培養(yǎng)染色體核型G顯帶分析,發(fā)現(xiàn)可能存在染色體嵌合現(xiàn)象,并進(jìn)一步行CMA和FISH檢測(cè)。

    1.2 方法

    1.2.1 染色體核型分析按我實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)程進(jìn)行,常規(guī)核型計(jì)數(shù)分析,若出現(xiàn)嵌合現(xiàn)象時(shí)加大計(jì)數(shù)量并對(duì)備份培養(yǎng)瓶中的細(xì)胞進(jìn)行傳代、收獲和制片,加數(shù)盡量多的核型進(jìn)行分析。

    1.2.2 CMA我實(shí)驗(yàn)室使用安捷倫(Agilent)公司(美國(guó))生產(chǎn)的8×60 K芯片進(jìn)行全基因組拷貝數(shù)檢測(cè)。以正常男性DNA作為對(duì)照標(biāo)準(zhǔn),利用ChAS軟件進(jìn)行分析。

    1.2.3 FISH按我實(shí)驗(yàn)室操作規(guī)程進(jìn)行,熒光顯微鏡下閱片分析計(jì)數(shù)。探針?lè)秩M:第一組探針:CEP18(天藍(lán)色)探針定位于D18Z1(18p11.1-q11.1),CEPX(綠色)探針定位于DXZ1(Xp11.1-q11.1),CEPY(紅色)探針定位于DYZ3(Yp11.1-q11.1);第二組探針:LSI13(紅色)探針定位于RB1基因(13q14),LSI21(綠色)探針定位于D21S259,D21S341,D21S342(21q22.13-q22.2);第三組探針:CEP16(紅色)探針定位于D16Z3(16q11.2),CEP20(綠色)定位于D20Z1(20p11.1-q11.1)。

    1.2.4 羊水染色體嵌合評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)當(dāng)2個(gè)或2個(gè)以上的培養(yǎng)物中都至少發(fā)現(xiàn)一個(gè)或一個(gè)以上的異常細(xì)胞克隆,且異常細(xì)胞核型相同,判定為“真嵌合體”。若是以下三種情形之一,為“假嵌合體”:①在2個(gè)或2個(gè)以上培養(yǎng)物中只查到單個(gè)異常細(xì)胞或細(xì)胞克?。虎?個(gè)或2個(gè)以上的異常細(xì)胞克隆都是在同一個(gè)培養(yǎng)物中發(fā)現(xiàn)的;③2個(gè)或2個(gè)以上培養(yǎng)物中都發(fā)現(xiàn)異常細(xì)胞,但異常細(xì)胞的核型異常類型不同。

    2 結(jié)果

    2.1 FISH技術(shù)在染色體數(shù)目異常嵌合體中的應(yīng)用 本研究核型結(jié)果共發(fā)現(xiàn)22例染色體嵌合體,其中性染色體數(shù)目異常嵌合13例(59%),常染色體三體嵌合6例(27%)。性染色體數(shù)目異常嵌合病例中,僅有3例CMA結(jié)果同時(shí)提示性染色體嵌合體的存在,其余均未檢測(cè)到性染色基因拷貝數(shù)變化,其中#6病例核型結(jié)果mos 45,X[84]/46,XY[16],異常核型45,X比例84%,CMA結(jié)果仍提示正常,F(xiàn)ISH結(jié)果提示存在XYY/X/XY(43/21/36)三種情況;#1、#2病例涉及多倍體嵌合體,F(xiàn)ISH及CMA結(jié)果均為正常,提示為假性嵌合體,不具臨床意義;其余CMA未檢測(cè)到基因拷貝數(shù)變化的病例,雖然FISH復(fù)查提示仍為嵌合體,但嵌合比例均在10%左右,屬低比例嵌合體,而低比例嵌合對(duì)胎兒預(yù)后表型影響較小,患者綜合考慮選擇繼續(xù)妊娠。常染色體三體嵌合病例中,共涉及13、16、18、20、21號(hào)染色體的嵌合。#14病例核型結(jié)果提示多了一條未知來(lái)源的標(biāo)記染色體即mar染色體,經(jīng)CMA和FISH檢測(cè)提示mar染色體來(lái)源于18號(hào)染色體短臂,且嵌合比例約為20%左右;#15、#16、#17、#18病例的核型結(jié)果均提示為低比例常染色體三體嵌合(嵌合比例6%、6%、4%、5%),CMA結(jié)果提示嵌合比例分別為10%、30%、34%、正常,未經(jīng)培養(yǎng)羊水細(xì)胞FISH檢測(cè)提示三體嵌合比例分別為11%、25%、38%、10%,均選擇終止妊娠;#19病例核型結(jié)果為20號(hào)三體嵌合(34%),但CMA結(jié)果提示正常,F(xiàn)ISH檢測(cè)提示仍為低比例嵌合(3%),病人自愿繼續(xù)妊娠。見表1。

    2.2 FISH技術(shù)在性染色體結(jié)構(gòu)異常嵌合體中的應(yīng)用 本研究共發(fā)現(xiàn)3例特殊性染色體結(jié)構(gòu)異常嵌合病例,涉及X雙著絲粒染色體1例,Y雙著絲粒染色體2例。以#22病例為例,該病人CMA結(jié)果提示檢測(cè)出致病性CNV:①胎兒在Yp11.31q11.222位置發(fā)生嵌合重復(fù)(嵌合比例約50%~60%),片段大小約18.0 Mb;②Yq11.222q11.23位置發(fā)生缺失,片段大小約7.8 Mb。

    經(jīng)FISH檢測(cè)羊水中期細(xì)胞分裂相CEP18/X/Y著絲粒區(qū)域探針,共發(fā)現(xiàn)四種類型結(jié)果:(DXZ1×1,DYZ3×0,D18Z1×2)[36];(DXZ1×1,DYZ3×4,D18Z1×2)[16];(DXZ1×1,DYZ3×2,D18Z1×2)[14];(DXZ1×1,DYZ3×1,D18Z1×2)[34]。見圖1。

    G顯帶分析羊水細(xì)胞染色體發(fā)現(xiàn)存在五種不同核型即:mos 46,X,idic(Y)(q11.22)[34];45,X[12];46,X,del(Y)(q11.22)[5];47,X,idic(Y)(q11.22)×2[5];46,XY[44],除45,X外其余四種核型涉及四種不同形態(tài)的Y染色體。見圖2。

    3 討論

    傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)產(chǎn)前診斷是避免染色體異?;純撼錾闹匾侄?。隨著產(chǎn)前診斷技術(shù)的普及,越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn),羊水和絨毛培養(yǎng)中易出現(xiàn)嵌合現(xiàn)象,這些嵌合體有些是真性嵌合,有些是假性嵌合,如何正確識(shí)別,如何正確進(jìn)行相關(guān)遺傳咨詢,成為目前臨床關(guān)注的焦點(diǎn)之一。臨床上碰到的嵌合體多數(shù)為同源性嵌合體[2],其又可分為真性嵌合體和假性嵌合體。真性嵌合體主要是由于細(xì)胞有絲分裂不分離或染色體丟失所致,也可能是因?yàn)橛薪z分裂后期染色單體的遲留,導(dǎo)致個(gè)別子細(xì)胞及其后代中少了一條染色體[3]。而假性嵌合體則可能是由于胎兒體外不重要細(xì)胞增殖、母體細(xì)胞污染、胎兒脫落細(xì)胞體外培養(yǎng)畸變或染色體制片中產(chǎn)生等。嵌合體胎兒的臨床表現(xiàn),主要取決于異常核型所占比例,異常核型比例越高,臨床癥狀越明顯;相反,嵌合體中含正常核型越高,臨床表現(xiàn)越輕。一般認(rèn)為,在羊水培養(yǎng)中胎兒真性嵌合體的發(fā)生率約為0.1%~0.3%,在絨毛培養(yǎng)中為0.8%。對(duì)于假性嵌合,可以通過(guò)CMA和FISH檢測(cè)技術(shù)進(jìn)一步檢測(cè)予以排除[4]。

    表1 染色體嵌合體相關(guān)結(jié)果及其妊娠結(jié)局

    圖1 羊水中期細(xì)胞分裂相FISH檢測(cè)結(jié)果

    圖2 羊水細(xì)胞染色體G顯帶核型

    采用傳統(tǒng)的羊水細(xì)胞培養(yǎng)核型分析方法是檢測(cè)染色體結(jié)構(gòu)重排的金標(biāo)準(zhǔn),并能檢測(cè)染色體的非整倍體[5],但在診斷染色體亞顯微小片段結(jié)構(gòu)異常和復(fù)雜易位斷裂點(diǎn)時(shí)仍非常困難。CMA和FISH的應(yīng)用能彌補(bǔ)傳統(tǒng)核型分析的不足,相互補(bǔ)充。

    CMA是以微陣列技術(shù)為基礎(chǔ)的基因組拷貝數(shù)變異(copy number variations,CNVs)分析技術(shù),主要包括基于比較基因組雜交的微陣列(array-based comparative genomic hybridization,aCGH) 和基于單核苷酸多態(tài)性的微陣列(single nucleotide polymorphismarray,SNParray)[6]。CMA是一種高分辨率的全基因組染色體變異檢測(cè)技術(shù),近年來(lái)其在臨床的應(yīng)用逐步深入和廣泛。CMA技術(shù)檢測(cè)未培養(yǎng)細(xì)胞基因拷貝數(shù)變化,能夠檢測(cè)出染色體微小片段的缺失或重復(fù),彌補(bǔ)傳統(tǒng)核型肉眼分辨率有限的不足。但其在聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增階段存在優(yōu)勢(shì)擴(kuò)增現(xiàn)象,會(huì)影響嵌合體病例中異常核型真實(shí)的嵌合比例,同時(shí)對(duì)于低比例嵌合體(嵌合比例小于20%)的檢出率也很有限。而且CMA技術(shù)對(duì)于復(fù)雜結(jié)構(gòu)異常的病例,僅能提示基因拷貝數(shù)的變化,并不能直觀地確定其結(jié)構(gòu)畸變類型及染色體空間結(jié)構(gòu)變化。

    FISH技術(shù)是利用熒光標(biāo)記的特異性寡核苷酸片段作為探針,與染色體、細(xì)胞或組織中的核酸按照堿基互補(bǔ)配對(duì)原則進(jìn)行雜交,通過(guò)熒光系統(tǒng)檢測(cè),對(duì)待測(cè)DNA進(jìn)行定性或相對(duì)定位分析[7]。相對(duì)于傳統(tǒng)的核型分析技術(shù),F(xiàn)ISH技術(shù)具有快速及特異性高的優(yōu)點(diǎn)。更由于其直觀性,成為眾多遺傳學(xué)診斷技術(shù)的有效驗(yàn)證方法,具有廣闊的應(yīng)用前景,逐漸成為解決復(fù)雜的臨床細(xì)胞遺傳學(xué)問(wèn)題的一種重要方法,是對(duì)經(jīng)典細(xì)胞遺傳學(xué)方法的補(bǔ)充[8]。FISH技術(shù)不僅可以直接檢測(cè)未培養(yǎng)羊水細(xì)胞間期細(xì)胞,對(duì)最常見的非整倍體作出快速的產(chǎn)前診斷,還可以對(duì)傳統(tǒng)羊水細(xì)胞核型分析懷疑異常的病例進(jìn)行羊水中期細(xì)胞FISH檢測(cè),以明確胎兒染色體結(jié)構(gòu)異常的來(lái)源和準(zhǔn)確定位斷裂點(diǎn)[9-10]。因此對(duì)于部分羊水核型少或懷疑嵌合的患者,取羊水或臍血等直接進(jìn)行FISH檢測(cè),不受細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中選擇性生長(zhǎng)的影響,可以更真實(shí)地反映胎兒體內(nèi)的細(xì)胞嵌合狀況,對(duì)于判斷胎兒預(yù)后會(huì)有更多幫助。目前英國(guó)臨床細(xì)胞遺傳協(xié)會(huì)已把采用間期細(xì)胞的FISH技術(shù)作為產(chǎn)前嵌合體檢查的篩查方法[11]。

    本研究染色體嵌合體病例中,性染色體數(shù)目嵌合最常見(59%)。核型結(jié)果提示嵌合體的病例中,有近50%的病例CMA結(jié)果未檢測(cè)到嵌合現(xiàn)象,雖然FISH復(fù)查仍提示為嵌合體,但嵌合比例均在10%左右屬于低比例嵌合體,分析原因可能是CMA在檢測(cè)過(guò)程中需進(jìn)行PCR擴(kuò)增,從而改變了原有嵌合比例導(dǎo)致低比例嵌合體無(wú)法檢出。對(duì)于本研究中發(fā)現(xiàn)的2例多倍體嵌合體病例,其CMA和FISH結(jié)果均正常,為假性嵌合,不具臨床意義。因常染色體數(shù)目異常對(duì)胎兒生長(zhǎng)發(fā)育影響較大,異常核型比例越高,胎兒可能預(yù)后越差,本研究中常染色體數(shù)目異常嵌合病例多選擇終止妊娠,僅1例20號(hào)三體低比例嵌合病例選擇繼續(xù)妊娠,需進(jìn)一步隨訪生長(zhǎng)發(fā)育情況。本研究中涉及3例染色體結(jié)構(gòu)異常嵌合病例,且均為性染色體雙著絲粒染色體復(fù)雜結(jié)構(gòu)嵌合,通過(guò)核型分析能夠直觀看到不同異常核型的形態(tài),但無(wú)法確定異常核型來(lái)源;通過(guò)CMA結(jié)果提示性染色體拷貝數(shù)變化,異常核型來(lái)源可能為性染色體;進(jìn)一步結(jié)合FISH技術(shù)檢測(cè)中期細(xì)胞性染色體著絲粒探針,可以明確雙著絲粒的存在及其在染色體上的位置。三種技術(shù)手段相互結(jié)合,相互補(bǔ)充,最終明確了異常染色體來(lái)源及其結(jié)構(gòu)變異類型,給出更準(zhǔn)確、更直觀的染色體核型變異結(jié)果。

    繼續(xù)妊娠的嵌合體病例以性染色體數(shù)目嵌合為主,目前能夠隨訪到的妊娠結(jié)局均未表現(xiàn)出明顯的生長(zhǎng)發(fā)育異常,電話隨訪家長(zhǎng)都反映孩子沒(méi)有異常,外觀能見到是正常男性或女性,考慮性染色體嵌合體可能對(duì)患兒青春期發(fā)育以及后續(xù)生育產(chǎn)生影響,需繼續(xù)對(duì)這些病例進(jìn)行隨訪至成年。這些患兒出生后均沒(méi)有再次復(fù)查核型,能夠出生后多組織復(fù)測(cè)核型當(dāng)然可以更明確患兒的嵌合比例及嵌合現(xiàn)象分布情況,但臨床操作起來(lái)較難,一方面技術(shù)上目前我中心僅能檢測(cè)外周血核型,其他組織核型檢測(cè)尚未開展,另一方面相關(guān)標(biāo)本的留取上也存在困難。

    綜上所述,嵌合現(xiàn)象目前仍是遺傳咨詢中的一大難題。對(duì)羊水染色體分析中判定疑似嵌合體的病例,需采用多種方法加以驗(yàn)證,不應(yīng)急于終止妊娠,應(yīng)充分應(yīng)用CMA、FISH技術(shù)結(jié)合G顯帶核型結(jié)果進(jìn)行綜合分析,并需要對(duì)胎兒形態(tài)進(jìn)行細(xì)致的超聲評(píng)估。從而更加準(zhǔn)確地確定嵌合類型以及異常核型的嵌合比例,為臨床醫(yī)師指導(dǎo)遺傳咨詢提供更加可靠的依據(jù),既能避免正常妊娠的終止,也能保證出生人口的質(zhì)量。對(duì)于自愿保留嵌合體胎兒的患者,應(yīng)充分告知胎兒可能的預(yù)后風(fēng)險(xiǎn),因異常核型嵌合比例以及嵌合部位不同,對(duì)患兒生長(zhǎng)發(fā)育的影響也不同,應(yīng)密切關(guān)注胎兒出生后的生長(zhǎng)發(fā)育情況,必要時(shí)重新檢測(cè)患兒不同組織染色體核型嵌合情況。

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