果實(shí)糖代謝及其相關(guān)酶基因研究進(jìn)展

廖光聯(lián) ，鐘 敏，黃春輝，賈東峰，徐小彪*

（1.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，江西 南昌 330045；2.江西農(nóng)業(yè)大學(xué) 農(nóng)學(xué)院/獼猴桃研究所，江西 南昌 330045）

果實(shí)中的可溶性固形物含量和種類決定著果實(shí)的風(fēng)味品質(zhì)?？扇苄怨绦挝镏凶钪饕某煞质翘穷愇镔|(zhì)，糖類物質(zhì)是果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)形成的決定性因素之一，可作為能源物質(zhì)，保障植株的正常生理代謝活動(dòng)[1-2]。之外，還是重要的信號調(diào)節(jié)物質(zhì)，參與調(diào)控植物的生長發(fā)育及相關(guān)基因的表達(dá)[3-4]。不同種類和數(shù)量的糖類物質(zhì)可形成果實(shí)不同的風(fēng)味品質(zhì)，提升果實(shí)品質(zhì)需了解糖類物質(zhì)的形成、運(yùn)輸、代謝等過程，挖掘糖類物質(zhì)代謝的相關(guān)酶對其的影響，還需不斷深入代謝酶的基因研究，從分子技術(shù)水平上提高果實(shí)風(fēng)味品質(zhì)。目前，國內(nèi)外對糖代謝主要集中在蘋果[5]、柑橘[6]、葡萄[7]、芒果[8]等園藝植物上，相關(guān)代謝酶則主要集中在蔗糖合成酶（SS）、轉(zhuǎn)化酶、蔗糖磷酸合成酶（SPS）上，近年來國內(nèi)外有關(guān)果實(shí)糖代謝及調(diào)控分子生物學(xué)研究已十分廣泛。

1 糖的生理功能

果實(shí)糖代謝的生理生化過程較為復(fù)雜，是果實(shí)表現(xiàn)出成熟的主要標(biāo)志之一[9]。糖類物質(zhì)參與果實(shí)成熟過程，其不僅是果實(shí)主要風(fēng)味物質(zhì)，也是果實(shí)器官發(fā)育和物質(zhì)代謝的物質(zhì)基礎(chǔ)，其糖的積累共有淀粉轉(zhuǎn)化型、糖積累型、中間轉(zhuǎn)化型3種[10]。糖濃度的高低可誘導(dǎo)或抑制有關(guān)基因的表達(dá)。糖類物質(zhì)是果樹生長發(fā)育的重要物質(zhì)，其不僅作為能源物質(zhì)參與果樹的生長發(fā)育過程，而且作為一種信號物質(zhì)參與植物成花與果實(shí)成熟控制基因的表達(dá)調(diào)節(jié)[11]，并且能抵抗外界非生物脅迫的作用[12]，在馬鈴薯植物微管的形成具有促進(jìn)作用[13]。果實(shí)中積累的可溶性糖大部分是蔗糖、果糖和葡萄糖[14-15]。這些糖的積累與果實(shí)成熟具有重要關(guān)系。糖類物質(zhì)是許多基因表達(dá)的調(diào)控信號，其中蔗糖在各種糖類中是最有效的信號分子。研究發(fā)現(xiàn)蔗糖可以作為信號分子參與ABA互作調(diào)控草莓果實(shí)的成熟[16]。

2 糖的種類

糖類物質(zhì)是果實(shí)的重要組成成分，且是其他營養(yǎng)成分及芳香物質(zhì)的合成原料。不同品種間糖變化趨勢不一樣，如在‘紅陽’獼猴桃上，糖含量呈現(xiàn)緩慢上升的趨勢，而在‘金魁’獼猴桃糖含量則呈現(xiàn)上下波動(dòng)趨勢[17]。一般情況下，果實(shí)進(jìn)入成熟后期，由于淀粉的轉(zhuǎn)化作用，果實(shí)的糖含量和可溶性固形物含量會(huì)迅速增加[18]。不同器官組織糖含量不同，糖的種類也存在一定的差異，如番茄花梗和果柄維管束中主要含有蔗糖，果實(shí)的其它部位中則主要含有葡萄糖和果糖；果皮組織和果實(shí)維管束中的葡萄糖、果糖含量該與果膠質(zhì)和隔壁中的含量存在顯著差異[19]。不同種之間含有的糖的種類也不盡相同，如葡萄以葡萄糖為主，桃、杏以蔗糖為主。這種現(xiàn)象的出現(xiàn)很大程度上決定于果實(shí)中的糖代謝類型及相關(guān)酶的活性[20]。同種植物但不同品種間，糖類型和含量也存在較大的差異，這已在9個(gè)白梨品種上的研究中得到證明[21]。在不同成熟期黃肉桃上的研究也發(fā)現(xiàn)，各糖組分的含量及其所占總量的比例均有差異，蔗糖含量及其所占總糖的比例表現(xiàn)為早熟＞中熟＞晚熟；山梨醇則正好相反，為早熟＜中熟＜晚熟；葡萄糖和果糖表現(xiàn)為晚熟高于早熟和中熟，早熟與中熟間差異不顯著[22]。同一品種不同果實(shí)部位間糖類物質(zhì)的積累也存在一定的先后順序，棗果實(shí)果肩部位糖積累均早于果頂，且果肩可溶性糖含量均顯著高于果頂[23]。

3 糖的相關(guān)代謝酶

圖1 果實(shí)細(xì)胞中的糖代謝途徑[23]Fig.1 Pathway of sugar metabolism in fruit cell[23]

葉片通過光合作用產(chǎn)生的光合產(chǎn)物是果實(shí)糖類物質(zhì)積累的重要來源，以蔗糖和山梨醇的形式通過韌皮部長途運(yùn)輸后卸載到發(fā)育過程中的果實(shí)內(nèi)（圖1）[24]。經(jīng)過蛋白跨膜運(yùn)輸和系列酶反應(yīng)，最終以蔗糖、山梨醇、果糖和葡萄糖的形式分散于果實(shí)的不同部位，使得果實(shí)具有獨(dú)特的風(fēng)味品質(zhì)[25]。蔗糖代謝、山梨醇代謝、己糖代謝和淀粉代謝途徑是目前公認(rèn)的4大糖代謝途徑，這幾種途徑均由不同類型的代謝酶參與。不同物種間糖積累機(jī)制存在較大差異，代謝酶的調(diào)控作用也存在較大的差別。在西瓜上的研究則表明，酸性轉(zhuǎn)化酶（AI）和中性轉(zhuǎn)化酶（NI）是其主要的調(diào)控酶[26]；SS、AI和NI酶與番茄果實(shí)糖含量密切相關(guān)[27]；桃果實(shí)中的SS和SPS酶活性對糖積累起著關(guān)鍵性作用[28]；在草莓上，除轉(zhuǎn)化酶外，己糖激酶對糖積累也起著關(guān)鍵作用[29]；紅富士蘋果果實(shí)蔗糖代謝主要受到AI和SS酶活性的調(diào)控[30]。在‘馬來西亞1號’菠蘿蜜上的研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖的積累與AI活性呈顯著負(fù)相關(guān)，與SS、SPS活性呈顯著正相關(guān)[31]，與在葡萄上的研究一致[32]，并有研究認(rèn)為其為菠蘿蜜蔗糖合成的主要原因，AI和NI可能是導(dǎo)致果實(shí)甜度的主要酶[33]，在葡萄上的研究則表明AI是葡萄果實(shí)糖積累的最重要的調(diào)節(jié)因子[34]，這與棗上的研究一致[35]。在臍橙上則發(fā)現(xiàn)，SPS和SS是糖類物質(zhì)積累的關(guān)鍵酶[15]；果實(shí)糖積累過程中存在蔗糖快速積累期，直接影響到果實(shí)成熟時(shí)可溶性糖含量的高低[36]。

4 糖的相關(guān)酶基因的調(diào)控

糖代謝是在相關(guān)酶基因的調(diào)節(jié)下完成的，不同果實(shí)生長發(fā)育時(shí)期，相關(guān)代謝基因的表達(dá)差異會(huì)導(dǎo)致其不同時(shí)期的糖分的積累量出現(xiàn)差異[37]。在‘南紅梨’上的研究發(fā)現(xiàn)花后60 d時(shí)蔗糖合成酶Pu SS1和Pu SS2表達(dá)量最高，且Pu SS2在花后120 d及134 d也有較高的表達(dá)量；花后60 d和120 d時(shí)，蔗糖磷酸合成酶Pu SPS2和Pu SPS1分別達(dá)到最大值；在果實(shí)發(fā)育早期，蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Pu SUT及β-葡萄糖甘酶Pu BGLU1、Pu BGLU2和Pu BGLU4有大量表達(dá)，在果實(shí)發(fā)育后期堿性/中性轉(zhuǎn)化酶Pu NINV1和Pu NINV2有大量表達(dá)[38]。不僅在不同的果實(shí)生長發(fā)育期間其代謝酶表達(dá)會(huì)有所差異，在不同的植株部位，其糖代謝相關(guān)酶的表達(dá)也會(huì)有所差異，在桃上蔗糖合成酶的研究發(fā)現(xiàn)，蔗糖合成酶Pp SS3主要在果實(shí)和韌皮部表達(dá)，蔗糖合成酶Pp SS1在葉片中的表達(dá)較高[39]。在鐵皮石斛上的研究表明，3個(gè)Do Inv Inh基因在根、莖、葉和花種都有表達(dá)，且其中Do Inv Inh2和Do Inv Inh3基因在根中表達(dá)量最低，而在花中表達(dá)量最高[40]。以桃為試驗(yàn)材料發(fā)現(xiàn)，蔗糖合成酶（SS1至SS6）在植物蔗糖代謝中起著關(guān)鍵作用，其外顯子/內(nèi)含子分析表明，PpSS基因含有11～13個(gè)內(nèi)含子，具有高度的保守性，對6個(gè)PpSS基因的表達(dá)水平分析表明，PpSS 1的轉(zhuǎn)錄本在葉片和老韌皮部幾乎檢測不到，PpSS 2和PpSS 3在其他10個(gè)植物物種中幾乎檢測不到，而另外3個(gè)PpSS基因在所有組織中均有差異表達(dá)，并在組織發(fā)育的不同階段被檢測到[41]。在棗蔗糖合成酶SS6基因上表達(dá)也有類似的發(fā)現(xiàn)[42]。目前，在蔗糖酸性轉(zhuǎn)化酶基因上的研究較多，如楊梅、柑橘、桃、甜瓜等。秦巧平等[43]以楊梅為試驗(yàn)材料發(fā)現(xiàn)，MrIVR1編碼的蛋白質(zhì)屬于細(xì)胞壁酸性轉(zhuǎn)化酶，半定量RT-PCR表達(dá)分析顯示，其在果實(shí)發(fā)育早期表達(dá)量最高，在成熟果實(shí)中表達(dá)水平較低；安新民等[44]以柑橘基因組DNA為模板，采用PCR方法分別擴(kuò)增出長約740 bp和530 bp的DNA片段，分別克隆入pBS-T和pMD18-T載體，通過測序獲得柑橘酸性轉(zhuǎn)化酶基因家族的兩個(gè)成員A和B，分別長742 bp和524 bp，在GenBank中進(jìn)行同源性檢索，推測酸性轉(zhuǎn)化酶基因成員A和B編碼的蛋白分別定位于液泡和細(xì)胞壁。

依靠先進(jìn)的科學(xué)技術(shù)水平，現(xiàn)已克隆出許多和糖代謝相關(guān)的基因。于喜艷等[45]從甜瓜花后25 d的果實(shí)總RNA中擴(kuò)增出目標(biāo)cDNA片段，檢測其在甜瓜果實(shí)不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)變化發(fā)現(xiàn)，該基因在甜瓜果實(shí)花后25 d開始表達(dá)，隨著果實(shí)的成熟，表達(dá)量升高；王君[46]根據(jù)GenBank中登錄的酸性轉(zhuǎn)化酶基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，通過RT-PCR擴(kuò)增獲得長度為429 bp的酸性轉(zhuǎn)化酶基因片段；應(yīng)用同源克隆和RACE方法從茌梨果肉中克隆到內(nèi)切-β-1，4-葡聚糖酶基因的一個(gè)同源基因cDNA的全長序列，命名為PbEG，其堿基長度為1 971 bp，PbEG的開放閱讀框編碼493個(gè)氨基酸，相對分子量為54.596 1 kDa，等電點(diǎn)為9.14[47]；帥良等[48]以‘石硤’龍眼為試材，采用RT-PCR結(jié)合RACE技術(shù)成功克隆了3個(gè)龍眼中性轉(zhuǎn)化酶基因全長cDNA序列，研究發(fā)現(xiàn)3個(gè)基因在不同組織中表達(dá)量具有較大差異，其中DlNI-1和DlNI-2在葉片中都具有較高的表達(dá)量，而DlNI-3在果皮組織中具有最高的表達(dá)量。SS基因被認(rèn)為與草莓果實(shí)成熟有關(guān)，Hua等[49]利用RT-PCR方法克隆了FaSS 1的編碼cDNA序列，進(jìn)行基因沉默和原核表達(dá)，證明其具有較高的蔗糖裂解活性，在草莓果實(shí)成熟過程中起著重要的調(diào)控作用；相關(guān)研究表明生長素反應(yīng)因子SLARF 4也參與控制番茄果實(shí)發(fā)育過程中的糖代謝[50]，同時(shí)低溫馴化[51-52]、植物生長調(diào)節(jié)劑[53]對糖代謝基因的表達(dá)具有一定的影響。

5 栽培管理措施對糖代謝的影響

糖代謝受到各種因素的影響，可以分為環(huán)境因素與栽培管理因素，其中環(huán)境因素主要是光、溫度、濕度、氣體等，栽培管理措施主要是指套袋、鋪設(shè)反光膜、脅迫、施肥等栽培技術(shù)[54-55]。在龍眼上的饑餓脅迫研究表明，饑餓脅迫會(huì)加速蔗糖分解，蔗糖含量的降低使蔗糖分解代謝酶活性轉(zhuǎn)而減弱，而饑餓脅迫對SPS催化的蔗糖合成代謝影響不明顯[56]。在葡萄上的根域限制栽培顯著提高了‘紅地球’葡萄果實(shí)成熟期的葡萄糖、蔗糖和總糖含量，提高了SAI、SNI、CBAI、SSⅡ活性，同時(shí)根域限制栽培顯著提高了轉(zhuǎn)色期SAI和CBAI的活性和成熟期SNI和SSⅡ的活性[57]；套袋對果實(shí)糖代謝具有一定的影響，其主要是通過影響果實(shí)發(fā)育早期轉(zhuǎn)化酶活性來影響果實(shí)糖分積累[58]；在枇杷上的套袋結(jié)果表明，套袋后果實(shí)中蔗糖、葡萄糖和可溶性固形物含量增加，且套袋主要是通過提高果實(shí)SS和SPS的活性來提高光合產(chǎn)物的[59]；在荔枝上的水脅迫也發(fā)現(xiàn)，在荔枝果實(shí)發(fā)育后期，分解蔗糖的AI、SS及合成蔗糖的SPS的活性都為水分脅迫的高于灌溉處理的，這將有助于增加脅迫的果實(shí)庫強(qiáng)及糖的積累[60]；吳瑞媛等[61]對“翠冠”梨鋪銀色反光膜后發(fā)現(xiàn)，SPS的活性高于對照，而NI活性明顯低于對照，明顯促進(jìn)了果實(shí)的糖積累；鹽脅迫對糖的代謝具有一定的影響，在枸杞上的研究表明，隨NaCl濃度升高和處理時(shí)間的延長，枸杞葉片多糖和可溶性糖含量顯著增加（P0.05），蔗糖含量呈上升趨勢，而淀粉含量顯著下降（P0.05），還原糖含量呈下降趨勢[62]；有研究也表明高溫脅迫對糖代謝具有影響，溫度升高果糖顯著降低，葡萄糖含量不受影響或略有升高，3種己糖磷酸酯的含量、葡萄糖-6-磷酸酯（G-6-P）、葡萄糖-1-磷酸（G-1-P）和果糖-6-磷酸（F-6-P）的濃度均相應(yīng)地降低，而葡萄糖-6-磷酸（G-1-P）和果糖-6-磷酸（F-6-P）的含量則下降了，蔗糖合成酶分解產(chǎn)生的糖核苷酸（UDP-葡萄糖）濃度在高溫下也降低了[63]；此外，不同有機(jī)肥[64]、硼元素[65]、噴施沼液[66]、地膜覆蓋[67]等對果實(shí)和葉片糖代謝也具有一定的影響，UV-b輻射除對植物葉片外，對莖、根、果、粒含糖量均具有影響[68]。

6 研究展望

糖類物質(zhì)是生命活動(dòng)的重要能源物質(zhì)，可以保障植株的正常生理代謝活動(dòng)，除此之外還是風(fēng)味品質(zhì)形成的主要決定因素之一。了解果實(shí)糖代謝的生理特性，可以有效改善果實(shí)品質(zhì)，提高果實(shí)商品價(jià)值。而果實(shí)糖代謝是一個(gè)較為復(fù)雜的生理過程，受到諸多酶基因及外在環(huán)境因素的影響。目前，果實(shí)糖積累過程中其不同類型的糖組分動(dòng)態(tài)變化及相關(guān)酶調(diào)控機(jī)制已較為清晰，但仍需進(jìn)一步通過制備抗體等方式分離純化糖代謝過程中的關(guān)鍵酶，以明確酶作用中心。科學(xué)技術(shù)的進(jìn)步必將帶動(dòng)農(nóng)業(yè)技術(shù)的革新，在果樹上基因組學(xué)、蛋白組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)已經(jīng)成為目前較為熱門的研究領(lǐng)域，但代謝組學(xué)仍然是果樹研究領(lǐng)域的重要組成部分。第三代測序技術(shù)的發(fā)展給糖代謝酶相關(guān)調(diào)控基因的研究帶來契機(jī)，可明確關(guān)鍵酶基因?qū)麑?shí)糖分積累的直接作用方式，并探明糖積累的機(jī)理。