肉桂醛體外對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的抑菌機(jī)制

何學(xué)文，戴雨蕓，李欣越，何涇正，李 超，程 嬌，尹立子

（四川農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，四川 成都 611130）

【研究意義】沙門氏菌屬屬革蘭氏陰性的腸桿菌科，為兼性厭氧細(xì)菌。沙門氏菌可利用葡萄糖、麥芽糖、甘露醇、山梨醇、不發(fā)酵乳糖和蔗糖在普通培養(yǎng)基上生長(zhǎng)形成無色半透明、光滑、邊緣整齊的菌落。菌體抗原已經(jīng)被公認(rèn)為沙門氏菌血清型分型的基礎(chǔ)，沙門氏菌的抗原種類多且結(jié)構(gòu)非常復(fù)雜，目前全世界已發(fā)現(xiàn)的血清型約有2 500種，我國(guó)已發(fā)現(xiàn)292個(gè)血清型[1]。沙門氏菌可引起人和動(dòng)物的敗血癥、胃腸炎和局部感染。沙門氏菌還可以導(dǎo)致懷孕母畜流產(chǎn)，嚴(yán)重影響動(dòng)物的經(jīng)濟(jì)價(jià)值和生產(chǎn)性能[2-4]。肉類、蛋類等動(dòng)物制品在加工過程中容易被沙門氏菌污染，人類食用被沙門氏菌污染的食品后易患病，臨床癥狀表現(xiàn)為腹瀉、腸熱病、菌血癥[5-6]。沙門氏菌的防治具有重要的公共衛(wèi)生意義?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】肉桂醛也稱桂皮醛，為中藥桂枝和肉桂中的主要成分[7-9]。肉桂醛可用于心腦血管病、糖尿病、高血壓、胃潰瘍等疾病的治療和預(yù)防。此外，肉桂醛氣味芳香怡人，且對(duì)細(xì)菌、真菌具有一定的殺滅作用，也常用來作為食用香精和飼料防腐添加劑，目前已被廣泛應(yīng)用于多個(gè)領(lǐng)域。王帆等[10]從生長(zhǎng)、結(jié)構(gòu)和生理指標(biāo)3方面探究肉桂醛對(duì)大腸桿菌和綠膿桿菌的抑制作用，結(jié)果顯示肉桂醛能抑制細(xì)菌的增殖，并損傷大腸桿菌和綠膿桿菌的細(xì)胞膜，測(cè)定生理指標(biāo)發(fā)現(xiàn)大腸桿菌內(nèi)活性氧含量明顯升高，說明肉桂醛可能通過氧化脅迫來?yè)p傷細(xì)胞膜，殺滅細(xì)菌。Karumathil等[11]發(fā)現(xiàn)反式肉桂醛可破壞鮑曼不動(dòng)桿菌的生物膜，其作用機(jī)制為下調(diào)鮑曼不動(dòng)桿菌生物膜相關(guān)的基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。據(jù)研究表明，肉桂醛可降低黃曲霉菌胞內(nèi)活性氧（ROS）代謝水平，并且引起菌絲細(xì)胞氧化損傷、增加細(xì)胞膜通透性[12]。王貴強(qiáng)等[13]發(fā)現(xiàn)肉桂醛可損傷耐藥白色念珠菌細(xì)胞膜，抑制細(xì)胞膜麥角甾醇的合成。此外還有研究表明肉桂醛能下調(diào)金黃色葡萄球菌毒力因子的表達(dá)[14]。【本研究切入點(diǎn)】已有的研究表明，肉桂醛對(duì)細(xì)菌和真菌都具有一定的抑制作用，但其作用機(jī)制并不相同，包括氧化損傷、下調(diào)基因轉(zhuǎn)錄水平、增加細(xì)胞膜通透性等，但肉桂醛對(duì)沙門氏菌的作用機(jī)制尚未完全明確。本文將在前人的研究基礎(chǔ)上，進(jìn)一步探究肉桂醛的抑菌機(jī)制?！緮M解決的關(guān)鍵問題】本研究以鼠傷寒沙門氏菌為實(shí)驗(yàn)菌株，通過觀察肉桂醛對(duì)沙門氏菌增殖速率、蛋白質(zhì)、細(xì)胞膜通透性和細(xì)胞形態(tài)等方面的影響，探究肉桂醛對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的體外抑菌機(jī)制，為肉桂醛應(yīng)用于臨床抗沙門氏菌感染提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株

鼠傷寒沙門氏菌（ATCC14028）由四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院藥學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存，將沙門氏菌活化后涂布于胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基，置37℃恒溫靜置培養(yǎng)24 h，挑取單菌落接種于胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)液，37℃，震蕩培養(yǎng)過夜，然后稀釋成OD600nm=0.2的菌懸液備用。

1.2 試劑和儀器

肉桂醛（HPLC≥98%）購(gòu)于成都瑞芬思生物科技有限公司；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）和胰蛋白胨大豆瓊脂培養(yǎng)基（TSA）購(gòu)于杭州微生物試劑有限公司；考馬斯亮藍(lán)R-250、二甲基亞砜、無水葡萄糖、無水乙醇購(gòu)于成都浩博優(yōu)科技有限公司；SDS-PAGE凝膠配置試劑盒、5×蛋白上樣緩沖液和雙色預(yù)染蛋白Marker購(gòu)于成都羅寧生物有限公司；磷酸鹽緩沖液粉末（PBS）購(gòu)于成都好校友生物科技有限公司；BCA試劑盒購(gòu)于南京建成生物科技有限公司。

SM530C高壓蒸汽滅菌鍋、低溫恒溫培養(yǎng)箱（成都盛德先華科貿(mào)有限公司）；高速冷凍離心機(jī)ST16R（美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司）；電子分析天平J-SKY（昆山巨天儀器設(shè)備有限公司）；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)SM-650A（南京舜瑪儀器設(shè)備有限公司）；全功能凝膠成像系統(tǒng)儀（美國(guó)Bio-Rad公司）；電導(dǎo)率儀DDS-307（上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司）；超凈工作臺(tái)SW.CJ.1D（成都市宜邦科析儀器有限公司）。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1MIC和MBC的測(cè)定MIC的測(cè)定參照CLSI，采用微量肉湯稀釋法。向96孔板中加入TSB和肉桂醛，通過倍比稀釋法使藥物終質(zhì)量濃度為512，256，128，64，32，16，8，4，2 μg/mL，然后加入菌懸液。另外設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照組（加TSB和菌懸液），陰性對(duì)照組（加TSB和藥物），空白對(duì)照組（加TSB）。96孔板在37℃靜置培養(yǎng)24 h后，陽(yáng)性對(duì)照組應(yīng)渾濁，空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組應(yīng)澄清透明。觀察每組實(shí)驗(yàn)結(jié)果，培養(yǎng)液澄清透明的最小藥物濃度為MIC。

在MIC的基礎(chǔ)上，取藥物組澄清的培養(yǎng)基100 μL均勻涂布于TSA平板，37℃靜置培養(yǎng)24 h。然后肉眼觀察，培養(yǎng)基上菌落不超過5個(gè)視為殺滅細(xì)菌的最小藥物濃度為MBC。

1.3.2 肉桂醛對(duì)沙門氏菌生長(zhǎng)曲線的影響 向TSB培養(yǎng)基中加入菌懸液，使培養(yǎng)基中細(xì)菌的終濃度OD600nm為0.2左右。然后加入肉桂醛，使肉桂醛最終濃度為1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC、MIC、2MIC和4MIC。同時(shí)設(shè)置空白對(duì)照組（不加肉桂醛）。37 ℃震蕩（150 r/min）培養(yǎng)，分別于0，1，2，3，4，6，8，10，12，24 h時(shí)吸取出培養(yǎng)液測(cè)定OD600nm的數(shù)值。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，吸光光度值為縱坐標(biāo)，繪制肉桂醛作用后沙門氏菌的生長(zhǎng)曲線并確定沙門氏菌的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。

1.3.3 肉桂醛作用鼠傷寒沙門氏菌的SDS-PAGE分析 沙門氏菌接種于TSB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜，將菌液稀釋至OD600nm為0.2左右，分別加入不同濃度的肉桂醛藥液，使肉桂醛的終濃度為1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC，并設(shè)置空白對(duì)照組（不加肉桂醛），37℃震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。將菌液稀釋至相同OD值后，取等體積菌液離心（6 000 r/min，10 min），棄上清，PBS清洗沉淀，重復(fù)3次后，將沉淀重懸于1 mL PBS緩沖液中。用超聲破碎儀破碎菌體，設(shè)定程序?yàn)槠扑? s，停頓2 s，75%功率，破碎時(shí)間為10 min。破碎后6 000 r/min離心取上清液。用BCA試劑盒測(cè)定上清液中的蛋白含量。取等量4倍體積上清液加入1倍體積5×上樣緩沖液，98℃變性處理5 min，各取15 μL樣品進(jìn)行電泳，電泳結(jié)束后凝膠用考馬斯亮藍(lán)R250染色過夜，然后脫色4～8 h，用凝膠成像儀拍照。

1.3.4 掃描電子顯微鏡觀察肉桂醛對(duì)鼠傷寒沙門氏菌形態(tài)的影響 沙門氏菌接種于TSB培養(yǎng)基中，加入肉桂醛藥液，使肉桂醛最終濃度為1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC，并設(shè)置空白對(duì)照組（不加肉桂醛），37℃震蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期。取細(xì)菌懸液離心，棄上清，用滅菌的PBS緩沖液洗滌3次至上清液透明無色為止，棄上清。2.5%戊二醛溶液固定菌體后，4℃放置過夜，然后用PBS緩沖液輕柔洗滌3遍，經(jīng)過30%、50%、70%、90%、100%濃度的乙醇脫水，每個(gè)濃度各處理5 min，隨后室溫晾干、噴金，在掃描電子顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.3.5 肉桂醛對(duì)鼠傷寒沙門氏菌細(xì)胞膜的影響 沙門氏菌接種于TSB培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，離心棄上清液，用無菌5%葡萄糖溶液洗滌3次，然后將菌體重懸于無菌5%葡萄糖溶液中，使其濃度為1×107CFU/mL，設(shè)置藥物處理組和空白對(duì)照組（不加肉桂醛），處理組加入MIC濃度的肉桂醛藥液，空白組不加藥液。將菌液于37 ℃震蕩培養(yǎng)（150 r/min），分別于0，0.5，1，1.5，2，2.5，3 h取上清液測(cè)量電導(dǎo)率，以時(shí)間為橫坐標(biāo)、電導(dǎo)率為縱坐標(biāo)作圖。

1.3.6 肉桂醛對(duì)鼠傷寒沙門氏菌DNA外滲量的影響 將沙門氏菌培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，用無菌PBS緩沖液洗滌3次后重懸，制成1×107CFU/mL的菌懸液，設(shè)置藥物處理組和空白對(duì)照組（不加肉桂醛），處理組加入肉桂醛藥液，使其濃度為MIC，將菌液于37 ℃震蕩培養(yǎng)（150 r/min），分別于0，0.5，1，1.5，2，2.5，3 h取上清液測(cè)量260 nm處的吸光光度值，并以時(shí)間為橫坐標(biāo)、OD值為縱坐標(biāo)作圖。

1.3.7 數(shù)據(jù)分析 每個(gè)實(shí)驗(yàn)均重復(fù)3次，用GraphPad Prism6.0軟件處理并分析電導(dǎo)率實(shí)驗(yàn)和DNA外滲實(shí)驗(yàn)的數(shù)據(jù)，組間進(jìn)行t檢驗(yàn)，P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 MIC和MBC的測(cè)定

肉桂醛對(duì)沙門氏菌的MIC為128 μg/mL，MBC為512 μg/mL。結(jié)果表明肉桂醛具有一定的抑菌效果。

2.2 肉桂醛對(duì)鼠傷寒沙門氏菌生長(zhǎng)曲線的作用

不同濃度肉桂醛與沙門氏菌共培養(yǎng)的生長(zhǎng)曲線見圖1。培養(yǎng)6 h后細(xì)菌達(dá)到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)后期，12 h后細(xì)菌達(dá)到平臺(tái)期。與空白對(duì)照組相比，1/8MIC、1/4MIC、1/2MIC濃度的肉桂醛對(duì)沙門氏菌生長(zhǎng)沒有明顯的影響；MIC和2MIC濃度的肉桂醛在沙門氏菌生長(zhǎng)前期有抑制作用，隨著培養(yǎng)時(shí)間增加，抑制作用減弱；4MIC濃度的肉桂醛能完全抑制沙門氏菌的生長(zhǎng)。因此可以得出結(jié)論，肉桂醛屬于濃度依賴型的抗菌藥物，隨著藥物濃度升高，其抗菌效果逐漸增強(qiáng)。

2.3 肉桂醛作用于鼠傷寒沙門氏菌的SDS-PAGE分析

肉桂醛作用沙門氏菌后的蛋白質(zhì)圖譜見圖2。圖中的蛋白條帶分離良好，較清晰，條帶主要分布于20～250 ku。隨著肉桂醛濃度升高，蛋白條帶由深變淺甚至消失。結(jié)果表明肉桂醛在低于MIC的濃度下能影響沙門氏菌蛋白質(zhì)的合成，且藥物濃度越高，對(duì)蛋白質(zhì)的影響越明顯。

圖1 肉桂醛對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的生長(zhǎng)曲線Fig.1 The growth curve of cinnamaldehyde against Salmonella typhimurium

圖2 肉桂醛對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的SDS-PAGE電泳圖譜Fig.2 SDS-PAGE protein atlas of Salmonella typhimurium co-cultured with cinnamaldehyde

2.4 肉桂醛對(duì)鼠傷寒沙門氏菌形態(tài)的影響

不同濃度的肉桂醛作用于沙門氏菌后，掃描電子顯微鏡結(jié)果見圖3?？瞻讓?duì)照組（圖3A），沙門氏菌為短桿狀，細(xì)胞膜無明顯皺褶，細(xì)胞之間有絲狀蛋白質(zhì)連接。1/8MIC處理組（圖3B）中絲狀蛋白質(zhì)顯著減少，沙門氏菌細(xì)胞形態(tài)無明顯變化；1/4MIC處理組（圖3C）中沙門氏菌的細(xì)胞膜發(fā)生坍塌，細(xì)胞黏連，不能保持正常形態(tài)；1/2MIC處理組（圖3D）中沙門氏菌的結(jié)構(gòu)被破壞，細(xì)胞破碎，界限模糊，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生明顯變化。掃描電鏡結(jié)果表明肉桂醛可破壞沙門氏菌的細(xì)胞膜，影響細(xì)胞形態(tài)，且藥物濃度越高，對(duì)細(xì)菌影響越明顯。

圖3 肉桂醛對(duì)鼠傷寒沙門氏菌形態(tài)的影響Fig.3 Effect of cinnamaldehyde on morphology of Salmonella typhimurium

2.5 肉桂醛對(duì)鼠傷寒沙門氏菌細(xì)胞膜的影響

肉桂醛作用于沙門氏菌的電導(dǎo)率曲線見圖4。由圖可知，空白對(duì)照組的電導(dǎo)率變化不明顯，只有輕微的升高，可能是細(xì)菌正常的代謝過程導(dǎo)致電導(dǎo)率上升。1MIC組的電導(dǎo)率在0～30 min處與對(duì)照組上升幅度相同，在30～60 min處迅速上升，表明肉桂醛對(duì)沙門氏菌的細(xì)胞膜造成破壞，細(xì)胞膜通透性增加，引起細(xì)胞質(zhì)外泄，電導(dǎo)率升高。電導(dǎo)率曲線說明肉桂醛可能作用于沙門氏菌的細(xì)胞膜，使細(xì)胞內(nèi)容物外流，最終導(dǎo)致細(xì)菌死亡。

圖4 肉桂醛對(duì)鼠傷寒沙門氏菌電導(dǎo)率的影響（P＜0.05）Fig.4 Effect of cinnamaldehyde on conductivity of Salmonella typhimurium

圖5 肉桂醛對(duì)鼠傷寒沙門氏菌DNA外滲量的影響（P＜0.05）Fig.5 Effect of cinnamaldehyde on DNA exosmosis amount of Salmonella typhimurium

2.6 肉桂醛對(duì)鼠傷寒沙門氏菌DNA外滲量的影響

肉桂醛作用于鼠傷寒沙門氏菌后的DNA外滲量見圖5?？瞻讓?duì)照組在260 nm處的吸光光度值沒有明顯上升，MIC濃度的肉桂醛作用后，吸光光度值明顯上升，30 min后達(dá)到峰值，說明DNA外滲嚴(yán)重。結(jié)果表明，肉桂醛對(duì)細(xì)胞膜的通透性產(chǎn)生影響，引起DNA外滲，與電導(dǎo)率實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。

3 結(jié)論與討論

桂枝在傷寒病的治療中占據(jù)重要地位，而肉桂醛是桂枝的主要有效成分，因此本實(shí)驗(yàn)探究了肉桂醛對(duì)鼠傷寒沙門氏菌的體外抑菌機(jī)制。肉桂醛的MIC為128 μg/mL，MBC為512 μg/mL，在體內(nèi)幾乎不能達(dá)到有效的抑菌濃度，但是臨床上桂枝對(duì)傷寒病具有良好的治療效果，提示肉桂醛或許不是通過抑菌或殺菌來治療沙門氏菌的感染。近年來，中藥的作用機(jī)制研究越來越深入，許多研究表明中藥提取物對(duì)細(xì)菌的作用機(jī)制與傳統(tǒng)抗生素不同，中藥提取物對(duì)細(xì)菌的細(xì)胞形態(tài)、毒力因子、生長(zhǎng)代謝等具有抑制作用[15-17]。

與MIC濃度的肉桂醛共同培養(yǎng)后，沙門氏菌的細(xì)胞膜被破壞，細(xì)胞膜通透性升高，細(xì)胞內(nèi)容物外流，電導(dǎo)率和DNA滲出量上升，與對(duì)照組相比差異顯著。掃描電子顯微鏡的圖片同樣說明隨著藥物濃度升高，沙門氏菌的細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞膜受到影響。低濃度下沙門氏菌的菌體表面發(fā)生坍塌皺縮，1/2MIC組的菌體破碎、變形的現(xiàn)象最明顯。該現(xiàn)象與其他研究者的實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，可以推測(cè)肉桂醛的作用靶點(diǎn)是細(xì)胞膜，使細(xì)胞不能維持正常的生理過程，擾亂代謝途徑，進(jìn)而引起沙門氏菌死亡[18-20]。

聚丙烯酰胺凝膠的分子篩效應(yīng)可將蛋白質(zhì)分離，加入SDS后，蛋白質(zhì)的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，消除了電荷差異，因此電泳遷移率主要取決于蛋白質(zhì)或亞基的分子量大小。本實(shí)驗(yàn)取等量菌體進(jìn)行SDSPAGE，分析肉桂醛對(duì)沙門氏菌胞內(nèi)總蛋白的影響，結(jié)果顯示亞抑菌濃度的肉桂醛作用于沙門氏菌后，蛋白質(zhì)條帶變淺甚至部分條帶消失，說明肉桂醛可以抑制沙門氏菌蛋白質(zhì)的代謝。李正文[21]發(fā)現(xiàn)鹽酸小檗堿降低了豬胸膜肺炎放線菌蛋白質(zhì)表達(dá)，藥物處理后SDS-PAGE中部分條帶消失，推測(cè)鹽酸小檗堿可能作用于44.3 ku以下的蛋白質(zhì)。百里香酚作用于金黃色葡萄球菌后，菌體蛋白質(zhì)的含量顯著降低[22]。蛋白質(zhì)作為生命活動(dòng)的主要承擔(dān)者，細(xì)菌的各種生命活動(dòng)都離不開蛋白質(zhì)的參與，因此肉桂醛對(duì)蛋白質(zhì)的具體作用機(jī)制有待深入研究。

肉桂醛能抑制鼠傷寒沙門氏菌的增殖，MIC為128 μg/mL，MBC為512 μg/mL，亞抑菌濃度的肉桂醛可作用于細(xì)胞膜，破壞菌體正常形態(tài)，增加細(xì)胞膜通透性，使細(xì)胞內(nèi)容物外流，同時(shí)對(duì)菌體蛋白質(zhì)的代謝具有抑制作用。由于SDS-PAGE無法確定受到影響的蛋白質(zhì)種類，因此肉桂醛對(duì)蛋白質(zhì)的抑制機(jī)制還需要深入探究。