中藥復(fù)方提取物的抗兔球蟲效果

羅藝晨，朱買勛，林春發(fā)，劉仔睿，曹茂雨

中藥復(fù)方提取物的抗兔球蟲效果

羅藝晨1，朱買勛2*，林春發(fā)1，劉仔睿1，曹茂雨1

(1.西南大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，重慶 榮昌 402460；2.重慶市畜牧科學(xué)院，重慶 榮昌 402460)

將100只新西蘭白兔隨機分為5組，即對照組，模型組及中藥提取物高、中、低劑量組，除對照組外，試驗兔感染1×105個腸艾美耳球蟲卵囊，再分別每天灌服0、0.500、0.250、0.125 g/kg的中藥提取藥物(白頭翁、柴胡、半夏、黃芩、檳榔、甘草等組成)，每天灌服1次，連續(xù)使用3 d，給藥后連續(xù)觀察21 d，每天記錄試驗兔的死亡和血便情況，隔7 d測量試驗兔體質(zhì)量，采集糞便計數(shù)糞便卵囊數(shù)(OPG)；試驗結(jié)束后剖殺動物，觀察其盲腸病變情況。結(jié)果顯示：經(jīng)中藥提取物高劑量和中劑量治療的試驗兔存活率分別達90%和85%，感染球蟲的程度逐漸由嚴重轉(zhuǎn)為輕度，模型組和低劑量組試驗兔的存活率分別為25%和50%，且存活試驗兔大部分感染嚴重；在給藥后7、14、21 d，高劑量組和中劑量組試驗兔的體質(zhì)量顯著高于模型組的(＜0.05)，OPG極顯著低于模型組的(＜0.01)，血便記分顯著低于模型組的(＜0.05)；給藥后7、14 d，低劑量組試驗兔的OPG極顯著低于模型組的(＜0.01)；給藥后14 d，低劑量組試驗兔的體質(zhì)量顯著高于模型組的(＜0.05)；給藥后21 d，高劑量組和中劑量組試驗兔的增質(zhì)量極顯著高于模型組的(＜0.01)，顯著高于低劑量組的(＜0.05)，相對增質(zhì)量極顯著高于模型組和低劑量組的(＜0.01)，OPG極顯著低于低劑量組的(＜0.01)，血便消失。高、中、低劑量的中藥提取物組試驗兔的抗球蟲指數(shù)極顯著高于模型組的(＜0.01)，治療效果分別為高效、中效、無效?？梢?，在本研究劑量范圍內(nèi)，治療效果存在一定的量效關(guān)系，高劑量治療效果最佳。

兔；中藥復(fù)方提取物；球蟲卵囊；治療效果

兔球蟲病是由艾美耳屬的多種球蟲寄生于家兔肝膽管及腸上皮細胞內(nèi)引起的一種常見的寄生性、多發(fā)性原蟲病，臨床發(fā)病率、死亡率高，是家兔養(yǎng)殖中危害嚴重的傳染病之一。據(jù)統(tǒng)計，在規(guī)?；B(yǎng)殖場中，兔球蟲平均感染率高于70%，且多為混合感染[1–3]。感染球蟲的家兔消化系統(tǒng)會受到嚴重損傷，降低腸道對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，影響其生長性能[4]，同時還能影響動物的繁殖能力[5]。目前，兔球蟲主要以藥物防治為主，臨床中尚缺乏兔球蟲專屬的特效藥物，養(yǎng)殖者常借鑒禽抗球蟲藥物或者使用復(fù)方藥物進行防治。藥物治療對安全生產(chǎn)存在一定的風險，且易產(chǎn)生耐藥性，影響防治效果[6–7]。

臨床中，感染兔球蟲的動物，表現(xiàn)出明顯的精神沉郁、被毛松亂、食欲減退、逐漸消廋，前期出現(xiàn)咖啡色稀便，后期變?yōu)檠?，死亡率不斷提高。依?jù)中獸醫(yī)理論，該病癥屬于濕熱郁結(jié)、化熱生蟲、熱迫血行所致，應(yīng)選擇清熱燥濕、涼血解毒、殺蟲止痢的中藥進行施治。本研究中，利用中藥安全、高效、無毒的特點，在經(jīng)方的基礎(chǔ)上進行調(diào)整，從白頭翁、柴胡、半夏等中藥中提取有效成分，制備成中藥復(fù)方提取物，人工模擬球蟲感染試驗兔模型，研究中藥復(fù)方提取物對兔球蟲病的治療效果。

1　材料與方法

1.1　試驗兔

100只35日齡新西蘭白兔，雌雄各半，健康無病，體質(zhì)量0.8~1.2 kg。試驗分組前采集新鮮糞便，檢測球蟲均為陰性者才納入試驗分組。

1.2　供試球蟲

腸艾美耳球蟲()，前期從臨床中分離保存。試驗前按照1×105個/只的劑量經(jīng)口服感染40日齡的試驗兔2只，感染球蟲后第2天開始多次收集糞便檢測球蟲，在檢出有球蟲時開始大量收集新鮮糞便，分離球蟲，4 ℃保存、備用。

1.3　試驗藥物

按照4∶1∶1∶1∶1∶1的質(zhì)量比稱取中藥白頭翁(PULSATILLAE RADIX)、柴胡(BUPLEURI RADIX)、半夏(PINELLIAE RHIZOMA)、黃芩(SCUTELLARIAE RADIX)、檳榔(ARECAE SEMEN)、甘草(GLYCYRRHIZAE RADIX ET RHIZOMA)，混合后經(jīng)醇提、水提、濃縮、干燥，添加可溶性淀粉，制備成1 g中藥提取物含有1 g的原生藥。使用前將中藥復(fù)方提取物加熱水溶解，稀釋成含藥量0.500、0.250、0.125 g/mL 3個不同濃度。

1.4　動物分組及試驗設(shè)計

1) 分組及飼養(yǎng)管理。試驗采用單因子隨機區(qū)組法將100只新西蘭白兔隨機分為5組，分別為對照組，模型組和中藥提取物高、中、低劑量組。每組2個重復(fù)，每個重復(fù)10只，共20只。每組試驗兔采用單籠飼養(yǎng)，按照正常免疫程序進行疫苗接種，飼喂不含抗生素和抗球蟲藥的基礎(chǔ)日糧，自由飲水和采食。每組試驗兔單獨隔離飼養(yǎng)，飼養(yǎng)模式和飼養(yǎng)環(huán)境一致。試驗期間觀察試驗兔只健康狀況，包括精神狀態(tài)、糞便性狀、飲食等。

2) 攻蟲。將臨床分離的球蟲進行計數(shù)，用0.9%氯化鈉溶液將球蟲卵囊稀釋至10 000個/mL，參照文獻[8]，每只試驗兔攻球蟲5.0 mL，連續(xù)攻蟲2 d，每天上午采集糞便并清洗糞槽。攻蟲48 h后，根據(jù)動物球蟲診斷技術(shù)國家標準(GB/T 18647—2002)，采集兔糞，計數(shù)糞便卵囊數(shù)(oocysts per gram of feces，OPG)，判定攻蟲后球蟲的感染程度：OPG＞1×105為嚴重感染；1×104≤OPG≤1×105為中度感染；OPG＜1×104，為輕度感染。

3) 給藥。試驗兔攻蟲2 d后，確定攻蟲成功者，模型組灌服0.9%氯化鈉溶液，中藥提取物高、中、低劑量組試驗兔分別按照1 mL/kg體質(zhì)量灌服0.500、0.250、0.125 g/mL的藥液，每天灌服1次，連續(xù)灌服3 d。灌服后連續(xù)觀察21 d。

1.5　項目測定

1) 存活率計算。在整個試驗期間，觀察試驗兔的臨床變化，稱體質(zhì)量，體質(zhì)量下降25%的已經(jīng)失去臨床治療價值，視為無效動物，并統(tǒng)計每天試驗兔的死亡情況，計算每組試驗兔的存活率()。

式中：為試驗動物數(shù)；為死亡動物數(shù)；1為體重下降25%的動物數(shù)。

2) 體質(zhì)量測定。在給藥前和給藥后7、14、21 d，分別稱試驗兔的體質(zhì)量，比較藥物治療后試驗兔的體質(zhì)量變化。計算試驗兔的相對增質(zhì)量率(W)。

式中：W為感染組的平均增質(zhì)量；W為對照組平均增質(zhì)量。

3) 血便觀察。在開始給藥后連續(xù)觀察試驗兔的血便現(xiàn)象，若直接眼觀不能判斷是否有血便，則采用膠體金試劑盒檢測糞便中是否有隱血。有血便視為陽性者，無血便視為陰性者。參照文獻[9]的方法，統(tǒng)計每組試驗兔的血便占比情況(bloody stool ratio，bs)，若bs=0，則記0分；0＜bs≤25%，記1分；25%＜bs≤50%，記2分；50＜bs≤75%，記3分；75＜bs≤100%，記4分。

4) 盲腸病變觀察。在試驗結(jié)束后，剖殺試驗兔，觀察盲腸病變情況。參照文獻[10]的方法，進行盲腸病變記分，盲腸未見病變，記0分；盲腸黏膜增厚，有極少量的點狀出血，記1分；盲腸黏膜增厚，有明顯出血和出血斑，記2分；盲腸內(nèi)有大量的出血，盲腸壁肥厚且有明顯的變形和萎縮，記3分；盲腸顯著萎縮，病變直達腸部，腸壁極度肥厚，記4分；試驗期間因球蟲死亡兔，記4分。

式中：V為病變值；S為全組病變記分之和；1為全組觀察動物數(shù)。

5) 卵囊值計算。在試驗結(jié)束后，剖殺試驗兔，采集盲腸糞便4~5 g，參照GB/T 18647—2002進行球蟲卵囊計數(shù)，并計算卵囊值。OPG＜1.0×103時，卵囊值為0；1.0×103≤OPG＜1.0×104時，卵囊值為5；1.0×104≤OPG＜2.0×104時，卵囊值為10；2.0×104≤OPG＜6.0×104時，卵囊值為20；6.0×104≤OPG＜1.1×105時，卵囊值為30；OPG≥1.1×105時，卵囊值為40[10]。

1.6　療效判定

結(jié)合試驗動物的存活率、相對增重率、血便情況、盲腸病變情況，若抗球蟲指數(shù)(anticoccidial index，ACI)≥180，抗球蟲高效；160≤ACI＜180，抗球蟲中效；120≤ACI＜160，抗球蟲低效；ACI＜120，抗球蟲無效[11]。

ACI=(W+)–(V+OPG)。

1.7　數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

采用SPSS 20.0中GLM模塊進行試驗數(shù)據(jù)方差分析；組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義時，采用Duncan’s法進行多重比較。

2　結(jié)果與分析

2.1　試驗兔攻蟲效果

由表1可知，各組試驗兔在攻蟲后OPG差異無統(tǒng)計學(xué)意義(＞0.05)，OPG為8.71×103~ 1.54×105，平均值大于1×105，92.5%的試驗兔處于中度和嚴重感染球蟲的狀態(tài)，說明試驗攻蟲成功。

表1　試驗兔攻蟲后感染程度

2.2　試驗兔感染程度分析

由表2可知，在試驗過程中，對照組的試驗兔均未檢測到球蟲，說明對照成立。模型組和低劑量組試驗兔的存活率分別為25%和50%，給藥后21 d，模型組無輕度和中度感染的試驗兔，低劑量組感染輕度和中度感染的試驗兔分別為1只和2只；經(jīng)中藥提取物高劑量和中劑量治療的試驗兔存活率分別達90%和85%，且感染球蟲的程度逐漸由嚴重轉(zhuǎn)為輕度，表明高劑量和中劑量的中藥提取物可以有效的驅(qū)除兔腸艾美耳球蟲。

表2　試驗兔的感染程度

2.3　試驗兔的體質(zhì)量變化

由表3可知，給藥后0 d，模型組和低劑量組試驗兔的體質(zhì)量有下降的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(＞0.05)；模型組試驗兔在給藥后14 d前體質(zhì)量有下降的趨勢，給藥后21 d，體質(zhì)量有所升高，但其增質(zhì)量只有0.05 kg；治療組試驗兔的體質(zhì)量逐漸升高，在給藥后7 d和21 d，高劑量組和中劑量組試驗兔的體質(zhì)量顯著高于模型組的(＜0.05)；給藥后14 d，3個劑量組試驗兔的體質(zhì)量均顯著高于模型組的(＜0.05)。在試驗結(jié)束后，3個治療組試驗兔增質(zhì)量和相對增質(zhì)量均極顯著高于模型組的(＜0.01)，高劑量組和中劑量組增質(zhì)量顯著高于低劑量組的(＜0.05)，相對增質(zhì)量極顯著高于低劑量組的(＜0.01)。

表3　試驗兔的體質(zhì)量

同列不同大寫字母示組間差異極顯著(＜0.01)；不同小寫字母示組間差異顯著(＜0.05)。

2.4　試驗兔的卵囊值變化

由表4可知，在給藥后7、14 d，3個劑量組試驗兔的OPG均極顯著低于模型組的(＜0.01)，且在給藥后14 d，高劑量組和中劑量組的OPG極顯著低于低劑量組的(＜0.01)；給藥后21 d，高劑量組和中劑量組的OPG極顯著低于模型組和低劑量組的(＜0.01)；高劑量組和中劑量組卵囊值極顯著低于模型組的(＜0.01)，顯著低于低劑量組的(＜0.05)；給藥后14、21 d，高劑量組、中劑量組和對照組的OPG和卵囊值間的差異無統(tǒng)計學(xué)意義。說明中藥提取物高劑量和中劑量可以有效驅(qū)除球蟲卵囊。

表4　治療后試驗兔的OPG

同列不同大寫字母示組間差異極顯著(＜0.01)；不同小寫字母示組間差異顯著(＜0.05)。

2.5　試驗兔的血便情況

由表5可知，對照組試驗兔未出現(xiàn)血便現(xiàn)象；給藥前各組試驗兔均出現(xiàn)血便，但血便記分值間差異無統(tǒng)計學(xué)意義(＞0.05)；給藥后7、14、21 d，高劑量組和中劑量組試驗兔的血便記分值均顯著低于模型組和低劑量組的(＜0.05)，其中在給藥后21 d，高劑量組和中劑量組試驗兔無血便現(xiàn)象，且治療后均值顯著低于模型組(＜0.05)。

表5　試驗兔的血便記分

不同小寫字母示組間差異顯著(＜0.05)。

2.6　中藥復(fù)方提取物對兔球蟲的治療效果

由表6可知，給藥后，3個劑量組的病變值極顯著低于模型組(＜0.01)，說明3個劑量的中藥提取物均能有效促進組織的修復(fù)。綜合試驗兔的存活率、相對增質(zhì)量值、OPG數(shù)和病變值，3個劑量的中藥提取物組的ACI值均極顯著高于模型組的(＜0.01)，高劑量組和中劑量組的ACI值極顯著高于低劑量組的(＜0.01)；高、中、低劑量組的治療效果分別為高效、中效、無效。表明中藥提取物治療兔球蟲的效果存在一定的量效關(guān)系，且高劑量的治療效果最好。

表6　治療后試驗兔的病變值及療效

同列不同大寫字母示組間差異極顯著(＜0.01)。

3　結(jié)論與討論

本研究中，通過灌服球蟲卵囊，建立兔球蟲感染試驗動物模型，OPG為8.71×103~1.54×105，平均值大于1×105，此時球蟲能在試驗兔腸道內(nèi)大量繁殖，92.5%的試驗兔處于中度和嚴重感染球蟲的狀態(tài)，這與景瑾等[12]報道的結(jié)果一致，說明試驗攻蟲是成功的。試驗過程中，模型組試驗兔在前2個時間段內(nèi)體質(zhì)量持續(xù)降低，OPG和血便記分均升高，而在最后一個時間段內(nèi)，模型組的試驗兔體質(zhì)量有所提高，OPG和血便記分反而降低，其原因可能是試驗兔在試驗過程中出現(xiàn)大量的死亡，導(dǎo)致統(tǒng)計過程中的值出現(xiàn)非規(guī)律性變化，但符合試驗規(guī)律，模型組對照是成功的。

球蟲在持續(xù)感染兔的過程中，大量的球蟲在腸道內(nèi)寄生，損害了腸道組織結(jié)構(gòu)，致使動物在感染3 d后開始死亡，之后會大量的排出卵囊，造成球蟲在飼養(yǎng)環(huán)境中的大量污染，進而造成養(yǎng)兔場球蟲病的暴發(fā)。中藥復(fù)方提取物要達到較好的治療效果，不僅要求中藥具有驅(qū)除球蟲的效果，還要能有效修復(fù)動物的組織結(jié)構(gòu)，減少由球蟲帶來的損害。本研究中，用中藥提取物對感染球蟲的試驗兔進行治療，中藥提取物高劑量和中劑量組試驗兔的存活率分別達90%、85%，并且存活的試驗兔感染球蟲程度為輕度(OPG＜1×104)，表明中藥復(fù)方提取物能驅(qū)除球蟲，減少因球蟲引起的死亡，提高存活率。在試驗結(jié)束的時，與模型組相比，高劑量組和中劑量組試驗兔的相對增質(zhì)量極顯著提高(＜0.01)，卵囊值極顯著降低(＜0.01)，血便情況消失，病變值極顯著降低(＜0.01)，表明中藥復(fù)方提取物在綜合治療兔蟲病中有明顯的效果。綜合考量動物的存活率、相對增質(zhì)量、球蟲卵囊數(shù)、病變值等評價抗球蟲效果的主要指標，灌服0.500、0.250 g/mL的中藥提取物，抗兔球蟲效果分別為高效和中效；灌服0.125 g/mL的劑量的治療效果為無效。說明在本研究劑量范圍內(nèi)，治療效果存在一定的量效關(guān)系，高劑量療效最佳。

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Resistance effects of traditional Chinese medicine compound extract on the rabbit coccidian

LUO Yichen1, ZHU Maixun2*, LIN Chunfa1, LIU Zirui1, CAO Maoyu1

(1.College of Animal Science, Southwest University, Rongchang, Chongqing 402460, China; 2.Chongqing Academy of Animal Sciences, Rongchang, Chongqing 402460, China)

In the study, 100 New Zealand white rabbits were randomly grouped into 5 groups, control group, model group, Chinese herb extracts treated high, medium and low dose group. Except the control group, each group of experimental rabbits infected 1×105eggs ofintestinalis were treated with 0, 0.500, 0.250, 0.125 g/kg traditional Chinese medicine compound extract(composed of PULSATILLAE RADIX, BUPLEURI RADIX, PINELLIAE RHIZOMA, SCUTELLARIAE RADIX, ARECAE SEMEN and GLYCYRRHIZAE RADIX ET RHIZOMA) for 3 d with once per day, and 21 d continuous observation after the treatment. The observation included the every day deaths and bloody stool, the every 7 d body mass and collected dung as OPG, the caecal lesions of rabbits by dissection at the end of the test. The results showed that the survival rate of experimental rabbits treated with high-dose and medium-dose traditional Chinese medicine compound extract reached 90% and 85%, and the degree of coccidiosis infection gradually changed from severe to mild. While, the model group and low-dose group was at 25% and 50%, and most of the survival experimental rabbits were seriously infected. At 7, 14, and 21 d after the administration, the body weight of the experimental rabbits in the high-dose and middle-dose groups were significantly higher than the model group(＜0.05), the OPG was significantly lower than the model group(＜0.01), and the blood stool score was significantly lower than model group(＜0.05). At the 7 d administration, only the OPG of the experimental rabbits in low-dose group was significantly lower than the model group(＜0.01). At the 14 d administration, the body weight of the experimental rabbits in low-dose group was significantly higher than the model group(＜0.05), the OPG was significantly lower than the model group(＜0.01). At the 21 d administration, the body weight of the experimental rabbits in the high-dose and middle-dose groups were significantly higher than the model group(＜0.01) and significantly lower than the low-dose group(＜0.01), relative mass gain was significantly higher than the model group and low-dose group(<0.01), the OPG was significantly lower than the model group and low-dose group(＜0.01), and blood disappeared. In addition, the ACI value of the high, middle and low-dose group were significantly higher than that of the model group(＜0.01), and the treatment effects were high, medium, and ineffective. These results indicated that the traditional Chinese medicine compound extract had a good therapeutic effect on coccidian, and the higher dose treatment has the better effect.

rabbit; traditional Chinese medicine compound extract; coccidial oocyst; treatment effect

10.13,331/j.cnki.jhau.2020.01.014

S858.291；R285.5

A

1007-1032(2020)01-0093-06

2019–03–04

2019–05–05

重慶市科研機構(gòu)績效激勵引導(dǎo)專項(cstc2018jxjl80039)

羅藝晨(1981—)，女，重慶合川人，碩士，實驗師，主要從事中獸藥研發(fā)與藥理毒理學(xué)研究，luojia_1016@163.com；*

，朱買勛，助理研究員，主要從事中獸藥研發(fā)與藥理毒理學(xué)研究，zmxmz0817@163.com

羅藝晨，朱買勛，林春發(fā)，劉仔睿，曹茂雨．中藥復(fù)方提取物的抗兔球蟲效果[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)版)，2020，46(1)：93–98．

LUO Y C, ZHU M X, LIN C F, LIU Z R, CAO M Y. Resistance effects of traditional Chinese medicine compound extract on the rabbit coccidian[J]．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences), 2020, 46(1): 93–98.

http://xb.hunau.edu.cn

責任編輯：鄒慧玲

英文編輯：柳正