玉米瘤黑粉菌SG200效應(yīng)蛋白PEP1表達(dá)及生物信息學(xué)分析

劉云云，李智敏，程毅，余永廷，陳佳，嚴(yán)準(zhǔn)

玉米瘤黑粉菌SG200效應(yīng)蛋白PEP1表達(dá)及生物信息學(xué)分析

劉云云，李智敏，程毅，余永廷，陳佳，嚴(yán)準(zhǔn)*

(中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所，湖南 長(zhǎng)沙 410205)

運(yùn)用生物信息學(xué)手段分析基因結(jié)構(gòu)，并根據(jù)GenBank中玉米瘤黑粉菌DNA序列設(shè)計(jì)引物，從玉米瘤黑粉菌SG200的基因組中擴(kuò)增得到了基因全長(zhǎng)，構(gòu)建了pET–28a–重組表達(dá)質(zhì)粒，選用大腸埃希菌BL21(DE3)作為宿主菌，以1 mmol/L IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。SDS–PAGE檢測(cè)結(jié)果表明，誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物大小與理論值(20 800)一致，說(shuō)明pET–28a–能夠在大腸埃希菌BL21(DE3)中高效表達(dá)。

玉米瘤黑粉菌；SG200菌株；效應(yīng)蛋白PEP1；生物信息學(xué)分析

玉米瘤黑粉菌()是引發(fā)玉米瘤黑粉病的病原真菌，屬于擔(dān)子菌門(mén)、黑粉菌目[1]。玉米黑粉菌能夠侵染植株的各個(gè)部位，引起植株感病，一旦大面積發(fā)病就會(huì)引起玉米大量減產(chǎn)，造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]；因此，對(duì)玉米瘤黑粉菌的研究具有重要意義。玉米瘤黑粉菌的基因組在2006年被測(cè)序[3]，本研究中的基因位于玉米黑粉菌的3號(hào)染色體上，PEP1蛋白由178個(gè)氨基酸組成，經(jīng)預(yù)測(cè)，N端1～26個(gè)氨基酸肽段為分泌信號(hào)肽[4]。PEP1是玉米瘤黑粉菌分泌的一種效應(yīng)蛋白[5]，當(dāng)被刪除后，玉米瘤黑粉菌無(wú)法入侵植物細(xì)胞，也無(wú)法與宿主建立兼容的相互關(guān)系[6]。本試驗(yàn)中，在玉米瘤黑粉菌SG200中克隆了基因，與pET–28a連接，探索其在大腸埃希菌中是否高效表達(dá)，旨為進(jìn)一步研究玉米瘤黑粉菌基因與其他因子的互作關(guān)系，尋求防治玉米瘤黑粉病的新方法提供依據(jù)。

1　材料與方法

1.1　材料

1.1.1菌種與質(zhì)粒

玉米瘤黑粉菌() SG200、載體pET–28a由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所南方經(jīng)濟(jì)作物保護(hù)實(shí)驗(yàn)室保藏；大腸埃希菌DH5α、大腸埃希菌BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京博邁德基因技術(shù)有限公司。

1.1.2酶類與主要試劑

T4連接酶、限制性內(nèi)切酶HⅠ和d Ⅲ均購(gòu)自Thermo Fisher Scientific；PCR Mix、DNA Maker(DL5000)、DNA提取試劑盒由康為世紀(jì)生物科技公司提供；質(zhì)粒提取試劑盒由Promega提供；DNA膠回收試劑盒購(gòu)自O(shè)MEGA。蛋白粗提用溶液：1) Buffer A：0.05 mol/L Tris–HCl、0.15 mol/L NaCl、pH 7.5；2) Buffer B：Buffer A 中添加0.5% Triton X–100、0.5 mol/L urea；3) Buffer C：Buffer A 中添加0.5% Triton X–100；4) Buffer D：8 mol/L urea、100 mmol/L NaH2PO4、100 mmol/L Tris–HCl， pH調(diào)至8.0。以上溶液均用純水配置，0.45 μm濾膜過(guò)濾除菌。

1.2　方法

1.2.1引物設(shè)計(jì)與合成

根據(jù)GenBank中玉米瘤黑粉菌DNA序列(Accession XM_011389599.1)，利用Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)上游引物(5–CGGATGCTGCGGG TGCGGTA–3)和下游引物(5–CCCCATG CCAAACATGCTACCGATT–3)，正向和反向引物分別包含HⅠ和d Ⅲ酶切位點(diǎn)(下劃線標(biāo)出)。pET–28a載體測(cè)序引物為T(mén)7(5–TAATACGAC TCACTATAGGG–3)和T7t(5–GCTAGTTATTGCTC AGCGG–3)。引物均由北京擎科生物公司合成。

1.2.2玉米瘤黑粉菌基因克隆

玉米瘤黑粉菌SG200基因組DNA的提取按照真菌DNA提取試劑盒的說(shuō)明進(jìn)行。以玉米瘤黑粉菌SG200基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增基因。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性2 min；94 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸5 min。擴(kuò)增產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)后切膠，回收純化。將純化后的基因片段送擎科生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中玉米瘤黑粉菌DNA序列(Accession XM_0113895 99.1)完全一致。

1.2.3玉米瘤黑粉菌PEP1的生物信息學(xué)分析

為進(jìn)一步分析PEP1的功能與結(jié)構(gòu)的關(guān)系，通過(guò)以下幾種在線工具對(duì)PEP1的理化性質(zhì)及二級(jí)、三級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。利用SignalP 4.1 Server (http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)預(yù)測(cè)PEP1是否存在信號(hào)肽；運(yùn)用ProtParam在線工具(https:// web.expasy.org/protparam/)預(yù)測(cè)PEP1編碼蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)；利用 Protscale (http://web.expasy.org/ protscale) 在線軟件對(duì)PEP1進(jìn)行親水性/疏水性分析；利用Psipred (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；運(yùn)用swiss–model (https:// swissmodel.expasy.org)進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)[7]。

1.2.4重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

將重組質(zhì)粒與純化后的DNA片段用HⅠ和d Ⅲ進(jìn)行雙酶切(37 ℃水浴10 min，80 ℃ 水浴5 min)。酶切產(chǎn)物純化回收后，將片段和載體連接(16 ℃金屬浴，過(guò)夜)，將連接產(chǎn)物用熱激法轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，利用LB加卡那霉素(100 μg/mL)篩選陽(yáng)性克隆。挑取陽(yáng)性菌落，提取重組質(zhì)粒，進(jìn)行HⅠ和d Ⅲ雙酶切鑒定，送擎科生物公司測(cè)序。將雙酶切鑒定結(jié)果與測(cè)序結(jié)果正確的重組載體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸埃希菌BL21(DE3)。

1.2.5蛋白質(zhì)誘導(dǎo)表達(dá)與檢測(cè)

挑取重組菌株單菌落置于含有卡那霉素的1 mL LB培養(yǎng)基中，37 ℃搖床，225 r/min培養(yǎng)4 h，將1 mL菌液接種于10 mL 含有卡那霉素的LB培養(yǎng)基，37 ℃搖床，225 r/min培養(yǎng)至600達(dá)0.6，再加入10 μL 1 mol/L IPTG，使培養(yǎng)基中IPTG的終濃度為1 mmol/L，30 ℃、180 r/min誘導(dǎo)3 h。

以宿主菌BL21(DE3)和含有空載體pET–28a的重組BL21(DE3)菌株作為陰性對(duì)照，以含有pET–28a–表達(dá)載體的重組BL21(DE3)菌株為陽(yáng)性對(duì)照。1E08是1個(gè)小分子抗體[8]，在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院麻類研究所南方經(jīng)濟(jì)作物保護(hù)實(shí)驗(yàn)室中已被熟練誘導(dǎo)表達(dá)；因此將它作為pET–28a–/BL21表達(dá)的陽(yáng)性對(duì)照。取上述誘導(dǎo)后的10 mL菌液離心(12 000 r/min，5 min)，收集菌體。用化學(xué)滲透法破碎細(xì)胞[9]，具體步驟如下：用10 mL Buffer A重懸菌體，離心30 min(8 000 r/min)，收集沉淀；加1 mL Buffer C重懸后，28 ℃靜置過(guò)夜，離心30 min(8 000 r/min)，收集沉淀；加1 mL Buffer B洗2次，Buffer A洗1次，加1 mL Buffer D溶解沉淀，即獲得蛋白質(zhì)粗提取液；取6 μL 5×上樣緩沖液與24 μL蛋白粗提取液混勻，沸水浴10 min；取上述處理好的蛋白粗提液20 μL于 15%的聚丙烯酰胺變性膠中，進(jìn)行電泳檢測(cè)。

2　結(jié)果與分析

2.1　玉米瘤黑粉菌pep1基因克隆

以玉米瘤黑粉菌SG200基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增基因，片段大小為456 bp(去除信號(hào)肽后)，如圖1。

M為DNA分子量大小標(biāo)記；泳道1為pep1基因。

2.2　玉米瘤黑粉菌pep1的生物信息學(xué)分析

對(duì)基因序列進(jìn)行信號(hào)肽分析，結(jié)果(圖2)顯示，編碼的氨基酸在第26個(gè)氨基酸處值、值和值達(dá)到最高峰，分別為0.710、0.984和0.812，預(yù)測(cè)此處為信號(hào)肽剪切位點(diǎn)。第1～26個(gè)氨基酸平均值為0.930，值為0.876，預(yù)測(cè)第1～26個(gè)氨基酸為信號(hào)肽。對(duì)PEP1進(jìn)行理化性質(zhì)分析，發(fā)現(xiàn)編碼的氨基酸為178個(gè)，相對(duì)分子質(zhì)量為18 444.72，理論等電點(diǎn)為5.45。在組成蛋白質(zhì)的20種氨基酸中，甘氨酸(Gly)所占比例最高，為11.2%，其中帶有負(fù)電荷的氨基酸多于帶有正電荷的氨基酸，蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定系數(shù)為28.25，屬于穩(wěn)定蛋白。PEP1在蛋白的中心部分含有4個(gè)保守的半胱氨酸殘基(第5、75、94、112位)，猜測(cè)PEP1蛋白中間部分的4個(gè)半胱氨酸可能通過(guò)參與二硫橋的形成來(lái)影響PEP1的功能。親水性/疏水性分析發(fā)現(xiàn)，整條肽鏈的親水性氨基酸數(shù)量多于疏水性氨基酸數(shù)量(圖3)，推測(cè)PEP1是親水性蛋白。利用Psipred在線工具對(duì)PEP1進(jìn)行了二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)，無(wú)規(guī)則卷曲比例為64.61%，α螺旋和β折疊分別為20.22%和15.17%，如圖4所示；利用swiss–model預(yù)測(cè)其三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖5所示。模型中顯示2個(gè)雙鏈反平行的β–sheets，與纖維連接蛋白糖基化第二型模塊相似[10]，推測(cè)可能與蛋白糖基化相關(guān)。

圖2 玉米瘤黑粉菌SG200 PEP1信號(hào)肽分析結(jié)果

圖3 玉米瘤黑粉菌SG200 PEP1疏水性分析結(jié)果

圖4 玉米瘤黑粉菌SG200 PEP1二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

圖5　玉米瘤黑粉菌SG200 PEP1三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果

2.3　pET–28a–pep1原核表達(dá)載體的構(gòu)建

將基因片段與載體pET–28a用相同的HⅠ和d Ⅲ內(nèi)切酶雙酶切后，連接轉(zhuǎn)化大腸埃希菌DH5α，挑取單菌落，用載體測(cè)序引物進(jìn)行PCR鑒定，大小符合預(yù)期之后，交由生物公司測(cè)序，測(cè)序結(jié)果與GenBank中玉米瘤黑粉菌DNA序列(Accession No.Um01987 )結(jié)果完全一致。選取測(cè)序結(jié)果正確的重組菌株，提取質(zhì)粒，進(jìn)行HⅠ和d Ⅲ內(nèi)切酶雙酶切鑒定，鑒定結(jié)果(圖6)符合預(yù)期，表明重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。將構(gòu)建成功的pET–28a–轉(zhuǎn)化至大腸埃希菌BL21(DE3)中，通過(guò)抗性平板篩選與PCR鑒定，成功構(gòu)建了原核表達(dá)系統(tǒng)。

M為DNA分子量大小標(biāo)記；泳道1為重組質(zhì)粒pET–28a– pep1Bam HⅠ、Hind Ⅲ雙酶切結(jié)果；泳道2為質(zhì)粒pET–28a Bam HⅠ、Hind Ⅲ雙酶切結(jié)果。

2.4　pep1基因的誘導(dǎo)表達(dá)及純化

通過(guò)ProtParam在線工具預(yù)測(cè)插入載體后組氨酸標(biāo)簽融合蛋白大小為20 800。以BL21(DE3)菌株和重組菌株pET–28a/BL21為陰性對(duì)照，重組菌株pET–28a–/BL21為陽(yáng)性對(duì)照誘導(dǎo)表達(dá)。利用化學(xué)滲透法破碎細(xì)胞，進(jìn)行SDS–PAGE檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)重組表達(dá)質(zhì)粒pET–28a–在15 000～25 000有明顯的表達(dá)帶，與預(yù)測(cè)的融合蛋白大小(20 800)大小相符，如圖7所示，說(shuō)明重組表達(dá)質(zhì)粒pET–28a–能夠在BL21(DE3)中表達(dá)。

M示DNA分子量大小標(biāo)記；泳道1為誘導(dǎo)后大腸埃希菌BL21(DE3)；泳道2為誘導(dǎo)后重組菌株pET–28a/BL21；泳道3為誘導(dǎo)后重組菌株pET–28a–1E08/BL21(陽(yáng)性對(duì)照)；泳道4為誘導(dǎo)后重組菌株 pET–28a–pep1/BL21。

3　結(jié)論與討論

玉米瘤黑粉菌在玉米上的寄生過(guò)程可人為地分為7個(gè)步驟：1)形成致病性雙核菌絲體；2)附著于植物表面；3)穿透寄主表皮；4)消減寄主防御反應(yīng)；5)寄主體內(nèi)菌絲增殖；6)使寄主瘤變；7)生成雙倍體冬孢子[11]?；騾⑴c了其中穿透寄主表皮和消減寄主防御反應(yīng)2個(gè)過(guò)程。基因的缺失可顯著降低病菌侵染率，減輕玉米病害[12–14]。鑒于基因的重要生物學(xué)作用，理論上PEP1效應(yīng)子可作為防控玉米瘤黑粉病的關(guān)鍵靶標(biāo)。

本試驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建原核表達(dá)載體pET–28a–后，在大腸埃希菌BL21(DE3)中誘導(dǎo)表達(dá)，方法如下：將重組菌株單菌落置于含有卡那霉素的1 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床，225 r/min培養(yǎng)4 h之后，取上述菌液1 mL接種于10 mL 含有卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃搖床，225 r/min培養(yǎng)至菌液濃度600達(dá)0.6，再加入10 μL 1 mol/L IPTG，使培養(yǎng)基中IPTG的終濃度為1mmol/L，混勻后置于30 ℃搖床中，180 r/min培養(yǎng)，誘導(dǎo)3 h。利用化學(xué)方法破碎細(xì)胞之后進(jìn)行SDS–PAGE檢測(cè)，得到PEP1的特異條帶，大小(20 800)符合預(yù)期，表明能夠利用原核表達(dá)實(shí)現(xiàn)對(duì)玉米瘤黑粉菌PEP1蛋白的高效表達(dá)。

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Expression and bioinformatics analysis of effector protein PEP1 fromSG200

LIU Yunyun, LI Zhimin, CHENG Yi, YU Yongting, CHEN Jia, YAN Zhun*

(Institute of Bast Fiber Crops, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Changsha, Hunan 410205, China)

PEP1 protein is one of the effector proteins of the. The study of PEP1 protein plays an important role for the new method development to combat the corn smut. In this study, the structure ofgene was expressed, the resulting proteins were purified and analyzed by bioinformatics method. The recombinant expression plasmid pET-28a-was constructed, andBL21 (DE3) was used as a host strain and induced with 1 mmol/L IPTG. The results of SDS-PAGE showed that the size of the induced expression product PEP1 was consistent with the theoretical value (20 800), indicating that pET-28a-is a capable strain to highly express the target protein inBL21 (DE3).

; SG200 strain; effector protein PEP1; bioinformatics analysis

10.13331/j.cnki.jhau.2020.01.005

Q786

A

1007-1032(2020)01-0028-05

2018–11–19

2019–02–15

湖南省重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃項(xiàng)目(2016WK2030)；中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院科技創(chuàng)新工程項(xiàng)目(CAAS–ASTIP–2015–IBFC09)

劉云云(1993—)，女，河南信陽(yáng)人，碩士研究生，主要從事微生物分子生物學(xué)與基因工程研究，m18503765307@163.com；

，嚴(yán)準(zhǔn)，研究員，主要從事病原菌納米抗體研發(fā)及其病害診斷和防治研究，yanzhuntoronto@gmail.com

劉云云，李智敏，程毅，余永廷，陳佳，嚴(yán)準(zhǔn)．玉米瘤黑粉菌SG200效應(yīng)蛋白PEP1表達(dá)及生物信息學(xué)分析[J]．湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2020，46(1)：28–32．

LIU Y Y, LI Z M, CHENG Y, YU Y T, CHEN J, YAN Z. Expression and bioinformatics analysis of effector protein PEP1 fromSG200[J]．Journal of Hunan Agricultural University(Natural Sciences), 2020, 46(1): 28–32.

http://xb.hunau.edu.cn

責(zé)任編輯：毛友純

英文編輯：柳正