丹參提取物對腦外傷模型大鼠腦神經(jīng)元SIRT1-FoxO1-自噬通路的影響

應(yīng) 勇 柳慧金

腦外傷是一種由各種外力導(dǎo)致腦組織損傷的疾病。中藥在治療腦卒中及神經(jīng)退行性疾病中占有重要地位。研究表明，丹酚酸B 或總丹酚酸A 可以改善腦缺血再灌注損傷小鼠的學(xué)習(xí)記憶障礙情況，對神經(jīng)組織損傷有保護(hù)作用[1-2]。白藜蘆醇[3]、姜黃素[4]等中藥成分通過調(diào)節(jié)沉默信息調(diào)節(jié)因子1（silent information regulatorprotein，SIRT1）-叉頭框蛋白O1（fork-head box O1，F(xiàn)oxO1）-自噬通路改善腦缺血損傷狀況。本研究以SD 大鼠為對象制備腦外傷模型，向其腹腔注射丹參提取物（Salvia Miltiorr-hiza Extract，SME）或SIRT1 抑制劑（selisistat，EX-527）進(jìn)行交叉實驗，通過觀察大鼠腦神經(jīng)元損傷情況及SIRT1、FoxO1 的mRNA 和蛋白表達(dá)的影響，探討SME 影響SIRT1-FoxO1-自噬通路改善大鼠腦外傷的可能機(jī)制。

1 實驗材料

1.1 動 物 SPF 清潔級SD 大鼠78 只，雌雄各半，購自東南大學(xué)實驗動物中心，實驗動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（蘇）2017-0003，實驗動物使用許可證號：SYXK（蘇）2017-0041，動物質(zhì)量合格證號：20180114，10 周齡，體質(zhì)量為（220±20）g，12h/12h（白光/紅光）下飼養(yǎng)，溫度為（24±2）℃，相對濕度范圍為37%～46%，自由飲食、飲水，定期更換墊料、飼料，經(jīng)常清理、更換鼠箱，保持環(huán)境清潔、安靜、通風(fēng)良好。本動物實驗經(jīng)浙江省臺州市第一人民醫(yī)院倫理委員會審核，批文號：（倫審）2018-0004 號。

1.2 藥物制備 丹參來自我院中藥房（采購自亳州市譙城區(qū)眾營種植專業(yè)合作社），經(jīng)藥劑科梁震野副主任藥師鑒定后為正品。丹參藥材粉碎呈粗粉后，加入75%乙醇加熱回流提取5 次，定量濾紙過濾，合并濾液后常壓蒸餾濃縮獲得濃膏，再將濃膏在烘箱中90℃干燥，粉碎后獲得SME。高效液相色譜測定所得SME 中丹參素平均含量為0.63mg/g。

1.3 主要試劑及儀器 超特敏電化學(xué)發(fā)光（ECL）試劑盒、尼氏焦油紫染液（上海碧云天生物技術(shù)有限公司，批號P0018AS、C0117）；兔抗SIRT1 多克隆抗體（美國圣克魯斯生物技術(shù)，批號sc-15404）；兔抗Fox-O1 多克隆抗體（德國默克生命科學(xué)有限公司，批號SAB3500507）；兔抗β-actin 多克隆抗體、HRP 標(biāo)記羊抗兔IgG（英國abcam 公司，批號ab1801、ab5851）；DAB 顯色試劑盒（北京索萊寶科技有限公司，批號DA1010）；TRIzol 試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司，批號15596018）；cDNA 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（天根生化科技有限公司，批號KR202）；ECL 顯色試劑盒（上海翊圣生物科技有限公司，批號36208ES60）；冰凍切片機(jī)（德國徠卡公司，型號：CM1950）；倒置熒光顯微鏡（日本奧林巴斯公司，型號：IX73）；RT-PCR儀（瑞士羅氏公司，型號：LightCycler 96）。

2 實驗方法

2.1 動物分組 將SD 大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組、模型組、SME 低、中、高劑量組和抑制劑組，每組13 只。

2.2 建模及給藥 參照改良Feeney 法[5]進(jìn)行建模，使用自制的自由落體打擊器進(jìn)行實驗。打擊器下方為大鼠頭部固定裝置，大鼠端腦正上方懸置金屬套管，套管上端固定打擊物，設(shè)置固定高度為30cm。向腹腔注射2%戊巴比妥鈉（40mg/kg）對大鼠進(jìn)行麻醉。完全麻醉后通過咬桿和耳桿將大鼠頭部固定在自制打擊器平臺上，剪去頭皮，用顱骨鉆打開右側(cè)顱骨，用2 號針頭挑出硬腦膜，不挑開軟腦膜。充分暴露腦組織，使用套管下端靠近暴露的腦組織，釋放的打擊物通過套管到達(dá)大鼠端腦軟組織，從而導(dǎo)致右側(cè)大腦半球局部腦挫裂傷。假手術(shù)組僅開天窗不實施打擊。動物造模成功后，假手術(shù)組和模型組大鼠腹腔注射生理鹽水2mL；SME 低、中、高劑量組大鼠分別腹腔注射0.75、1.50、3.00mg/kg 的SME；抑制劑組先按照1.50mg/kg 的SME 溶液給藥，隨后以5mg/kg劑量腹腔注射EX-527[6]；各組注射體積均為2mL。每周稱重1 次，根據(jù)體質(zhì)量調(diào)整藥量，每周注射1 次，注射持續(xù)4 周后進(jìn)行后續(xù)實驗。

2.3 冰凍切片及尼氏染色 每組各取3 只大鼠，對大鼠進(jìn)行麻醉，進(jìn)行心臟灌流。先灌入PBS，待右心耳流出清澈液體后開始灌入300mL 冰浴過的4%多聚甲醛，取大鼠腦投入4%多聚甲醛后4℃過夜，冠狀切成小段，然后在20%、30%蔗糖溶液中梯度脫水。脫水完成后進(jìn)行冠狀面冰凍切片，切片厚度30μm。按照說明書步驟進(jìn)行尼氏染色。經(jīng)過脫水、封片、晾干步驟后，使用切片全景掃描系統(tǒng)獲取染色后的切片圖像（由武漢賽維爾生物科技有限公司提供）。

2.4 免疫組化檢測大鼠腦組織SIRT1 和FoxO1 陽性細(xì)胞比例 取冰凍切片，將切片放入枸櫞酸鈉緩沖液（0.1mmol/L，pH=6.0）中。胎牛血清封閉，加一抗4℃過夜（一抗稀釋比例均為1:500），加二抗37℃孵育1h 后，用DAB 試劑盒顯色，顯色過程中注意控制本底水平。沖洗掉DAB 殘留后用蘇木素再次復(fù)染、組織脫水透明、封片。SIRT1、FoxO1 陽性細(xì)胞計數(shù)：每個對象單個指標(biāo)選4 張切片，單張切片再隨機(jī)選擇5 個不重疊視野（×400）進(jìn)行拍照。

2.5 RT-PCR 檢測大鼠腦組織SIRT1 和FoxO1 mRNA 表達(dá)量 每組各取4 只大鼠，取右側(cè)腦組織剪碎，加入液氮進(jìn)行組織研磨，4℃下分別加入TRIzol、氯仿、異丙醇、無RNA 酶水（0.1%焦碳酸二乙酯溶液）后以8000g 離心力離心10min 制備出總RNA，紫外分光光度計分析RNA 純度和含量合格后，然后置于EP 管中反轉(zhuǎn)錄生成cDNA。取cDNA 作為定量模板，經(jīng)歷熱循環(huán)，擴(kuò)增后收集熒光信號，采用相對量化研究分析數(shù)值，計算方法為2-ΔΔct。所用引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，見表1。

2.6 Western blot 檢測大鼠腦組織SIRT1 和FoxO1蛋白表達(dá) 每組取6 只大鼠用于實驗，將大鼠腦組織剪碎放入PE 管，加入陶瓷研磨珠和預(yù)冷的蛋白提取液放入研磨機(jī)中低溫研磨。研磨后離心取上清液，用考馬斯亮藍(lán)法測總蛋白含量，再調(diào)整蛋白濃度至800μg/mL。等量加入上樣緩沖液煮沸5min。冷卻至室溫后，4℃下保存?zhèn)溆谩Ｃ靠准尤?0μg 蛋白樣品進(jìn)行凝膠電泳，半干后轉(zhuǎn)至醋酸纖維素膜，室溫封閉1h。加入一抗（稀釋比例1:1000），4℃冰箱孵育過夜。加入二抗（1:1000），37℃反應(yīng)2h，ECL 顯色后顯影儀曝光拍照。照片使用ImageJ 15.1 進(jìn)行半定量分析。

表1 RT-PCR 引物序列及產(chǎn)物片段

2.7 統(tǒng)計學(xué)方法 實驗數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析。計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。各組間比較采用單因素方差（One-Way ANOVA）分析，兩兩比較采用SNK q 檢驗法。在免疫組化陽性細(xì)胞比例檢測中，使用3σ 法剔除每個對象20 個觀測值中的異常值后取均值作為該對象的計量值。以P<0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 尼氏染色 假手術(shù)組大鼠腦組織神經(jīng)元形態(tài)良好，尼氏小體染色清晰，膠質(zhì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，神經(jīng)纖維排布緊密；模型組大鼠腦組織神經(jīng)元變形嚴(yán)重，壞死細(xì)胞被全染，細(xì)胞核分布稀疏，外傷部位出現(xiàn)疏松水腫；SME 低劑量組腦組織有少量的血管充血，神經(jīng)元變形壞死情況較模型組有明顯改善，組織形態(tài)較為完整；SME 中、高劑量組大鼠腦組織神經(jīng)元較低劑量組有一定改善，視野中未出現(xiàn)全染的損傷神經(jīng)元；抑制劑組視野中出現(xiàn)個別全染損傷神經(jīng)元，但總體神經(jīng)元形態(tài)與SME 低劑量組差別不大，見插頁圖1。

3.2 免疫組織化學(xué)檢測大鼠腦組織SIRT1 和FoxO1陽性細(xì)胞比例 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織SIRT1 和FoxO1 陽性細(xì)胞比例均顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，抑制劑組大鼠腦組織SIRT1 陽性細(xì)胞比例顯著降低（P<0.05），SME 高劑量組大鼠腦組織SIRT1 和FoxO1 陽性細(xì)胞比例均顯著升高（P<0.05）；與抑制劑組比較，SME 低劑量組大鼠腦組織FoxO1 及中、高劑量組大鼠腦組織SIRT1 和Fox－O1 陽性細(xì)胞比例顯著升高（P<0.05）；與SME 低劑量組比較，SME 高劑量組大鼠腦組織SIRT1 陽性細(xì)胞比例顯著升高（P<0.05）。見表2、插頁圖2-3。

圖1 大鼠右側(cè)端腦冰凍切片結(jié)果（尼氏焦油紫染色，40×，n=3）

圖2 大鼠右側(cè)端腦冰凍切片SIRT1 免疫組化染色結(jié)果（400×，n=3）

圖3 大鼠右側(cè)端腦冰凍切片F(xiàn)oxO1 免疫組化染色結(jié)果（n=3，400×）

3.3 RT-PCR 檢測大鼠腦組織SIRT1 和FoxO1 mRNA 水平變化 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織SIRT1 和FoxO1 mRNA 表達(dá)顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，抑制劑組大鼠腦組織SIRT1mRNA 表達(dá)顯著降低（P<0.05），SME 高劑量組大鼠腦組織SIRT1 和FoxO1 mRNA 表達(dá)顯著升高（P<0.05）；與抑制劑組比較，SME 低、中、高劑量三組大鼠腦組織SIRT1 和FoxO1 mRNA 表達(dá)均升高（P<0.05）；與SME 低劑量組比較，SME 中劑量組大鼠腦組織FoxO1、SME 高劑量組大鼠腦組織SIRT1 和FoxO1 mRNA 表達(dá)顯著升高（P<0.05）；與SME 中劑量組比較，SME 高劑量組大鼠腦組織SIRT1 和Fox－O1 表達(dá)顯著升高（P<0.05）。見表3。

表2 各組大鼠腦組織SIRT1 及FoxO1 染色陽性細(xì)胞比例（%，）

表2 各組大鼠腦組織SIRT1 及FoxO1 染色陽性細(xì)胞比例（%，）

注：假手術(shù)組和模型組予腹腔注射2mL 生理鹽水；SME 低劑量組予腹腔注射0.75mg/kg SME；SME 中劑量組予腹腔注射1.50mg/kg SME；SME 高劑量組予腹腔注射3.00mg/kg SME；抑制劑組予腹腔注射1.50mg/kg SME+5mg/kg SIRT1 抑制劑；SME 為丹參提取物；SIRT1為沉默信息調(diào)節(jié)因子1；FoxO1 為叉頭框蛋白O1；與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與抑制劑組比較，cP＜0.05；與SME 低劑量組比較，dP＜0.05

表3 各組大鼠腦組織SIRT1 及FoxO1 mRNA 表達(dá)水平變化（）

表3 各組大鼠腦組織SIRT1 及FoxO1 mRNA 表達(dá)水平變化（）

注：假手術(shù)組和模型組予腹腔注射2mL 生理鹽水；SME 低劑量組予腹腔注射0.75mg/kg SME；SME 中劑量組予腹腔注射1.50mg/kg SME；SME 高劑量組予腹腔注射3.00mg/kg SME；抑制劑組予腹腔注射1.50mg/kg SME+5mg/kg SIRT1 抑制劑；SME 為丹參提取物；SIRT1為沉默信息調(diào)節(jié)因子1；FoxO1 為叉頭框蛋白O1；與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與抑制劑組比較，cP＜0.05；與SME 低劑量組比較，dP＜0.05；與SME 中劑量組比較，eP＜0.05

3.4 Western blot 檢測大鼠腦組織SIRT1 和FoxO1蛋白水平變化 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織SIRT1 和FoxO1 蛋白表達(dá)量顯著升高（P<0.05）；與模型組比較，抑制劑組大鼠腦組織SIRT1 蛋白表達(dá)量顯著降低（P<0.05），SME 低、中、高劑量三組大鼠腦組織SIRT1 和SME 高劑量組FoxO1 蛋白水平均顯著升高（P<0.05）；與抑制劑組比較，SME 低劑量組大鼠腦組織SIRT1 及SME 中、高劑量兩組SIRT1和FoxO1 蛋白水平都顯著升高（P<0.05）；與SME 低劑量組比較，SME 中、高劑量兩組大鼠腦組織的SIRT1 和SME 高劑量組FoxO1 蛋白水平顯著升高（P<0.05）。見表4、插頁圖4。

圖4 各組大鼠STIR1 及FoxO1 Weston blot 結(jié)果

表4 各組大鼠腦組織STIR1 及FoxO1 蛋白表達(dá)相對強(qiáng)度值比較（）

表4 各組大鼠腦組織STIR1 及FoxO1 蛋白表達(dá)相對強(qiáng)度值比較（）

注：假手術(shù)組和模型組予腹腔注射2mL 生理鹽水；SME 低劑量組予腹腔注射0.75mg/kg SME；SME 中劑量組予腹腔注射1.50mg/kg SME；SME 高劑量組予腹腔注射3.00mg/kg SME；抑制劑組予腹腔注射1.50mg/kg SME+5mg/kg SIRT1 抑制劑；SME 為丹參提取物；SIRT1為沉默信息調(diào)節(jié)因子1；FoxO1 為叉頭框蛋白O1；與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與抑制劑組比較，cP＜0.05；與SME 低劑量組比較，dP＜0.05

4 討論

自噬是細(xì)胞內(nèi)重要的分解代謝過程，是機(jī)體在應(yīng)對不良刺激如外傷、缺血、缺氧等應(yīng)激狀態(tài)下啟動的一種自我保護(hù)機(jī)制，是細(xì)胞清除受損細(xì)胞器的主要途徑。自噬在細(xì)胞中具有維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和結(jié)構(gòu)重塑的重要作用[7]。腦組織受到機(jī)械、缺血、缺氧等損傷時，大量神經(jīng)元的正常自噬，能夠促進(jìn)神經(jīng)元受損后的存活[8]。因此，自噬在各種腦缺血、腦損傷發(fā)生及預(yù)后中具有重要作用。SIRT1 屬于煙酰腺嘌呤二核苷酸依賴的類組蛋白去乙?；?，廣泛存在于各組織細(xì)胞中。FoxO（叉頭轉(zhuǎn)錄因子）是一類關(guān)鍵的調(diào)控因子，參與調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和DNA 修復(fù)[9]。FoxO 還能夠激活細(xì)胞的自噬活性，在分子水平上參與細(xì)胞的增殖分化等過程，其中又以FoxO1、FoxO3 的作用最為廣泛[10]。FoxO1 蛋白活性受乙?；?、磷酸化和泛素化調(diào)節(jié)，其基因的轉(zhuǎn)錄激活也會受到SIRT1 等上游轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的乙?；?去乙?；{(diào)節(jié)。SIRT1 調(diào)節(jié)自噬是一個比較復(fù)雜的過程。目前研究發(fā)現(xiàn)，SIRT1 調(diào)節(jié)自噬的途徑主要有兩種：一是通過去乙酰化自噬相關(guān)基因的表達(dá)產(chǎn)物來直接影響自噬；二是位于細(xì)胞核內(nèi)的SIRT1 通過激活FoxO1 基因誘導(dǎo)自噬[11]。也有研究表示，SIRT1 也能通過調(diào)控線粒體途徑的自噬激活，維持神經(jīng)元功能穩(wěn)定[12]。本實驗結(jié)果顯示，模型組大鼠腦組織形態(tài)和神經(jīng)元損傷程度比假手術(shù)組嚴(yán)重；SIRT1 和FoxO1 陽性細(xì)胞比例、mRNA 和蛋白表達(dá)量均顯著高于假手術(shù)組（P<0.05）。Kou 等[13]研究指出，這種SIRT1 和FoxO1 升高現(xiàn)象可能是造模后大鼠腦外傷部位的缺血和營養(yǎng)剝奪激活了SIRT1-FoxO1-自噬通路，從而調(diào)控神經(jīng)細(xì)胞自噬以保護(hù)神經(jīng)功能。

丹參是臨床常用中藥，用于治療瘀血諸癥、瘡癰腫毒熱病、煩躁神昏以及心悸失眠等。SME 有減輕內(nèi)皮損傷、抗炎、抗血小板聚集、調(diào)節(jié)糖脂代謝的作用[14]。其中丹參水溶性成分有很強(qiáng)的抗脂質(zhì)過氧化和抗自由基能力[15]。而丹參酮IIA 等脂溶性成分則可以通過降低炎性因子水平來降低血壓和改善心臟功能[16]。本實驗結(jié)果顯示，SME 處理組大鼠的腦組織形態(tài)和神經(jīng)元損傷程度都比模型組有顯著改善；SME 中、高劑量兩組大鼠腦組織SIRT1 和FoxO1 的陽性細(xì)胞比例、mRNA 和蛋白表達(dá)量相比模型組都有不同程度升高（P<0.05），并且跟劑量呈正相關(guān)（P<0.05）；可見其促進(jìn)SIRT1 升高的效果同姜黃素和白藜蘆醇的作用效果類似；雖然FoxO1 也可以通過p-AKT/FoxO1等其他通路進(jìn)行調(diào)節(jié)，結(jié)果顯示SIRT1 和FoxO1 隨劑量變化趨勢相同，這說明FoxO1 在大鼠腦組織中的表達(dá)受到SIRT1 的正向調(diào)控[17]。抑制劑組丹參注射液給藥量與SME 中劑量組是相同的，但EX527 能抑制SIRT1 的去乙?；饔谩Ｔ谝种苿┳饔孟乱种苿┙M的SIRT1 的mRNA 和蛋白水平顯著低于模型組或SME 中劑量組（P<0.05），但FoxO1 的mRNA 和蛋白水平卻與模型組和SME 中劑量組無顯著差異（P＞0.05）。據(jù)此推測SME 不僅能夠促進(jìn)SIRT1 的表達(dá)量升高，還能夠增強(qiáng)SIRT1 的去乙?；钚?，從而使FoxO1 在mRNA 和蛋白表達(dá)量升高。在氧化應(yīng)激、炎癥反應(yīng)等病理情況下，組織細(xì)胞常出現(xiàn)自噬活動的過度激活，而過度的自噬會引起細(xì)胞無法存活[18]。神經(jīng)元自噬的發(fā)生與尼氏小體有關(guān)，在尼氏染色結(jié)果中我們還注意到，處理組切片的神經(jīng)元尼氏小體的密度整體好于模型組[19]。這說明SME 能夠有效保護(hù)處理組的神經(jīng)元形態(tài)，使其不過度自噬。

綜上所述，丹參注射液后處理能夠促進(jìn)腦外傷大鼠SIRT1 表達(dá)，增強(qiáng)SIRT1 的去乙?；钚?，正向調(diào)節(jié)SIRT1-FoxO1-自噬通路發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。