奶牛性別鑒定的研究與應用

侯勝奎，陶晨雨，胡慧艷，劉 津，張 婧，賈 青,2,3*

(1.河北農業(yè)大學 動物科技學院，河北 保定 071000；2.國家北方山區(qū)農業(yè)工程技術研究中心，河北 保定 071000；3.河北省山區(qū)農業(yè)工程技術研究中心，河北 保定 071000)

20世紀90年代初，SRY基因被Sinclair等[1]首次在哺乳動物性腺中發(fā)現，研究者發(fā)現SRY基因位于性染色體Y短臂擬常染色質區(qū)，為單一外顯子，長度為850 bp,為一性別決定基因。Koopman等[2]將含有SRY基因的DNA片段(14 kb)移植給XX染色體的雌鼠體內,在11只轉基因XX小鼠中，有3只成功實現性反轉成為雄性,通過這個試驗揭示了動物性控的奧秘。目前,有關研究人員利用SRY基因對哺乳動物(豬、袋鼠、猩猩、貓、狒狒、馬、羊、駱駝、犬、牛等)做了大量的性別鑒定試驗[3-6],檢測結果表明雄性動物全為陽性，雌性動物全為陰性，性別差異非常明了。因此，SRY基因已經成為性別鑒定及選擇等方面應用較成熟的基因。

本試驗的目的是對公牛性染色體特異基因設計引物，進行公、母牛的性別鑒定。試驗選擇雄性性別決定基因SRY，對其設計引物,對引物的靈敏度進行了檢測；并對公、母各20頭荷斯坦奶牛群體進行了DNA樣品盲檢。通過對所設計引物靈敏度的檢測，判斷是否能夠滿足性別鑒定的需要，為后續(xù)的胚胎性別鑒定做準備。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用中國黑白花奶牛血液樣品由徐水縣漕河鎮(zhèn)某奶牛專業(yè)合作社提供。

1.2 主要試劑

牛血液DNA提取試劑盒、2×Es Taq MasterMix(Dye)、ddH2O、染料(GelStain)、瓊脂糖(Agarose)、100 bp DNA Ladder,均購自北京全式金生物技術有限公司。特異引物由北京六合華大基因科技股份有限公司合成

1.3 DNA的提取

取300 μL加有抗凝劑的牛血液樣品，在樣品中加入10 μL RNase A去除樣品中的RNA，加入20 μL 蛋白酶K，500 μL Binding Buffer 3 (BB3)于樣品中，渦旋30秒充分把樣品混勻，把混勻的樣品封口放入水浴鍋中55 ℃過夜消化，把消化完全的樣品經過短暫離心，然后把全部溶液加入到離心柱中，12 000×g離心60秒，倒掉過柱的液體。加入500 μL CB3溶液(已加入無水乙醇)，離心機12 000 ×g離心30秒，棄出液體。然后加入500 μL WB3溶液(已加入無水乙醇)，12 000 ×g離心30秒，棄出液體(此步驟重復2次)。12 000 ×g離心120秒，把殘留的WB3溶液徹底去除。把離心柱放入一個干凈的1.5 mL的離心管中，加入100 μL預熱的EB(提前60 ℃水浴鍋預熱)，室溫靜置120秒，10 000 ×g離心120秒，洗脫DNA(為得到高濃度的DNA可多次過柱)，收集到的DNA于-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 引物的設計

從GenBank檢索到牛SRY基因序列(AF148462)，采用Primer 5.0進行了引物設計，經過反復篩選確定了一對引物如下：上有引物F:5′-CCACGTCAAGCGACCCAT-3′下游引物R: 5′-AGAGCCACCTTTCGTCTTCG-3′ 退火溫度為60 ℃，預期擴增片段大小為66 bp。

1.5 PCR體系的建立

體系(25 μL):PCR反應優(yōu)化程序：預變性94 ℃，5 min；循環(huán)94 ℃，30 s；66 ℃,5 s；72 ℃，30 s；32個循環(huán)；延伸72 ℃，4 ℃保存(表1)。

1.6 PCR體系的應用

1.6.1SRY基因的PCR擴增 采用優(yōu)化后的PCR反應體系對已提取的公牛DNA模板、母牛DNA模板進行PCR擴增，同時，設置陰性對照。利用1.5% 的瓊脂糖凝膠對PCR產物電泳30 min進行檢測。

1.6.2 引物靈敏度檢測 用不同濃度的雄性DNA檢測引物的靈敏度，把提取的公牛DNA模板分別稀釋為125 ng/μL、25 ng/μL、5 ng/μL、1 ng/μL、0.2 ng/μL、40 pg/μL、8 pg/μL、1.6 pg/μL、0.32 pg/μL，當DNA模板濃度分別為125 ng/μL、25 ng/μL、5 ng/μL電泳條帶的亮度幾乎沒有差異，經過篩選，選擇1 ng/μL、0.2 ng/μL、40 pg/μL、8 pg/μL、1.6 pg/μL、0.32 pg/μL，使用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物電泳30 min進行檢測。

1.6.3 隨機性別盲檢 取公、母牛各20 頭已提取DNA的血液樣本，覆蓋樣品標記的公、母編號，采用SRY基因設計的特異性引物對40 個樣本DNA進行PCR盲檢，判定公、母牛性別的準確性。

2 結果與分析

2.1 牛SRY基因PCR瓊脂糖電泳結果

分別取4 頭公牛、1 頭母牛DNA樣本進行PCR，設置一個陰性對照，對PCR產物進行1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1)，1～4泳道為公牛DNA樣本，目標帶大小66 bp，電泳檢測有帶，證明為雄性；5泳道為母牛DNA樣本，電泳檢測證為雌性；6泳道為陰性對照，電泳結果無帶，證明樣品沒有受到污染。

2.2 引物靈敏度檢測

對公牛已經提取的DNA模板進行稀釋，檢測引物的靈敏度。1～6泳道稀釋濃度分別為1 ng/μL、0.2 ng/μL、40 pg/μL、8 pg/μL、1.6 pg/μL、0.32 pg/μL，按照已經優(yōu)化的PCR體系條件對引物靈敏度進行檢測，結果顯示濃度為0.32 pg/μL時電泳結果沒有條帶，引物最終靈敏度為1.6 pg/μL。

2.3 隨機性別盲檢結果

對已經提取DNA的公、母牛各20 頭進行PCR產物瓊脂糖凝膠電泳盲檢，覆蓋其標記的公、母編號，對瓊脂糖凝膠泳道進行編號(圖3)，電泳結果表明2,4,5,9,11,14,17,19,21,22,25,27,29,30,33,34,35,37,39,40泳道為公牛DNA模板；1,3,6,7,8,10,12,13,15,16,18,20,23,24,26,28,31,32,36,38泳道為母牛DNA模板；發(fā)現公、母各占20 頭，完全和檢測前采樣標記的公、母編號對的上，檢測準確率100%。

3 討 論

3.1 選擇SRY基因作為特異基因的目的

SRY基因作為雄性特異基因，特異性比較強，宋淑珍[7]用綿羊SRY基因設計的特異引物對綿羊的性別進行了鑒定，鑒定結果非常準確。本試驗通過牛SRY基因設計的一對特異引物，利用PCR技術對奶牛的性別成功進行了鑒定，并進行了樣品的盲檢，性別鑒定準確度達100%，與上述對綿羊性別鑒定的實驗結果一致。另外本試驗還進行了引物靈敏度檢測，結果顯示引物靈敏度達1.6 pg/μL，比張偉等[8]在多重PCR擴增體系中的50 pg/μL和巢式PCR靈敏度5 pg/μL靈敏度都要靈敏。證明了本試驗采用牛SRY特異基因設計引物和方法的有效可行。SRY基因作為Y染色體特異基因有著較強的特異性，是常用的性別鑒定基因，穩(wěn)定性和準確性都比較高。但由于該基因為單拷貝，模板量低時很難達到較高的靈敏度[9]。

3.2 PCR擴增技術的用途

PCR擴增技術是一種用于放大擴增特定DNA片段的分子生物學技術，它可以把生物體外的特殊DNA進行復制。PCR技術在性別鑒定上的原理是找到一個雄性特異基因，對其設計特異引物，利用PCR對其進行擴增，然后進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，有擴增條帶的為雄性，未有擴增條帶的為雌性。PCR技術在性別鑒定上的應用，極大地提高了性別鑒定的準確性，與其他性別鑒定方法相比較，縮短了鑒定時間，降低了試驗成本是一種常規(guī)實驗室能夠承擔得起的技術[10]。由于PCR擴增技術極為靈敏，并且各種動物Y基因序列同源性很高，很容易受到外源DNA的污染，從而導致假陽性結果的出現[11]。本試驗也采用PCR擴增技術擴增目的DNA樣本和目的條帶，對奶牛的性別進行鑒定分析。

3.3 性別鑒定在奶牛生產上的應用

性別鑒定不但能夠幫助人類減少性遺傳疾病的發(fā)生，而且可以挽救瀕臨滅亡的珍惜動物[12]。更重要的是可以使乳用動物多產母畜，肉用動物多產公畜，從而滿足人們的需求[13]。性別鑒定可以提高奶牛性別鑒定的準確性， 從而為奶牛胚胎性別的鑒定提供技術支持，以期增加母奶牛的數量，進而增加奶牛數量和產奶量。如果性別鑒定能成熟應用于奶牛場，會在一定程度上提高牛場的規(guī)模和經濟效益。相信隨著科學的發(fā)展，奶牛早期胚胎鑒定的時間會縮短，鑒定的準確性和特異性會增高。席繼鋒等[14]進行特異性巢式PCR擴增SRY基因以鑒定奶牛早期胚胎的性別，結果表明這種方法的鑒定準確性較高。本試驗利用PCR擴增技術能夠找到滿足性別鑒定需要的引物，提高胚胎鑒定的準確性，與前人的研究結論一致。

4 結 論

本研究設計的牛雄性特異基因SRY引物符合試驗預期并且能夠很好的滿足性別鑒定的需要；用該引物進行奶牛性別鑒定的準確度為100%。